Summary
Het artikel beschrijft een methode voor de productie van een acellulair matrix rat darm. De afleiding van intestinale steigers is belangrijk voor toekomstige toepassingen in tissue engineering, stamcel biologie en drugstesten.
Abstract
Succesvolle tissue engineering van de combinatie van steigers met geschikte cellen in vitro of in vivo. Steigers mogen synthetische, natuurlijke weg verkregen of afkomstig van weefsels / organen zijn. Deze zijn verkregen met gebruikmaking van een techniek genaamd ontcelling. Decellularisatie kan een combinatie van fysische, chemische en enzymatische methoden omvatten. Het doel van deze techniek is om cellulaire resten behoud van de macro-en micro-architectuur van het oorspronkelijke weefsel te verwijderen.
Darmweefsel techniek heeft tot nu toe gebruikt relatief eenvoudige steigers die niet de complexe architectuur van de inheemse orgel niet repliceren. De focus van deze paper is om een efficiënte decellularisatie techniek voor rat dunne darm te beschrijven. De isolatie van de dunne darm om de instandhouding van een vasculair verbinding te verzekeren wordt beschreven. De combinatie van chemische en enzymatische oplossingen om de cellen te verwijderen whilst behoud van de villus-crypte as in de luminale aspect van de steiger wordt ook uiteengezet. Ten slotte wordt de beoordeling van geproduceerd steigers voor passende kenmerken besproken.
Introduction
Tissue engineering (TE) biedt een therapeutisch alternatief voor orgaantransplantatie, het omzeilen van problemen van immunosuppressie en tekort aan organen. TE heeft onlangs succesvolle toepassingen in de kliniek, met vervanging van organen zoals de blaas 1, urethra 2 luchtpijp, zowel bij volwassenen en kinderen 3,4 5.
Het bouwen van een weefselmanipulatie orgaan vereist de combinatie van een steiger met de geschikte cellen. Een steiger kan worden bereid met behulp van natuurlijke afgeleide (bijvoorbeeld collageen) en synthetische (bijvoorbeeld poly-L-glycolzuur, PLGA) materialen, of worden verkregen door de cellen ontdoen van natief organen en weefsels. Stellingen die tot nu toe zijn gebruikt voor intestinale TE zijn voornamelijk ofwel cellen ontdane (dunne darm submucosa) of synthetische (poly-L-glycolzuur en poly-melkzuur) 6-13. Deze biomaterialen zijn zeer eenvoudig in zowel macro-als micro-architectuur, diemisschien niet ideaal als tissue-engineered darm is te klinisch worden vertaald. Een optimale biomateriaal voor de darm moet een aangeboren vasculaire boom die kan worden aangesloten bloedtoevoer van de gastheer, een gelaagde buisvormige wand met verschillende eigenschappen om de lagen van de darmwand weerspiegelen en villus-crypte as aan de luminale zijde steun met zijn herbevolking door epitheliale stamcellen.
Decellularisatie is een nieuwe methodologie die steigers produceert door het verwijderen van cellen uit hele organen met behoud van de oorspronkelijke architectuur 14. Dit de voorkeur bestaande steigers omdat zij niet alleen repliceren de structuur van het orgaan, maar bevatten ook chemische signalen ingebed in de extracellulaire matrix (ECM) dat steun cellulaire proliferatie en differentiatie. In 2008 werd een cadaveric luchtpijp ontceld 14, bezaaid met de eigen cellen van de patiënt, en getransplanteerd naar de belangrijkste links bronchus vervangen in een jonge man
We hebben ook aangepast dezelfde methode om een dunne darm gedecellulariseerde steiger 21 te produceren. Het doel van de hierin beschreven werkwijze is intestinale cellen ontdane matrices die de macroscopische eigenschappen van het oorspronkelijke weefsel zoals de bloedtoevoer, en de microscopische structuur van het villus crypt-as in de darmlumen handhaven produceren. Wij geloven dat deze methode kan uiteindelijk voor andere organen worden genomen om de efficiëntie van decellularisatie verbeteren.
Protocol
1. Isolatie van Rat Darm
- Bereid een 1 L oplossing van fosfaat gebufferde zoutoplossing (Sigma, UK) met 1% antibiotica / antimycotica (Sigma, UK) (PBS / AA). Breng de peristaltische pomp (Masterflex L / S variabele snelheid) met twee buizen. Voer 70% ethanol (EtOH) door de buizen van de peristaltische pomp gedurende 15 minuten bij maximale snelheid, gevolgd door PBS / AA nog 15 minuten.
- Euthanaseren volwassen Sprague-Dawley ratten met een gewicht ongeveer 250-350 g Door CO 2 inademing en cervicale dislocatie in overeenstemming met de lokale dierlijke richtlijnen en goedkeuringen (in het Verenigd Koninkrijk, Home Office richtlijnen onder de dieren (Wetenschappelijke Procedures) Act 1986).
- Autoclaaf de chirurgische instrumenten worden gegeven. Spray en veeg de buik van het dier met behulp van 70% EtOH.
- Voer een xifo-schaamhaar laparotomische insnijding op de buik om een duidelijke chirurgische veld te waarborgen.
- Eviscerate de dunne darm aan de rechterzijde van het dier op een papieren handdoek besproeid met 70% EtOH. Take zorg continu nat de darm met PBS / AA teneinde uitdroging van het weefsel en denaturatie van de extracellulaire matrix (ECM) voorkomen.
- Zoek de a. mesenterica superior (SMA) afkomstig uit een hoek van 90 ° van de aorta naar de darm. Gebruik een 27 G canule aan de SMA komen vanuit de aorta en snel terugtrekken van de naald te voorkomen dat het scheurt de wand van het vat. Vooraf de plastic buis van de canule in de SMA en veilig gebruik van hechtingen (Vicryl 5/0).
- Bevestig canule door het injecteren van 1 ml PBS / AA. Gebruik veer schaar om de aorta proximaal en distaal van de SMA incisie om de canule vrij.
- Om lekkage van ontlasting vermijden wanneer ontleden van de dikke darm, plaats een (zijde 5/0) hechtdraad knoop op het proximale uiteinde van de ileocaecale knooppunt en een aan het distale einde van de dikke darm. Snij vervolgens het terminale ileum en colon tussen de twee knopen en verwijder de dikke darm.
- Snijd de darm bij de jejuno-duodenale junctie eenND de darm van alle bindweefsel verbindingen zou kunnen hebben met de buik.
- Breng de dunne darm in een petrischaal met PBS / AA. Canule het proximale deel van de darm met een plastic Pasteur pipet (LSL Laboratorium verbruiksartikelen) en zet deze vast met hechtingen. Snijd de pipet zodat het past de Luer-Lok van een spuit 60 ml (BD Plastipak). Spoel de darmlumen 2x met 60 ml PBS / AA naar uitwerpselen en vuil te verwijderen.
2. Decellularisatie Methodologie
- Sluit de vasculaire canule een driewegkraan. Dit zal verlichten handling, het minimaliseren van spanning op de vasculaire boom en laat het verwijderen van luchtbellen uit de slang.
- Begint te lopen gedemineraliseerd water (weerstand 18.2 MQ / cm) door de Masterflex L / S variabele snelheid rollerpomp op 0,6 ml / uur. Controleer of er geen luchtbellen aanwezig zijn binnen buis voorafgaand aan het verbinden met het darmlumen kraan zijn. Wat belletjes aanwezig in het lumen van stap1.9, die kan het van cellen ontdoen proces beïnvloeden. Varieert de snelheid van de pomp en behandelen van het weefsel met pincet voorzichtig naar de uitgang luchtbellen zorgt vanaf het distale uiteinde. Laat de vasculaire canule niet aan totdat dit proces is voltooid, aangezien hoge snelheden de vasculaire boom kan beschadigen.
- Overdrachtsinrichting naar de koude ruimte, aangezien de volgende stap van ontcelling wordt uitgevoerd bij 4 ° C. De lage temperatuur maakt het verwijderen van cellen, terwijl het minimaliseren van weefsel afbraak. Plaats de petrischaal in een container die de overvloeiende oplossing zal verzamelen. Perfuseren zowel het darmlumen en de vasculaire boom met gedeïoniseerd water (resistiviteit 18,2 MQ / cm) gedurende 24 uur bij 0,6 ml / uur. Voor het eerste uur controleren het apparaat regelmatig of alles goed is aangesloten, lekkage minimaal is en geen luchtbellen aanwezig zijn in de darm zijn.
- Na 24 uur behandeling met gedemineraliseerd water, bewegen decellularisatie apparaten buiten de koelruimte als de rest van de stappen zijnin kamertemperatuur (RT) uitgevoerd.
- Weeg natriumdeoxycholaat (Sigma, UK) te bereiden 300 ml van een oplossing 4% in gedeïoniseerd water. Weeg natriumdesoxycholaat onder een afzuigkap, want het is een orale en irriterend voor de ogen. Meng met behulp van een vortex tot de oplossing helder is. De oplossing kan worden gehandhaafd op 4 ° C gedurende 1 maand.
- Verander de gedeïoniseerd oplossing voor natriumdesoxycholaat, controleer dan de aansluitingen, verwijder eventuele luchtbellen en perfuse op 0,6 ml / uur gedurende 4 uur.
- Na de natriumdeoxycholaat stap wassen met PBS / AA gedurende 30 minuten om de interactie tussen de natriumdeoxycholaat en DNase-I voorkomen.
- Weeg deoxyribonuclease-I (DNase-I, Sigma) en voor te bereiden 250 ml van een 2000 kU oplossing in 1 M natriumchloride, pH 7,4. Meng met behulp van een vortex tot de oplossing helder is. Deze oplossing moet direct vóór gebruik voorbereid en kan niet worden opgeslagen.
- Perfuseren met DNase-I gedurende 3 uur bij kamertemperatuur met een snelheid van 0,6 ml / uur.
- Na de DNase-I stap, de overdracht van desteiger in een weefselkweek kap en platen en instrumenten veranderen. Er wordt voorgesteld om een aseptische techniek te gebruiken.
- Wassen met PBS / AA gedurende 30 minuten zodat alle restanten van de decellularisatie oplossingen worden verwijderd. Plaats de steiger in een nieuwe petrischaal en over te dragen aan een UV Crosslinker (Spectroline, VS). Lopen twee sterilisatiecycli. Opslaan in 5% PBS / AA en de oplossing te veranderen om de 3 dagen.
Representative Results
Na succesvolle decellularisatie (figuur 1), dient de steiger macroscopische uiterlijk vergelijkbaar met die van de natieve darm, maar met doorzichtige wanden (Figuur 2A). Het behoud van macro-architectuur moet ook duidelijk zijn door de doorgankelijkheid van de vasculaire boom. Als kleurstof wordt geïnjecteerd door de SMA canule moet verdelen gedurende de steiger en de capillaire structuur (figuur 2B) te bereiken. De steiger moet vrij van nucleaire en cytoplasmatische materiaal, iets dat kan worden beoordeeld met behulp van een DNA-kwantificering kit en eenvoudige histologische analyse. Hematoxyline en eosinekleuring (H & E) moet een afwezigheid van nucleaire en cytoplasmatische materiaal tonen met behoud van de dunne darm lagen (figuur 3A). Met name moet de handhaving van de villi en crypten aan de luminale kant blijken volgende scanning elektronenmicroscoop (Figuur 4). Eenbehoud van extracellulaire matrixcomponenten zoals collageen, elastine en glycosaminoglycanen moeten worden verwacht. Bijvoorbeeld, Masson trichroomkleuring weergeven intact bindweefsel in de steiger (Figuur 3B).
Figuur 1. . Proefopzet Tijdlijn van decellularisatie procedure; PBS / AA: fosfaat gebufferde zoutoplossing met antibiotica-antimycotica, NaDeoxy: Natriumdeoxycholaat, RT: kamertemperatuur, DNAse-I: deoxyribonuclease-I. Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 2. Steiger macroscopic kenmerken. Macroscopische verschijning van de dunne darm van ratten na succesvolle ontcelling (A). Injectie van Rosso ponceau kleurstof door de SMA toont een intacte vasculaire netwerk (B); SMA: a. mesenterica superior Klik hier voor grotere afbeelding .
Figuur 3. . Histologie H & E (A) en MT (B) vlekken geven een afwezigheid van cellulair materiaal met behoud van het bindweefsel architectuur, H & E: hematoxyline en eosine, MT: Masson trichroomkleuring. Schaalbalk:. 100 pm Klik hier voor grotere afbeelding . 
Figuur 4. . Electron Microscopy Scanning elektronenmicroscopie geeft de bewaarde villus-crypt architectuur in het schavot lumen; Schaalbalk:. 100 pm Klik hier voor grotere afbeelding .
Discussion
De moeilijkste stappen in het opzetten van dit experiment betrekken de infusen van de SMA en de oprichting en het onderhoud van de steriliteit. Cannulating de SMA bij knaagdieren zonder open te barsten de muur kan heel moeilijk zijn te wijten aan de grootte en de positie van het schip. Alternatief kan een hechting worden geplaatst rond het proximale aorta vóór de SMA oorsprong, gevolgd door een canule van de aorta zelf distaal leiding de plastic canule in de SMA. Tijdens decellularisatie een combinatie van slechte canule plaatsing en hoge stroomsnelheden kan resulteren in het verliezen van de vasculaire toegang. Steriliteit is een groot probleem vanwege de hoeveelheid bacteriële flora in de dunne darm. Wassen met PBS / AA volgende oogst is zeer belangrijk, en elk teken van fecale materie of vuil moet uit het lumen verwijderd. Het plaatsen van een deel van de steiger een falcon-buis met DMEM in de incubator volgende UV sterilisatie zou een indicator zijn als steriliteit is bereikt. Bijvan bacteriële kolonisatie, de media de pH veranderen met de kleur draaien van rood naar geel. Om dit, verder UV cycli goed aan het wassen met PBS dat een hoge concentratie van antibiotische / antimycotische.
Een mogelijke wijziging van een steiger met zowel vasculaire en veneuze toegang zou kunnen verkrijgen tot de onderste vena cava (IVC) en de SMA canule. Cellen ontdoen van de veneuze en vasculaire zijden moeten intermitterend uitgevoerd gedurende drie oplossingen. Continue decellularisatie kan de haarvaten barsten doordat positieve druk aan beide zijden.
Door de jaren heen een aantal inspanningen darm TE met andere cel-steiger combinaties in vitro en in vivo 6,9,12 zijn. Het meeste werk werd uitgevoerd gebruikmakend van buisvormige geweven 95% PGA-5% PLGA steigers bekleed met collageen type I 6,7,13,22. Na enten met intestinaleepitheliale organoïde eenheden (OU) en gedurende implantatie in het omentum van muizen, vormen ze cysten met spier aan de buitenkant en aan de binnenkant epitheel die vervolgens kunnen worden tubularized. Echter, de porositeit en eenvoud in het ontwerp van deze scaffolds niet toe voor het genereren van grote stukken kunstmatige darm in een in vitro omgeving zoals een bioreactor. Bovendien, het ontbreken van een aangeboren vasculaire netwerk dat verder kan worden aangesloten op de ontvanger beperkt het gebruik van deze matrix voor klinische toepassing. Naast de experimenten met de PGA-PLGA steigers, hebben andere groepen collageen of SIS steigers, die beide niet de complexiteit van het darmkanaal repliceren gebruikt. SIS in het bijzonder is de enige eerdere gepubliceerde methodologie van darmweefsel engineering en is gebruikt in meer dan 150 medische instellingen, op het aantonen dat gedecellulariseerde steigers mechanische stabiliteit en de celgroei te bevorderen, terwijl looding geen immunogene respons. Echter, het ontbreken van passende macro-en micro-architectuur, heeft geleid tot slechte resultaten in haar 'gebruik voor intestinale TE doeleinden 9-11,23.
De voordelen van de decellularisatie methodiek die we hebben beschreven omvatten het behoud van microscopische kenmerken, zoals de luminale crypte-villus architectuur die een passende omgeving voor de herbevolking vertegenwoordigen door de intestinale stamcellen. In Macroscopisch gezien is de aanwezigheid van een hiërarchische vasculaire netwerk bevestiging aan de ontvanger te schakelen en levering van voedingsstoffen en zuurstof naar alle lagen van de TE-darm 21. Bovendien, het onderhoud van ECM componenten zoals collageen, elastine en glyocosaminoglycans een belangrijke rol niet alleen mechanische eigenschappen maar ook de leiding cellulaire proliferatie en differentiatie. Het belangrijkste is de mogelijkheid van de ontcellen methode worden opgeschaald tot groter weefsels behoud van dezelfde kenmerken is een belangrijke eigenschap voor klinische vertaling van TE.
De ontwikkeling van een natuurlijke darm matrix met een vasculair netwerk maakt het mogelijk grotere segmenten kunstmatige darm die kunnen worden verbonden met de host.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De auteurs danken de Wake Forest Institute of Regeneratieve Geneeskunde voor hun hulp bij de ontwikkeling van dit protocol. Wij erkennen ondersteuning door subsidies van het Great Ormond Street Hospital liefdadigheid, de Stichting Eugenio Litta (Genève, Zwitserland), de Medical Research Council, de Royal College of Surgeons of England, de Sparks Children's Medical Charity, het Britse ministerie van Buitenlandse Zaken voor de UK / VS Stem Cell Collaboration Award en het Fonds Mittal Research. We willen ook graag aan de Royal Society / Wolfson Foundation bedanken voor de tissue engineering laboratorium renovatie subsidie verkregen voor de Pediatrische Chirurgie afdeling in het Institute of Child Health. PDC en SE worden ondersteund door het Great Ormond Street Hospital Children's Charity.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol solution, 70% in H20 | Sigma | 02877 | |
| Phosphate buffered saline tablets | Sigma | 79382 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x) | Sigma | A5955 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | Oral and eye irritant; use protection |
| Sodium chloride | |||
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | D5025 |
References
- Atala, A., Bauer, S. B., Soker, S., Yoo, J. J., Retik, A. B. Tissue-engineered autologous bladders for patients needing cystoplasty. Lancet. 367 (9518), 1241-1246 (2006).
- Raya-Rivera, A., Esquiliano, D. R., Yoo, J. J., Lopez-Bayghen, E., Soker, S., Atala, A. Tissue-engineered autologous urethras for patients who need reconstruction: an observational study. Lancet. 377 (9772), 1175-1182 (2011).
- Macchiarini, P., Jungebluth, P., et al. Clinical transplantation of a tissue-engineered airway. Lancet. 372 (9655), 2023-2030 (2008).
- Macchiarini, P., Walles, T., Biancosino, C., Mertsching, H. First human transplantation of a bioengineered airway tissue. J. Thorac. Cardiov. Surg. 128 (4), 638-641 (2004).
- Elliott, M. J., de Coppi, P., et al. Stem-cell-based, tissue engineered tracheal replacement in a child: a 2-year follow-up study. Lancet. 380 (9846), 994-1000 (2012).
- Grikscheit, T. C., Siddique, A., et al. Tissue-engineered small intestine improves recovery after massive small bowel resection. Ann. Surg. 240 (5), 748-754 (2004).
- Sala, F. G., Matthews, J. A., Speer, A. L., Torashima, Y., Barthel, E. R., Grikscheit, T. C. A Multicellular Approach Forms a Significant Amount of Tissue-Engineered Small Intestine in the Mouse. Tissue Eng. Part A. , (2011).
- Matthews, J. A., Sala, F. G., Speer, A. L., Warburton, D., Grikscheit, T. C. VEGF optimizes the formation of tissue-engineered small intestine. Regen. Med. 6 (5), 559-567 (2011).
- Chen, M. K., Badylak, S. F. Small bowel tissue engineering using small intestinal submucosa as a scaffold. J. Surg. Res. 99 (2), 352-358 (2001).
- Wang, Z. Q., Watanabe, Y., Toki, A. Experimental assessment of small intestinal submucosa as a small bowel graft in a rat model. J. Pediatr. Surg. 38 (11), 1596-1601 (2003).
- Wang, Z. Q., Watanabe, Y., Noda, T., Yoshida, A., Oyama, T., Toki, A. Morphologic evaluation of regenerated small bowel by small intestinal submucosa. J. Pediatr. Surg. 40 (12), 1898-1902 (2005).
- Hori, Y., Nakamura, T., et al. Experimental study on tissue engineering of the small intestine by mesenchymal stem cell seeding. J. Surg. Res. 102 (2), 156-160 (2002).
- Gardner-Thorpe, J., Grikscheit, T. C., et al.
- Conconi, M. T., Coppi, P. D., et al. Tracheal matrices, obtained by a detergent-enzymatic method, support in vitro the adhesion of chondrocytes and tracheal epithelial cells. Transpl. Int. 18 (6), 727-734 (2005).
- Ott, H. C., Matthiesen, T. S., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat. Med. 14 (2), 213-221 (2008).
- Uygun, B. E., Soto-Gutierrez, A., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat. Med. , 1-8 (2010).
- Uygun, B. E., Price, G., et al. Decellularization and recellularization of whole livers. J. Vis. Exp. (48), e2394 (2011).
- Petersen, T. H., Calle, E. A., et al. Tissue-Engineered Lungs for in Vivo Implantation. Science. 329 (5991), 538-541 (2010).
- Ott, H. C., Clippinger, B., et al. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat. Med. 16 (8), 927-933 (2010).
- Calle, E. A., Petersen, T. H., Niklason, L. E.
- Totonelli, G., Maghsoudlou, P., et al. A rat decellularized small bowel scaffold that preserves villus-crypt architecture for intestinal regeneration. Biomaterials. 33 (12), 3401-3410 (2012).
- Sala, F. G., Kunisaki, S. M., Ochoa, E. R., Vacanti, J., Grikscheit, T. C. Tissue-engineered small intestine and stomach form from autologous tissue in a preclinical large animal model. J. Surg. Res. 156 (2), 205-212 (2009).
- Demirbilek, S., Kanmaz, T., Ozardali, I., Edali, M. N., Yücesan, S. Using porcine small intestinal submucosa in intestinal regeneration. Pediatr. Surg. Int. 19 (8), 588-592 (2003).
