В статье описывается методика производства бесклеточной матрицы от крыс кишечника. Вывод кишечных лесов имеет важное значение для будущих применений в тканевой инженерии, клеточной биологии и тестирования на наркотики стволовых.
Успешное тканевая инженерия включает в себя комбинацию лесов с соответствующими клеток в пробирке или в естественных условиях. Строительные леса могут быть синтетическими, естественно, полученных или получен из тканей / органов. Последние получаются с помощью метода, называемого decellularization. Decellularization может включать сочетание физических, химических, и ферментативных методов. Цель этого метода заключается в удалении всех сотовых следы при сохранении макро-и микро-архитектуру исходной ткани.
Кишечные тканевой инженерии до сих пор используется относительно простые строительные леса, которые не воспроизводят сложную архитектуру родного органа. В центре внимания этой работы является описание эффективную технику decellularization для тонкой кишки крыс. Выделение тонкого кишечника с тем, чтобы обеспечить поддержание сосудистого связи описывается. Сочетание химических и ферментативных решений для удаления клеток Whilул сохранения ворсинок-склеп ось в просвете аспекте эшафот также изложены. Наконец, оценка произведенных лесов для соответствующих характеристик обсуждается.
Тканевая инженерия (TE) обеспечивает терапевтический альтернативу трансплантации органов, минуя вопросы иммуносупрессии и нехватки органов. TE недавно была успешного применения в клинике, с заменой органах, таких как мочевой пузырь 1, 2 уретры и трахеи, как у взрослых и детей 3,4 5.
Построение тканевой инженерии орган требует сочетания эшафот с соответствующими клетками. Подмости могут быть получены с использованием естественно, производный (например, коллагена) и синтетические (например, поли-L-гликолевая кислота; PLGA) материалов, или быть получены путем decellularization нативных органов и тканей. Леса, которые были использованы до сих пор для кишечного TE были в основном либо decellularized (тонкого кишечника подслизистой) или синтетические (поли-L-гликолевой кислоты и поли-молочная кислота) 6-13. Эти биоматериалы очень просты как в макро-и микро-архитектуры, котораяне может быть идеальным, если тканевой инженерии кишка должна быть клинически переведены. Оптимальный биоматериал для кишечника должны иметь врожденную сосудистую дерево, которое можно подключить к кровоснабжения хозяина, многоуровневой трубчатой стенки с разными свойствами, чтобы отразить слои кишечной стенки и ворсинок-склеп оси на стороны просвета, чтобы помочь с репопуляция эпителиальными стволовыми клетками.
Decellularization является новым методология, которая производит строительные леса, удаляя клетки от целых органов при сохранении их оригинальной архитектурой 14. Это является предпочтительным, чтобы уже существующих строительных лесов, поскольку они не только копировать структуру органа, но и содержат химические сигналы, встроенные в внеклеточного матрикса (ECM), которые помогают клеточной пролиферации и дифференцировки. В 2008 трупный трахею decellularized 14, затравку собственных клеток пациента, и пересадить заменить основные левого бронха в молодого человека <sup> 3. С тех пор число групп сообщали производство decellularized лесов для сердца, печени 15 16,17 и легких 18-20 в малых и больших животных.
Мы также адаптировать ту же методологию, чтобы произвести небольшой кишечной decellularized эшафот 21. Целью описанного здесь способа является получение decellularized кишечных матрицы, которые поддерживают макроскопические характеристики исходной ткани, такой как кровоснабжения, а также микроскопического архитектуры ворсинок-Crypt оси в просвет кишечника. Мы считаем, эта методология может в конечном итоге быть принят для других органов, чтобы повысить эффективность decellularization.
Самые трудные шаги в создании этого эксперимента предполагают катетеризации SMA и установление и поддержание стерильности. Cannulating на SMA у грызунов без разрушения стены может быть довольно трудно из-за размера и положения судна. Кроме того, шов может быть помещен вокруг проксимальной аорты до начала SMA происхождения, а затем катетеризации аорты непосредственно дистально, направляя пластиковую канюлю в SMA. Во decellularization сочетание плохого размещения канюли и высоких скоростях потока может привести к потере сосудистого доступа. Стерильность является серьезной проблемой из-за количества бактериальной флоры, присутствующих в тонком кишечнике. Промывка PBS / AA следующее урожая очень важна, и любой признак фекалий или мусора должны быть удалены из просвета. Размещение часть строительных лесов в трубки сокола с DMEM в инкубаторе следующее УФ стерилизации должны быть индикатором если стерильность была достигнута. В случаебактериальной колонизации, СМИ изменится рН с его цвет поворота от красного до желтого. Чтобы справиться с этим, рекомендуется дальнейшие циклы УФ а также промывки ФБР, содержащим высокую концентрацию антибиотика / противогрибкового средства.
Возможная модификация, чтобы получить каркас с обоих сосудов и венозного доступа будет иглу нижней полой вены (НПВ), а также SMA. Decellularization от венозных и сосудистых сторон должно быть предпринято с перерывами в течение всех трех решений. Непрерывная decellularization может лопнуть капилляры, имея положительное давление на обе стороны.
За эти годы был проведен ряд усилий в кишечной TE с использованием различных комбинаций клеток эшафот в пробирке и в естественных 6,9,12. Большинство работ было выполнено с помощью трубчатых нетканый 95% PGA-5% PLGA строительных лесов, покрытые коллагена типа I 6,7,13,22. После посева с кишечнымиэпителиальные органоидные единиц (OU) и период имплантации в сальнике мышей, они образуют цисты с мышц на внешней стороне и эпителия на внутренней которые затем могут быть tubularized. Однако пористость и простота в конструкции этих каркасов не позволяет для генерирования больших кусков искусственного кишечника в среде в пробирке как, например, из биореактора. Кроме того, отсутствие врожденной сосудистой сети, которые могут быть подключены к получателю дополнительно ограничивает использование этого каркаса для клинического перевода. Кроме экспериментов с лесов PGA-PLGA, другие группы использовали коллаген или SIS строительных лесов, оба из которых не воспроизводят сложность кишечного тракта. SIS в частности является единственным предыдущая опубликована методология кишечной тканевой инженерии и была использована в более чем 150 медицинских учреждениях, демонстрируя способность decellularized лесов, чтобы обеспечить механическую стабильность и способствовать росту клеток в то время как ведущийING ни к какому иммуногенной реакции. Тем не менее, отсутствие надлежащей макро-и микро-архитектуры, привело к плохим результатам в своей «использования для кишечных целей ТЕ 9-11,23.
Преимущества методологии decellularization мы описанные включают сохранение микроскопических характеристик, таких как люминальной архитектуры склеп-ворсинок, которые представляют соответствующую среду для репопуляции кишечным нише стволовых клеток. В макроскопическом аспекте наличие иерархической сосудистой сети позволит приложение к получателю, позволяя предоставление питательных веществ и кислорода ко всем слое TE-кишечнике 21. Более того, содержание ECM компонентов, таких как коллаген, эластин и glyocosaminoglycans играет важную роль не только для механических характеристик, но и направляющий клеточную пролиферацию и дифференцировку. Самое главное, способность методологии decellularization быть расширены в большойг ткани при сохранении же характеристики, является важной особенностью для клинического перевода ТЕ.
Развитие природного кишечного матрицы с сосудистой сети позволяет создавать более крупных сегментов искусственного кишечника, что может быть подключен к хосту.
The authors have nothing to disclose.
Авторы благодарят Wake Forest Институт регенеративной медицины за помощь с развитием этого протокола. Мы признаем поддержку за счет субсидий из благотворительности Великий больницы Ормонд-стрит, Фонд Эухенио Литта (Женева, Швейцария), Совет по медицинским исследованиям, Королевский колледж хирургов Англии, искры Детского медицинского милосердия, МИД Великобритании для Великобритании / США стволовых клеток премию сотрудничества и научно-исследовательский фонд Mittal. Мы также хотели бы поблагодарить Королевское общество / Wolfson Foundation для тканевой инженерии лаборатория реконструкции гранта, полученного для детской хирургии отдела в Институте детского здоровья. PDC и SE поддерживаются Great Ormond Street детской больнице Милосердия.
Name of Material | Company | Catalog Number | Comments |
Ethanol solution, 70% in H20 | Sigma | 02877 | |
Phosphate buffered saline tablets | Sigma | 79382 | |
Antibiotic Antimycotic Solution (100x) | Sigma | A5955 | |
Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | Oral and eye irritant; use protection |
Sodium chloride | |||
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | D5025 |