Summary
Artikeln beskriver en metod för framställning av ett acellulärt matris från råtta tarmen. Härledningen av tarm byggnadsställningar är viktigt för framtida tillämpningar inom tissue engineering, stamcellsbiologi och drogtestning.
Abstract
Framgångsrika vävnadsteknik involverar kombination av ställningar med lämpliga celler in vitro eller in vivo. Ställningar kan vara syntetisk, naturligt framställda eller härrör från vävnader / organ. De senare erhålls genom att använda en teknik som kallas decellularization. Decellularisering kan involvera en kombination av fysikaliska, kemiska och enzymatiska metoder. Målet med denna teknik är att ta bort alla mobil spår samtidigt som den makroekonomiska och mikroarkitektur av den ursprungliga vävnaden.
Tarmvävnadsteknik har hittills använt relativt enkla byggnadsställningar som inte reproducerar den komplexa arkitekturen av den infödda orgel. Fokus för denna uppsats är att beskriva en effektiv decellularization teknik för råtta tunntarmen. Isoleringen av tunntarmen, för att se till att upprätthålla en kärlanslutning beskrivs. Den kombination av kemiska och enzymatiska lösningar för att avlägsna cellerna whilst bevara villus-crypt axeln i luminala aspekten av ställningen också anges. Slutligen är utvärdering av producerade ställningar för lämpliga egenskaper diskuteras.
Introduction
Tissue engineering (TE) ger ett terapeutiskt alternativ till organtransplantation, förbi frågor om immunosuppression och organbristen. TE har nyligen haft framgångsrika tillämpningar inom kliniken, med utbyte av organ såsom urinblåsa 1, urinröret 2 och luftstrupe, både hos vuxna 3,4 och barn 5.
Att bygga ett vävnadstekniska organ kräver en kombination av en byggnadsställning med lämpliga celler. Hängställning kan framställas med hjälp av naturligt härledda (t.ex. kollagen) och syntetisk (t ex poly-L-glykolsyra; PLGA) material, eller erhållas genom decellularisering av nativa organ och vävnader. Ställningar som har använts hittills för intestinal TE har huvudsakligen varit antingen decellulariserade (liten intestinal submucosa) eller syntetiska (poly-L-glykolsyra och poly-mjölksyra) 6-13. Dessa biomaterial är mycket enkla i både makro-och mikroarkitektur, somkanske inte är perfekt om vävnadstekniska tarmen ska kliniskt översättas. En optimal biomaterial för tarmen bör ha en medfödd vaskulär träd som kan anslutas till värdblodtillförsel, en stegvis rörformig vägg med olika egenskaper för att reflektera skikten i tarmväggen och ett villus-crypt axel på den luminala sidan till stöd med återplantering av epitelceller stamceller.
Decellularization är en ny metod som producerar ställningar genom att avlägsna celler från hela organ samtidigt som deras ursprungliga arkitekturen 14. Detta är att föredra för att redan existerande ställningar eftersom de inte bara replikera struktur av organet, utan också innehålla kemiska signaler inbäddade i den extracellulära matrisen (ECM) som stöd cellulär proliferation och differentiering. Under 2008 avliden luftstrupe var decellulariseras 14 seedade med patientens egna celler, och transplanteras för att ersätta de viktigaste vänster bronker i en ung man
Vi har också anpassat samma metod för att producera en liten tarm decellulariserad byggnadsställning 21. Målet med den här beskrivna metoden är att framställa decellulariserade intestinala matriser som upprätthåller de makroskopiska egenskaperna hos den ursprungliga vävnaden, såsom blodtillförseln, såväl som den mikroskopiska strukturen för villus-crypt axel i intestinala lumen. Vi tror att denna metod skulle i sista hand antas för andra organ för att förbättra effektiviteten i decellularisering.
Protocol
1. Isolering av Rat Stine
- Bered en 1 L lösning av fosfatbuffrad saltlösning (Sigma, UK) med 1% antibiotisk / antimykotisk (Sigma, UK) (PBS / AA). Montera peristaltisk pump (Masterflex L / S variabel hastighet) med två slangar. Kör 70% etanol (EtOH) genom rören i den peristaltiska pumpen under 15 minuter vid maximal hastighet, följt av PBS / AA i ytterligare 15 min.
- Euthanize vuxna Sprague-Dawley som vägde ungefär 250-350 g av CO2 inandning och halsdislokation i enlighet med lokala riktlinjer djur och godkännanden (i Storbritannien, Home Office riktlinjerna inom de Animals (Scientific Procedures) Act 1986).
- Autoklav de kirurgiska instrument före användning. Spraya och torka av buken hos djuret med hjälp av 70% EtOH.
- Utför en Xifo-blygd laparotomic snitt på magen för att säkerställa en tydlig kirurgiska området.
- Rensning tunntarmen på den högra sidan av djuret på en pappershandduk besprutas med 70% EtOH. Take omsorg för att kontinuerligt blöta tarmen med PBS / AA, för att undvika uttorkning av vävnaden och denaturering av den extracellulära matrisen (ECM).
- Lokalisera mesenterica superior (SMA) som härrör från en 90 ° vinkel från aorta till tarmen. Använd en 27 G kanyl att komma in i SMA från aorta och snabbt dra in nålen för att undvika att riva väggen av kärlet. Advance plaströret av kanylen in i SMA och säkra med suturer (Vicryl 5/0).
- Bekräfta kanyle genom att injicera 1 ml PBS / AA. Använd våren sax för att incisionsfilm aorta proximal och distal till SMA för att släppa kanylen.
- För att undvika läckage av avföring när dissekera ut tjocktarmen, placera en (Silk 5/0) sutur knut på den proximala änden av ileocekala korsningen och en vid den bortre änden av colon sigmoideum. Klipp i terminala ileum och colon mellan två knutar och ta bort tjocktarmen.
- Skär tarmen vid jejuno-duodenal korsning and frigöra tarmen från alla bindvävs anslutningar kan det ha med buken.
- Överför tunntarmen i en petriskål med PBS / AA. Kanylera proximala delen av tarmen med en plast pasteurpipett (LSL Laboratorieförbrukningsmaterial) och fäst den på plats med suturer. Skär pipetten så det passar Luer-Lok i en 60 ml spruta (BD Plastipak). Spola tarmlumen 2x med 60 ml PBS / AA för att ta bort avföring och skräp.
2. Decellularisering Metodik
- Anslut den vaskulära kanyl till en trevägskran. Detta kommer att underlätta hanteringen, minska spänningen på kärlträdet och kunna ta bort bubblor ur slangen.
- Börja rinnande avjoniserat vatten (resistivitet 18,2 Mohm / cm) genom Masterflex L / S med variabel hastighet rullpump vid 0,6 ml / timme. Se till att inga bubblor inuti slangen innan du ansluter med den intestinala lumen kranen. Vissa bubblor får vistas i lumen från steg1.9, vilket kan försämra decellularization processen. Variera hastigheten hos pumpen och hantera vävnad med pincett med försiktighet för att säkerställa att bubblorna utträde från den distala änden. Anslut inte den vaskulära kanylen tills processen är klar, eftersom höga hastigheter kan skada kärlträdet.
- Överför apparaten till det kalla rummet, eftersom det följande steget av decellularisering utförs vid 4 ° C. Den låga temperaturen gör att avlägsna celler samtidigt minimera vävnadssönderdelning. Placera petriskål i en behållare som samlar den överfulla lösningen. BEGJUTA båda tarmlumen och det vaskulära trädet med avjoniserat vatten (resistivitet 18,2 Mohm / cm) under 24 h vid 0,6 ml / timme. För den första timmen kontrollerar apparaten regelbundet för att säkerställa att alla anslutningar är säkra, är läckage minimal och inga bubblor i tarmen.
- Efter 24 timmar av behandling med avjoniserat vatten, flyttar decellularization apparat utanför kylrummet som resten av stegen ärutförs i rumstemperatur (RT).
- Väg natriumdeoxicholat (Sigma, UK) för framställning av 300 ml av en 4%-ig lösning i avjoniserat vatten. Väg natriumdeoxikolat under ett sug huva, eftersom det är en oral-och ögonirriterande. Blanda med hjälp av en virvel tills lösningen är klar. Lösningen kan hållas vid 4 ° C i upp till en månad.
- Ändra avjoniserat lösning på natriumdeoxikolat, kontrollera anslutningarna, avlägsna eventuella bubblor och BEGJUTA vid 0,6 ml / h under 4 timmar.
- Efter natriumdeoxikolat steg tvätt med PBS / AA för 30 min för att undvika växelverkan mellan natriumdeoxicholat och DNas-I.
- Väg upp deoxiribonukleas-I (DNase-I, Sigma) och bereda 250 ml av en 2000 kU lösning i 1 M natriumklorid, pH 7,4. Blanda med hjälp av en virvel tills lösningen är klar. Denna lösning måste beredas omedelbart före användning och kan inte lagras.
- BEGJUTA med DNas-I till 3 timmar vid rumstemperatur vid en hastighet av 0,6 ml / timme.
- Efter DNas-I steg, överförabyggnadsställning i en vävnadsodling huva och byta plattor och instrument. Det föreslås att använda aseptisk teknik.
- Tvätta med PBS / AA i 30 min för att säkerställa att alla rester av decellularization lösningar tas bort. Placera ställningen i en ny petriskål och överföra till en UV Crosslinker (Spectroline, US). Kör två steriliseringscykler. Förvara i 5% PBS / AA och ändrar lösningen var 3 dagar.
Representative Results
Vid lyckad decellularisering (figur 1), bör ställningen har en makroskopiska utseende som liknar den en av den nativa tarmen, men med genomskinliga väggar (Figur 2A). Bevarandet av makro arkitektur bör också framgå av öppenheten hos kärlträdet. När färgämne injiceras genom SMA kanylen bör det fördela jämnt i hela byggnadsställning och nå kapillären trädet (Figur 2B). Ställningen ska vara fritt från kärn-och cytoplasma material, något som kan bedömas med hjälp av en DNA-kvantifiering kit och enkel histologisk analys. Hematoxylin och eosin färgning (H & E) ska visa en frånvaro av nukleär och cytoplasmatisk material samtidigt som man bevarar de små tarm lager (Figur 3A). Framför allt bör underhåll av villi och kryptor på luminala sidan framgå efter svepelektronmikroskop (Figur 4). ETTbör också förväntas bevarande av extracellulära matriskomponenter, såsom kollagen, elastin och glykosaminoglykaner. Exempelvis Massons trikromfläckning displayer intakt bindväv i byggnadsställning (figur 3B).
Figur 1. . Försöksplanen Timeline av decellularization förfarande, PBS / AA: fosfat saltlösning med antibiotika-antimykotika, NaDeoxy: Natriumdeoxycholat, RT: rumstemperatur, DNAs-I: deoxyribonukleas-I. Klicka här för att visa en större bild .
Figur 2. Scaffold macroscopic egenskaper. Makroskopisk utseendet av råttans tunntarm efter framgångsrik decellularisering (A). Injektion av Rosso Ponceau färgämne genom SMA visar en intakt vaskulära nätverket (B), SMA: mesenterica superior Klicka här för att visa en större bild .
Figur 3. . Histologi H & E (A) och MT (B) färgning indikerar en frånvaro av cellmaterial med bevarandet av den bindväv arkitektur, H & E: hematoxylin och eosin, MT: Masson trikrom. Skala bar:. 100 ìm Klicka här för att visa en större bild . 
Figur 4. . Elektronmikroskopi Svepelektronmikroskopi visar den bevarade villus-crypt arkitektur i ställnings lumen, Skala bar:. 100 ìm Klicka här för att visa en större bild .
Discussion
De svåraste stegen i att inrätta detta experiment involverar kanylering av SMA och upprättande och upprätthållande av sterilitet. Kanyle SMA i gnagare utan att sprängas sönder väggen kan vara ganska svårt på grund av storleken och fartygets position. Alternativt kan en sutur placeras runt den proximala aorta före ursprung SMA, följt av kanylering av aorta sig distalt, rikta kanylen i SMA. Under decellularization en kombination av dålig kanyl placering och höga flöden kan resultera i att förlora den vaskulära tillgång. Sterilitet är en viktig fråga på grund av den mängd av bakteriefloran som är närvarande i tunntarmen. Tvättning med PBS / AA följande skörd är mycket viktigt, och något tecken på fekalt material eller skräp måste avlägsnas från lumen. Placering av en del av byggnadsställningen i ett Falcon-rör med DMEM i inkubatorn efter UV-sterilisering bör vara en indikator om sterilitet har uppnåtts. I falletav bakteriell kolonisering, kommer media ändra pH med sin färg vända från rött till gult. För att hantera detta krävs ytterligare UV cykler rekommenderas samt tvättning med PBS som innehåller en hög koncentration av antibiotika / antimykotika.
En möjlig modifikation för att erhålla en byggnadsställning med både kärl och venkateter skulle vara att kanylera nedre hålvenen (IVC) samt SMA. Decellularization från de venösa och kärl sidor bör prövas intermittent för alla tre lösningar. Kontinuerlig decellularization kan brista kapillärerna genom att ha positivt tryck på båda sidor.
Under åren har det funnits ett antal insatser i tarm TE med olika cell-ställningskombinationer in vitro och in vivo 6,9,12. Huvuddelen av arbetet har utförts med hjälp av rörformiga nonwoven 95% PGA-5% PLGA byggnadsställningar belagda med kollagen typ I 6,7,13,22. Efter sådd med tarmepithelial organoid enheter (OU) och en period om implantation i omentum hos möss bildar de cystor med muskel på utsidan och epitel på insidan som sedan kan tubularized. Emellertid porositeten och enkelhet i konstruktionen av dessa ställningar inte tillåta för generering av stora bitar av artificiell tarm i en in vitro-miljö som den i en bioreaktor. Dessutom har avsaknaden av en medfödd vaskulär nätverk som kan vara ansluten till mottagaren ytterligare begränsar användningen av denna byggnadsställning för klinisk översättning. Förutom de experiment med PGA-PLGA scaffolds har andra grupper användes kollagen eller SIS-ställningar, vilka båda inte replikerar intrikat av tarmkanalen. SIS i synnerhet är den enda tidigare publicerade metoden av tarmvävnadsteknik och har använts i mer än 150 medicinska inställningar, visar förmåga decellulariserade byggnadsställningar för att ge mekanisk stabilitet och främja celltillväxt, medan blyning till ingen immunogent svar. Men bristen på lämpliga makro-och mikro-arkitektur, har lett till dåliga resultat i sin "används för tarm TE ändamål 9-11,23.
Fördelarna med decellularization metodik vi har beskrivits innefattar bevarandet av mikroskopiska egenskaper såsom den luminala kryptan-villus arkitektur som utgör en lämplig miljö för återplantering av tarm stamceller nisch. I makroskopiska aspekten, kommer närvaron av en hierarkisk vaskulära nätverket möjliggöra fastsättning till mottagaren, vilket möjliggör tillhandahållande av näringsämnen och syre till alla skikt av det TE-armen 21. Vad mera är, har upprätthållandet av ECM-komponenter, såsom kollagen, elastin och glyocosaminoglycans en viktig roll, inte bara med avseende på mekaniska egenskaper utan även styra cellulär proliferation och differentiering. Viktigast förmåga decellularization metod som ska skalas upp till storar vävnader samtidigt bibehålla samma egenskaper är en viktig egenskap för klinisk översättning av TE.
Utvecklingen av en naturlig tarm matris med en vaskulär nätverk möjliggör skapandet av större segment av konstgjord tarm som kan anslutas till värden.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författarna tackar Wake Forest Institute of regenerativ medicin för deras hjälp med utvecklingen av detta protokoll. Vi erkänner stöd genom bidrag från Great Ormond Street Hospital välgörenhet, stiftelsen Eugenio Litta (Genève, Schweiz), Vetenskapsrådet, Royal College of Surgeons i England, de Sparks Barnens Medical Charity, det brittiska utrikesdepartementet för Storbritannien / USA Stamcells Collaboration Award och Mittal forskningsfonden. Vi vill också tacka Royal Society / Wolfson stiftelsen för tissue engineering laboratorium renovering bidrag som erhållits för Barnkirurgiska avdelningen vid Institute of Child Health. PDC och SE stöds av Great Ormond Street Hospital Barnens välgörenhet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol solution, 70% in H20 | Sigma | 02877 | |
| Phosphate buffered saline tablets | Sigma | 79382 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x) | Sigma | A5955 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | Oral and eye irritant; use protection |
| Sodium chloride | |||
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | D5025 |
References
- Atala, A., Bauer, S. B., Soker, S., Yoo, J. J., Retik, A. B. Tissue-engineered autologous bladders for patients needing cystoplasty. Lancet. 367 (9518), 1241-1246 (2006).
- Raya-Rivera, A., Esquiliano, D. R., Yoo, J. J., Lopez-Bayghen, E., Soker, S., Atala, A. Tissue-engineered autologous urethras for patients who need reconstruction: an observational study. Lancet. 377 (9772), 1175-1182 (2011).
- Macchiarini, P., Jungebluth, P., et al. Clinical transplantation of a tissue-engineered airway. Lancet. 372 (9655), 2023-2030 (2008).
- Macchiarini, P., Walles, T., Biancosino, C., Mertsching, H. First human transplantation of a bioengineered airway tissue. J. Thorac. Cardiov. Surg. 128 (4), 638-641 (2004).
- Elliott, M. J., de Coppi, P., et al. Stem-cell-based, tissue engineered tracheal replacement in a child: a 2-year follow-up study. Lancet. 380 (9846), 994-1000 (2012).
- Grikscheit, T. C., Siddique, A., et al. Tissue-engineered small intestine improves recovery after massive small bowel resection. Ann. Surg. 240 (5), 748-754 (2004).
- Sala, F. G., Matthews, J. A., Speer, A. L., Torashima, Y., Barthel, E. R., Grikscheit, T. C. A Multicellular Approach Forms a Significant Amount of Tissue-Engineered Small Intestine in the Mouse. Tissue Eng. Part A. , (2011).
- Matthews, J. A., Sala, F. G., Speer, A. L., Warburton, D., Grikscheit, T. C. VEGF optimizes the formation of tissue-engineered small intestine. Regen. Med. 6 (5), 559-567 (2011).
- Chen, M. K., Badylak, S. F. Small bowel tissue engineering using small intestinal submucosa as a scaffold. J. Surg. Res. 99 (2), 352-358 (2001).
- Wang, Z. Q., Watanabe, Y., Toki, A. Experimental assessment of small intestinal submucosa as a small bowel graft in a rat model. J. Pediatr. Surg. 38 (11), 1596-1601 (2003).
- Wang, Z. Q., Watanabe, Y., Noda, T., Yoshida, A., Oyama, T., Toki, A. Morphologic evaluation of regenerated small bowel by small intestinal submucosa. J. Pediatr. Surg. 40 (12), 1898-1902 (2005).
- Hori, Y., Nakamura, T., et al. Experimental study on tissue engineering of the small intestine by mesenchymal stem cell seeding. J. Surg. Res. 102 (2), 156-160 (2002).
- Gardner-Thorpe, J., Grikscheit, T. C., et al.
- Conconi, M. T., Coppi, P. D., et al. Tracheal matrices, obtained by a detergent-enzymatic method, support in vitro the adhesion of chondrocytes and tracheal epithelial cells. Transpl. Int. 18 (6), 727-734 (2005).
- Ott, H. C., Matthiesen, T. S., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat. Med. 14 (2), 213-221 (2008).
- Uygun, B. E., Soto-Gutierrez, A., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat. Med. , 1-8 (2010).
- Uygun, B. E., Price, G., et al. Decellularization and recellularization of whole livers. J. Vis. Exp. (48), e2394 (2011).
- Petersen, T. H., Calle, E. A., et al. Tissue-Engineered Lungs for in Vivo Implantation. Science. 329 (5991), 538-541 (2010).
- Ott, H. C., Clippinger, B., et al. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat. Med. 16 (8), 927-933 (2010).
- Calle, E. A., Petersen, T. H., Niklason, L. E.
- Totonelli, G., Maghsoudlou, P., et al. A rat decellularized small bowel scaffold that preserves villus-crypt architecture for intestinal regeneration. Biomaterials. 33 (12), 3401-3410 (2012).
- Sala, F. G., Kunisaki, S. M., Ochoa, E. R., Vacanti, J., Grikscheit, T. C. Tissue-engineered small intestine and stomach form from autologous tissue in a preclinical large animal model. J. Surg. Res. 156 (2), 205-212 (2009).
- Demirbilek, S., Kanmaz, T., Ozardali, I., Edali, M. N., Yücesan, S. Using porcine small intestinal submucosa in intestinal regeneration. Pediatr. Surg. Int. 19 (8), 588-592 (2003).
