Summary
Et eksempel på en nano lægemiddel baseret på polyæblesyre præsenteres i retning af rationel udformning af skræddersyet medicin, der er gældende for kræft. Det beskriver syntesen af en nano lægemiddel til behandling af HER2-positive humane bryst i en nøgen mus.
Introduction
I den post-genome æra, hvor genomer af kræft er blevet bragt i orden (National Center for Biotechnology og The Cancer Genome Atlas), vil fremtidige behandling af kræft tegner sig for den genetiske mangfoldighed af tumorer ofte inden for samme tumor 1-4. Bioinformatik og hurtig, ikke dyrt DNA-sekventering muliggør erhvervelse af maligne gener / mutationer på et personligt plan 2,4,5. Når gener er blevet identificeret, vil patienterne blive behandlet med personlig medicin til at ændre eller lukke munden deres udtryk af maligne gener 6. Behovet for at målrette kræftceller og levere medicin ind i disse celler kræver polyfunktionelle leveringssystemer. Naturligvis kan nano medicin opfylde dette krav 7.
I en bølgende bølge af opdagelser nanopartikler har vist sig egnet til at bringe nyttelast af kemoterapeutiske lægemidler, proteiner og / eller genetisk aktivt materiale til cancerceller. Dog fortsat bivirkninger at være annonceklædt. En af dem i forbindelse med fraværet af bionedbrydelighed kan medføre aflejring af materiale i sundt væv og organer med sandsynlighed for at fremkalde sygdomme. For at minimere aflejring introducerede vi ikke-toksisk og ikke-immunogen polyæblesyre, som er af mikrobiel oprindelse og biologisk nedbrydeligt til H 2 O og CO 2 8. Vi bruger polymer til at syntetisere en alt-i-en kovalent type nano stof. Den indeholder kemisk vedhæftede kemoterapeutika såsom Temozolomide, doxorubicin, eller antisense-oligonukleotider og funktionelle grupper, der serverer ekstravasation, målretning væv, endosomolytic levering. De lægemidler er uløseligt spaltes fra nano-platformen, da de ankom i den målrettede tumor celle, og derved regenerere deres fulde farmaceutisk aktivitet.
Vi beskriver fremgangsmåden for mikrobiel produktion af polymeren nano platform dets oprensning, og den kemiske syntese af en nano lægemiddel, der indeholder trastuzumab (Herceptin) for kræftmålretning og et antisense-oligonukleotid til inhibering af HER2 overproduktion. Ved anvendelse af nano stof til xenogent HER2-positiv brystkræft menneske på nøgne mus, vi viser høj effekt af kræftbehandlingen. Principperne for målretning tumor og gendæmpning introduceret her polyæblesyre nano medicin kan anvendes i behandlingen af andre tilfælde af kræft.
Protocol
Alle forsøg overholder officielle dyr bestemmelser, herunder kirurgiske og ikke-kirurgiske procedurer udføres in vivo og er i fuld overensstemmelse med IACUC protokoller.
1. Bioproduktion af polyæblesyre
- Dyrk et frø kultur fra sfæruler på agar og overføre plasmodia til 100 ml dyrkningsmedium ved hjælp af en 25 ° C termo erklærede inkubator og naeringsoploesning 8,9.
- Producere en mængde tyngdekraft-packed 500 ml mikro plasmodia under udelukkelse af lys for at undgå sporedannelse.
- Forbered 80 g CaCO 3 suspenderes i 8 L basalt medium i 10 liters bioreaktor fartøj. Overfør 500 ml pakket mikro Plasmodia i den monterede reaktionsbeholder og tillade bioproces for 75 timer ved 25 ° C, 10 l / min strøm af filtreret luft og 150 rpm omrøring af et segment omrører.
- Afslut når dyrkningsbouillonen har pH 4,8 angiver afslutningen af produktionen af PMLA og måle PMLA indhold af than hydroxamat / Fe (III)-assay.
- Afkøl bouillon til 17 ° C og tillader celler at afregne ved tyngdekraften.
- Cool til 4 ° C og justeres til pH 7,5, skal du bruge 2 M NaOH. Pump supernatanten gennem en søjle fyldt med 1,5 liter DEAE-cellulose, i retning fra bund til top (grovkornet DEAE, ækvilibreret med 20 mM Tris-HCI, pH 7,5 ved 5 ° C).
- Vask med 3 kolonner puffer indeholdende 0,3 M NaCl efter ændring af retning fra top til bund, og der elueres PMLA i nærvær af 0,7 M NaCl.
- Juster til 0,1 M CaCl2 og bundfald PMLA-Calcium med 80% iskold ethanol. Fractionate løbet Sephadex G25 i PMLA-calcium på 80-300 kDa, 50-80 kDa, og 10 - 50 kDa, brug vand i fravær af buffer og salt.
- Pass hver fraktion over en Amberlite IR 120H +-søjle, og straks fryse gennemstrømning polyæblesyre i flydende nitrogen i lyofilisering.
- Opløses i tør acetone. Efter filtrering fjernes opløsningsmidleti tør luftstrøm, lyofiliseres og opbevares ved minus 20 ° C.
2.. Syntese af polyæblesyre-baserede Nano Drug
- Aktiver carboxylgrupper PMLA (P) ved at blande 116 mg (1 mmol malyl enheder) af PMLA-H i 1 ml vandfri acetone og 1 mmol N-hydroxysuccinimid og 1 mmol dicyclohexyl carbodimid i 2 ml dimethylformamid (DMF). Der omrøres ved 20 ° C i 3 timer. Tilføj 0,05 mmol mPEG 5000-NH2 (0,05 mol% af malyl enheder) i 1 ml DMF efterfulgt af 0,05 mmol triethylamin (TEA).
- Tilføj dråbevis opløst i DMF 0,4 mmol leucin-ethylester (Loet) (40 mol-% malyl enheder), 0,1 mmol 2-thiol-1-ethylamin (2-MEA) (10 mol% malyl enheder) og 0,5 mmol TEA, alle opløst i DMF. Efter hver tilsætning tillade 1 time og tjekke for reaktion færdiggørelse af negativ ninhydrin respons (tyndt lag-chromatografi, TLC).
- Fjerner efterladenskaber NHS-ester ved spontan hydrolyse med phosphatbufret saltvand (30 min, pH 6,8). Afsalte i PD-10 Kolonne, få "preconjugate" som et hvidt pulver ved frysetørring. Opbevares tørt ved minus 20 ° C.
- 30 mg antistof (mAb IgG2a-κ) opløses i 4,5 ml 100 mM natriumphosphat, 150 mM NaCl, pH 5,5.
- Reducer disulfidbindinger med 5 mM tris (2-carboxy-ethyl) phosphin hydrochlorid i 30 minutter ved 20 ° C og renses i PD-10-kolonne.
- Opløs Mal-PEG 3400-Mal i 2 ml af den samme buffer, og der tilsættes reduceret mAb ved slutvolumen på 10 ml, og der omrøres natten over ved 4 ° C. Koncentreres til 2,5 ml i løbet af Vivaspin 20, udelukkelse 30 kD og rense løbet Sephadex G75. Kontroller produkt over sek-HPLC og måle mængden fotometrisk ved 280 nm bølgelængde.
- Fastgør Mal-PEG-Mal-mAb "preconjugate" thioler opnå P / PEG 5000 (5%) / Loet (40%) / mAb (0,2%) / 2-MEA (10%). Gør dette ved at blande 5 ml 200 nmol mAb-PEG 3400-Mal til 50 mg (P / MPEG 5000 / LOEt/2-MEA) i ovenstående buffer pH 5,5, justeres koncentrationen af sulfhydryl til 2 mM, og der inkuberes ved 20 ° C i 3 timer (udbytte 98%).
- Opløse 3'-H2N-AON i DMF / PBS (pH 7,2) og reagere med N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio) propionat (SPDP) i (1:1 v / v) DMF / methanol (ninhydrintesten ) og rense AON-PDP i løbet af Sephadex-LH20 i methanol, og derefter i vand og lyofiliseres.
- Inkuber 800 nmol aktiverede AONs i 5,5 pH-buffer med ovenstående forberedt Mal-PEG 3400-Mal-mAb-preconjugate natten over, indtil disulfidudbytningsreaktion afsluttes.
- Indarbejd fluorescerende Alexa Fluor 680-maleimid danner thioetheren med polymer-2-MEA-SH. Blokere overskydende sulfhydryler med 3-pyridyldithio-propionat (PDP) og rense løbet Sephadex G75. Opbevares ved 4 ° C eller lynfrosset ved -80 ° C indtil yderligere anvendelse.
3.. Analyser og Ejendomsstyrelsen
- Udføre test for renhed og stabilitet i PBS og serum ved 4 ° C og 37 ° C ved sec-HPLC-analyse. Brug polystyrensulfonat som Molecular vægt standarder. Mål nanostørrelse distribution og Zeta-potentialer. Brug kommercielle systemer.
- Tilføj til 320 pi prøve 160 pi af 10% (w / v) hydroxylammoniumchlorid og 160 pi af 10% (w / v) NaOH. Efter 10-15 minutter, blandes med 160 pi 5% (w / v) Fe (III) Cl 3 i 12% (v / v) HCI og læse En 540 af hydroxamat / Fe (III). Beregn PMLA antagelse 1 mg / ml PMLA svarer til 2,5 A 540.
- Hydrolysere nano stof natten over i 2 M HCI ved 110 ° C og assayet æblesyre på omvendt fase-kromatografi med henvisning til prøver tilsat æblesyre standarder. Spalte nano lægemidlet med 100 mM dithiothreitol og måle Morpholino-AON ved kvantitativ omvendt fase HPLC mod Morpholino Aon standarder.
- Tag nano lægemiddel uden spaltning og måle antistof under anvendelse af et protein assay kit. Kvantificere mPEG ved at lade sin reaktion med ammonium ferrothiocyanate, derefter udtrække med chloroform, og absorbansen aflæses ved 510 nm bølgelængde 10
- Udfør ELISA med 5 ul nano drug (1-10 ug mAb) pr brøndtestning antistof aktivitet og colligation. Anvend 0,5 ug / brønd transferrin receptor og HER2 som henholdsvis plade-coatede antigener og peroxidase-koblede sekundære antistoffer.
- Beregn opnået% for AON, MPEG og mAb med hensyn til æblesyre (100%) og sammenlign med% beregnet af design (se eksempler tabel 1 og 2).
4.. In vitro Test
- Inkuber nano lægemidlet med dyrkede cancerceller og foranstaltning overlevende celler over tid ved deres aktivitet til at reducere gul reagens [3 - (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -5 - (3-carboxymethoxyphenyl) -2 - (4-sulfophenyl )-2H-tetrazolium, indre salt] (MTS) til et blåt farvestof og læse relativ absorbans med et fotometer. Følg instruktionerne fra sættet leverandøren.
- Forbered celleekstrakter in vitro eller ex vivo til Western blotting. Brug iskold udvinding buffer der indeholder SDS og protease inhibitor cocktail. Separate proteiner ved reducerende SDS-polyacrylamidgelelektroforese.
- Gør western blotting for proteiner af interesse i prøveekstrakterne. Brug sekundære antistoffer konjugeret til alkalisk phosphatase.
- Brug konfokal mikroskopi til at demonstrere celle optagelse og co-lokalisering af nano drug polymer platform, AON og endosomes hjælp fluorescens mærkning. Fastgør Alexa Fluor 680 til nano konjugat platform og Lissamin til AONs som fluorescensmærker. Brug et mikroskop 5X spektral scanner og levende kræftceller til at visualisere fordelingen af de mærkede molekyler
- Stain endosome membraner med styryl Rød fluorescerende farvestof og demonstrere endosome colokalisering eller frigivelse.
5.. In vivo-test
- Forbered humane HER2-positiv brystkræft musemodel (nøgen mus Tac: Cr: (MCR)-Foxnnm). Indsæt en 0,72 mg 17β-østradiol frigiver pellet (90-dages release) subcutaneously i halsen på hver mus.
- Derefter injiceres 1 x 10 7 BT-474 tumorceller subkutant i den højre flanke og lad tumor vokse.
- Start behandling, når tumorer er 120 mm 3 i størrelse ved injektion i halevenen 150 pi nano konjugat indeholdende 2,5 mg / kg AON og / eller 4,5 mg / kg af hvert antistof. Til behandling injiceres to gange om ugen, i alt seks gange.
- Mål tumor størrelse med kalibre dobbelte svage og beregne volumen ved hjælp af formlen (længde x dybde x bredde) x (π / 6). Aflive dyr 2 uger efter den sidste injektion og efter sedation med en opløsning af ketamin og Dexmedetomidin efterfulgt af cervikal dislokation.
- Isoler tumorer og pletten sektioner med H & E for morfologiske evaluering.
- Til vurdering af narkotika distribution på et dyr skala, skal du bruge et fluorescensimagografi system. Sprøjt Alexa Fluor 680 mærket nano drug og image på 24 og 48 timer.
- Aflive dyret og opdage fluoratorenescence i isolerede og perfusionerede tumorer og organer.
Representative Results
Hæmning af human brystkræft HER2-positiv ved tavshed HER2 receptor-ekspression og blokering HER2-signalering 12
Strategi
Blandt de forskellige former for menneskelige brystkræft, HER2-positive tumorer har de værste kliniske resultat. Vi præsenterer vellykket behandling af brystkræft HER2-overekspression i nøgen musemodel. Strategien involverer nano aktivt lægemiddel i både øjeblikkelig inaktivering af HER2-signalvejen anvender Herceptin og HER2-specifik AON til blokering af HER2-mRNA afhængig syntese af receptoren (figur 1). Den ledende nano konjugat, som indeholder Herceptin og anti-HER2 AON er vist i figur 3 sammen med to knapper, der mangler enten Herceptin eller AON. Den ledende forbindelse indeholdt anti-MsTfRmAb at opnå aktiv ekstravasation af transcytose through binding til endotel TFR af tumor fartøjer. Meget mindre optagelse i tumoren blev bemærket i fravær af antistof, og blev tilskrevet tumor afhængig EPR virkningen 13. Fluorescerende versioner af nano konjugater indeholdende Alexa Fluor 680 blev syntetiseret for billeddiagnostiske undersøgelser.
. Figur 1. Mekanisme af AON levering i HER2-positiv brystkræft celler og tumor vækst hæmning øverste venstre hjørne:. Nano konjugat tilpasset fra figur 3. Nederste venstre hjørne: Mouse tumorkar udtrykker TFR på overfladen. Nano stof binder til receptoren og ind i tumoren ved transcytose. Desuden er mulighed for en vis grad af adgang til tumoren gennem uordnede endotheliale lag, der deltager i tumor afhængig øget optagelse og retentipå (EPR) 13.. Dernæst nanodrug binder sig til HER2 udtrykt på de menneskelige kræftceller og internaliserer i tidlige endosomer. Bindende blokerer også HER2-signalvejen. Efter modning af endosomer og deres forsuring er endosomet flugtmekanismen i nano lægemiddel aktiveret. Nanodrug ind i cytoplasmaet frigives fra nano-platformen ved reduktiv spaltning af disulfid afstandsstykke og binder sig til HER2-mRNA blokerende HER2-syntese. Blokering af syntesen udvider blokering af HER2-signalering og inducerer tumor væksthæmning.
Mikrobiel produktion af polyæblesyre platform
Nano konjugat platform, polyæblesyre (PMLA), blev produceret af dyrkede microplasmodia af Physarum polycephalum og oprenset fra bouillonen, som beskrevet i protokollen og afbildet i figur 2.. Produktion og oprensning var glatte og reproducerbar. Det var vigtigt at forts rol tid, pH og temperatur for at undgå spontan spaltning af polymeren. Omhyggelig vask og eluering af DEAE-søjlen anbefales for at fjerne DNA, kulhydrater, toksiner og farvet materiale. Ekstrem renhed blev opnået efter opløsning i vandfri acetone og fjerne uopløseligt materiale. Samlet beløb af produceret PMLA var 5 ± 1 g pr-kampagne. Mængder på 1,5 ± 0,5 g stærkt oprenset PMPLA af Mw 80.000-100.000 blev reproducerbart opnås ved anvendelse af 10 liters bioreaktor. Sec-HPLC elueringsprofiler var symmetrisk. Dynamisk lysspredning analyse efter antal fordeling angives en enkelt top, der svarer til en hydrodynamisk diameter på 8 ± 1 nm og en polydispersitetsindeks på PDI = 0,10 ± 0,02, beregnet af instrumentets software til formodede sfæriske partikler. Zeta-potentialet var -22 ± 2 mV (pH 7,5).
/ 50668/50668fig2highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 2. Produktion og oprensning af polyæblesyre fra dyrkede mikroorganismer plasmodia af Physarum polycephalum (tilpasset fra Lee et al. 9). Polyæblesyre (PMLA) fremstilles på basis plasmodia af Physarum polycephalum i en bioreaktor og indsamlet fra kultursupernatanten ved at binde på anionbytter (DEAE). Eluenten ethanolfældet som calciumsalt. Opløsninger af calciumsaltet er Mw-fraktioneret i Sephadex-G25. PMLA holdige fraktioner konverteret fra Ca-salt i syren i Amberlite IR 120H +. Den frie PMLA endelig frysetørres til opnåelse af tørt hvidt pulver.
Kemisk syntese af den ledende nano konjugat
P / mPEG 5000 (5%) / Loet (40%) / APÅ (2,5%) / Herceptin (0,2%) / a NTI-MsTfRmAb (0,2%)
De skematiske strukturer af bly nano stof og to precursor nano konjugater er vist i fig ure 3. Føringen indeholder alle bestanddele, mens forstadier blev designet til at mangle enten AON HER2 eller antistoffet Herceptin. Udover AON og mAbs forbindelserne indeholdt polyethylenglycol, mPEG 5000, for at minimere binding til plasmaproteiner, clearance gennem retikuloendoteliale system (RES), og nedbrydning ved enzymatisk spaltning. Antisense-sekvensen 5'-CAT-GGT-GCT-CAC-TGC-GGC-TCC-GGC-3 'var et supplement til Her2 mRNA og er blevet omhyggeligt testet in vitro på flere HER2-cellelinjer, der udtrykker at opnå en høj specificitet mod at blokere HER2 syntese og ikke vise for målgruppen effekter.
8/50668fig3highres.jpg "width =" 500 "/>
Fig. 3. Nano-konjugaterne til behandling af brystkræft HER2-positive. Førende nano drug (øverste struktur) indeholder to lægemidler (Herceptin, AON HER2). Versioner 2 og 3 kun indeholder én af narkotika. Optagelse af 1 og 2 i humane HER2-overudtrykkende tumorceller forvaltes af binding af Herceptin. Nano konjugat 3, som ikke indeholder Herceptin modtog anti-HuTfRmAb for endosom optagelse af de humane celler. Den konjugering med Alexa Fluor 680 var frivillig for billeddannelse formål. Den røde søjle repræsenterer nano konjugat platform PMLA / Loet (40%). % Angiver den brøkdel af æblesyre rester forbruges i binding af den angivne ligand (samlede æblesyre rester i nanodrug = 100%).
Fig. 4. Kemisk syntese af nanokonjugater P / Loet / AON HER2 / anti-MsTfR/Herceptin Fra top til bund:. Syntese af PMLA-N-hydroxy succinimidylesteren (PMLA-NHS) af vedhæng carboxylater (kemisk aktivering). Udskiftning af NHS ved amiddannelse med 2-mercapto-1-aminoethan (2-MEA), methyl-PEG 5000-amin (mPEG 5000-NH2), trileucine (LLL) eller leucin-ethylester (Loet). Denne "preconjugate" lægger mAb-Mal-PEG-Mal med thioether dannelse og AON ved dannelse af spaltbare disulfidbindinger. Sidesten 2-MEA er udjævnet danner amidoethyl-dithio-propionsyre. Kun fastgørelse af et enkelt mAb vist. Flere vedhæftede filer styret ved at bruge blandinger af mAbs. Procent% betegner fraktioner af carboxylater bundet til forskellige ligander (100% gratis PMLA).
Nano konjugater blev syntetiseret som beskrevet i fig ure 4. Den beregnede molekylvægt af blykonjugat var 719.000. Det samlede udbytte af syntesen var 45 ± 5% med hensyn til æblesyre indhold. I gennemsnit af de 862 malyl enheder (= 100%) af 100 kDa PMLA platform, 40% gennemført Loet, 5% mPEG, 2% APÅ 2%, 0,2% Herceptin og 0,2% anti-MsTfR mAb. Beløbet for hvert antistof svarede til et gennemsnit på 1,7 molekyler pr molekyle af PMLA platform. Den% designet og den% verificeret ved gruppe-analyse var den samme inden for ± 5%. Et eksempel er tilfældet givet i tabel 1 til beregning af den eksperimentelle indhold af æblesyre, AON mAb og mPEG 5000 og i tabel 2 viser en sammenligning med indholdet af design. Den høje renhed i henhold til kriterierne i henhold til § 3 blev opnået på grundlag af høje reaktions udbytter og effektiv adskillelse efter størrelse udstødelse (f.eks gratis mAb og mAb-nanoconjugate er adskilt af 1 min på sek-HPLC), og selektiv opløselighed i opløsningsmidler. Aktiviteten af monoklonale antistoffer var vist at blive bibeholdt i hele nano drug syntese, og det blev bekræftet, at de to typer antistoffer blev samlet på den samme polymer platform. Resultatet af atypiske ELISA forsøget er vist i fig ure 5. Generelt assays til kvantitativ gruppe analyse for æblesyre, APÅ, protein, PEG og for ELISA var robust, hvilket gav reproducerbare resultater, når den udføres af forskellige personer og instrumentering, ikke kun i tilfælde af rapporterede syntese, men også når de anvendes til analyse andre syntetiserede nanoconjugates.
Tabel 1. Beregning af nanodrug sammensætning med henvisning til æblesyre indhold.
668table2.jpg "width =" 600 "/>
Tabel 2. Sammenligning af eksperimentel nano lægemiddel sammensætning med designet sammensætning.
Fig. 5. ELISA til måling af antistof affinitet efter kemisk syntese, og til demonstration af multipel binding af forskellige antistoffer. Nano stof indeholder antistof mAb (A) og antistof mAb (B) mod antigener A og B, hhv. ELISA-plader overtrækkes med antigen (A). Free mAb (A), fri mAb (B) og nano lægemiddel anvendes på ELISA-plader. Efter vask antistofferne afprøves med sekundær peroxidase koblet antistoffer specifikke for enten mAb (A) eller mAb (B), mens kun mAb (A) er bundet til antigen (A). Det ses, at frie og nano stof konjugeret med mAb (A), og indirekte konjugeret mAb (B) i samme nano lægemiddelmolekylet, men ikke fri mAb (B), Tilbageholdes på pladen. Koncentrationen afhængighed viser sammenlignelige bindingsaffiniteter for fri og konjugeret mAb (A), hvilket indikerer, at den kemiske konjugering ikke påvirker antistofbindingsaktivitet. Desuden co-ligering af mAb (B) med mAb (A) på samme fysiske enhed (nano platform) resulterer i antistof mAb (B) detektion. De eksperimentelle resultater vist her refererer til anti-humant TfRmAb (A) og anti-muse TfRmAb (B). Lignende resultater er blevet vist for andre antistof testede par, såsom anti-MsTfR mAb og anti-HER2 mAb (Herceptin).
Den fysisk undersøgelse viste hydrodynamiske diameter 22,1 ± 2,3 nm for P / MPEG (5%) / Loet (40%) / AON (2%) / Herceptin (0,2%) / anti-MsTfRmAb (0,2%) (bly, de to- lægemiddel udgave), 20,1 ± 2,4 nm for P / mPEG (5%) / Loet (40%) / APÅ (2%) / anti-MsTfRmAb (0,2%) / anti-HuTfRmAb (0,2%) (AON lægemiddel udgave) og 15,1 ± 1,2 nm for P / mPEG (5%) / Loet (40%) / Herceptin (0,2%) (Herceptin lægemiddel udgave). Zeta-potentialer ved pH 7.5 Var i denne rækkefølge -5.2 ± 0,4 mV, -5.7 ± 0,6 mV, og -4.1 ± 0,4 mV. Det bør nævnes, at den målte hydrodynamiske diameter af nano-konjugater ikke fulgte additive diametre målt for frie komponenter.
Levering af nano lægemiddel gennem tumorcellemembranen og frigivelse i cytoplasmaet efter 0 timer og 3h r
Leveringen af nano lægemiddel gennem cellemembranen ved endosom optagelse er vist i fig ure 6 efter 0 timer og 3 timer. Fluorescensmærker er knyttet til nano drug platform (Alexa Fluor 680, grøn) og AON (lissamin, rød). Deres superposition er vist i paneler D & L og sammen med fluorescens af mærkede endosomes (blå) i paneler G & O. Pearsons korrelationskoefficienter (R (R) blev beregnet ud fra de billeder, vedrørende co-lokalisering af platform / endosomes Aon / endosomer, platform / AON til 0 timer og 3 timer. Than 3 timer billede anført frigivelse fra endosomer i cytoplasmaet og dissociation af AON fra nano stof af glutathion-afhængige disulfidspaltende i cytoplasmaet.
Figur 6. Konfokal mikroskopi nano konjugat optagelse af målceller (tilpasset fra Ding et al. 11). Celler blev inkuberet i 30 minutter ved 37 ° C med nano lægemiddel, der havde været dobbelt mærket med Alexa Fluor 680 (grøn) på polymeren platform og med Lissamin (rød) fastgjort AON. Desuden blev endosomer farvet med FM1-43 (blå). Lokalisering vises efter 0 time (A) og 3 timer (B) inkubation. Paneler A, AB, & B, ij viser farvning af nano konjugerede fluorophores alene, ogderes co-lokalisering i A, cd & B, kl. Derudover er farvning af endosomer vist i panel A, e & B, m og co-lokaliseringstoppe af nano konjugat og endosomesin paneler A, fg & B, no. Paneler A, h & B, s. show fasekontrast for de respektive paneler. (C) Pearsons korrelationskoefficient R (R) for colokalisering af platform-endosomes Aon-endosomes, platform-AON beregnet for 0 timer og 3 timer. Klik her for at se en større version af dette tal.
Inhibering af human brystcancer in vitro og in vivo
In vitro vækst hæmning af HER2 cellelinie BT-474 i comsammenligning med lav udtrykkende cellelinie MDA-MB-231 er vist i fig ure 7. Graden af hæmning er 50% og 30% af henholdsvis den ledende nano konjugat P / MPEG / Loet / AON HER2 / Herceptin / anti-MsTfRmAb. Inhibering af de andre forbindelser er mindre, men højere for BT-474 end for MDA-MB-231-celler. BT-474 cellelinie blev valgt til behandling af xenogent brystkræft mus.
Figur 7.. In vitro vækst hæmning af HER2 BT-474 brystkræftceller og lav udtrykker MDA-MB-231 celler (tilpasset fra Inoue et al. 12). Sammenligning af væksthæmning for HER2 BT-474 brystcancercellelinie ( venstre) og HER2 lav udtrykke brystcancercellelinie MDA-MB-231 (til højre). TFR (r) betegner anti-MsTfRmAb og TFR (Hu / Ms) angiver anti-HuTfRmAb & anti-MsTfRmAb. Den ledende nano stof, P / MPEG / Loet / AON HER2 / Herceptin / TFR (MS), og nano narkotika blottet for enten Herceptin eller AON HER2 sammenlignes med PBS, Herceptin og AON HER2. I mangel af Herceptin blev anti-MsTfRmAb konjugeret til at give endosome optagelse af tumorcellerne. Koncentrationer var 40 pg / ml med hensyn til antistoffer, 4 uM med hensyn til AON HER2, 4 uM endoporter (anvendelse af AON). Betydning betegnet med *, P <0,05: ** P <0,02: ***, P <0,003 sammenlignet med PBS.
Resultaterne af in vivo-behandling i figur 8 præsenteres for mus med BT-474 HER2 human brystkræft. Væksten blev hæmmet> 95% af den ledende nanodrug indeholdende Herceptin og HER2-specifik AON i forhold til kontroller behandlet kun med PBS (Fig URE 8). Hæmningvar 60% eller mindre med Herceptin alene, P / MPEG / Loet / Herceptin eller P / MPEG / Loet / AON / anti-MsTfRmAb / anti-HuTfRmAb. Western blot-analyse af tumorekstrakter hæmning af både HER2 syntese og Akt fosforylering, men ingen ændring af den samlede Akt og housekeeping enzym GAPDH. PARP blev kløvet i korrespondance med et forhøjet niveau af apoptose. Billeder af tumor efter behandling og vævssnit farvet med H & E illustrerer tumorregression er vist i fig ure 9.
Figur 8.. Tumorstørrelse og proteiner under behandling med bly og prækursorer nano lægemidler (tilpasset fra Inoue et al. 12). A. Tumorstørrelse for de forskellige behandlinger (dag 21 til dag 42, i alt 8 injektioner). Bjælker angiver standardafvigelser fra middelværdien. Den ledende konjugeret med anti-HER2 AON og Herceptin var overlegen i forhold til enten Herceptin alene eller enkelt lægemiddel, der indeholder nano-konjugater. B. Effekten af de forskellige behandlinger på ekspression af HER2, phosphoryleret Akt, total Akt, PARB, spaltes PARB og GAPDH vist ved western blotting. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 9. Behandling af HER2-positiv BT-474 human brystkræft på nøgne mus. Tumorregression og nekrose / apoptose i vævssnit (tilpasset fra Ionue et al. 12). Øvre: Svind af tumoren (røde pile). Angivelse af østrogen pille at understøtte tumorvækst (blå pil). Lower: Hematoxilin & Eosin (H & E)-farvning af tumorsektioner. Prolifererende tumor er vist ved den tætte pakning af tumorceller. Nekrotisk væv er set, hvor tumorceller er blevet elimineret. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Den eksperimentelle vej til fremstilling af nano medicin fra en bionedbrydelig naturlig polymer præsenteres som kan anvendes i syntesen af personaliseret medicin. Beskrivelsen starter med kontrolleret produktion og oprensning af polyæblesyre, som er en alsidig platform for nano drug syntese. Brug reproducerbare teknikker polymeren opnås med høj molekylvægt og i ekstrem renhed egnet til farmaceutiske synteser. Syntesen er beskrevet for en nano stof, der er vist til effektivt at behandle brystkræft HER2-positiv. Beskrivelsen kan omsættes til synteser af de fleste andre nano lægemidler til behandling af cancer. Målretning involverer antistoffer, såsom Herceptin, som binder et tumor-specifikt antigen, såsom HER2-protein eller en anden tumormarkør, der er effektivt internaliseres. Nano drug leverer et udvalg af antisense-oligonukleotider og kemoterapeutika, som effektivt hæmmer væksten af kræft under threeatment. I eksemplet Herceptin binding til HER2 og specifik antisense oligonukleotidannealing med HER2-kodende mRNA resulterede i vedvarende blokering af HER2-signalering og alvorlig reduktion af brystkræft HER2-positiv. Baseret på den underliggende princip om målretning og hæmning af genekspression ved antisenseoligonukleotider tumor har vi til dato syntetiseret adskillige andre nano narkotika og held hæmmede prækliniske menneskelige glioblastom og brystkræft triple-negative 11,14-18.
Den syntetiske arbejde starter med fremstillingen af højt oprenset nano drug platform, som er polyæblesyre fra kultursupernatanten af Physarum polycephalum (en art af "slimsvamp" familie). Fremstillingen understreger høje molekylvægte af polymeren i princippet muliggør fastgørelse af mange antistoffer, peptider, oligonukleotider og andre molekyler, der fungerer i aktiv drug delivery og hæmning af tumorvæksten. Following kontrolleret dyrkning og rensning, er blevet produceret reproducerbar kvalitet af polymer i forudsigelige udbytter. Polymeren opbevares under praktiske forhold til enhver tid.
Syntesen af PMLA nano konjugater begynder med kemisk aktivering af polymer-vedhæng carboxylater udføres i et par syntetiske trin. Mellem trin, kan syntese placeres valgfrit på hold tillader fremstilling af vilkårlige mængder af mellemprodukter og således kan anvendes i op skalering. Forløbet af syntesen følges ved TLC og sec-HPLC, og både sammensætning og aktivitet af nano lægemidlet styres af gruppe-specifikke kvantitative kemiske assays, ELISA, og en række fysiske målinger. Vores erfaring er, at disse synteser er blevet skredet jævnt og reproducerbart med fremragende udbytter og renhed. Ved at vælge specificitet af antistof og antisenseoligonukleotider enhver variant af nano stof er positivt syntetiseret efter behov i personalized medicin.
De nærmere betingelser for en vellykket behandling af human brystkræft HER2-positiv er gyldige repræsentanter for udarbejdelse af mus kræftmodeller, anvendelse af nano medicin, billedbehandling og analyse af tumorvækst. Resultaterne af in vitro levedygtighed test er nyttige i at vælge den cellelinje og førende lægemiddel, der skal anvendes i dyreforsøg. In vivo Xenogen billeddannelse validerer, at nano stof faktisk er leveret i tumoren. Resultater af western blotting afslører, om niveauet for visse proteiner reagerede i den forudsagte mode under kræftbehandling. Måling af tumorstørrelse informerer om behandlingens succes, dvs omkring hæmning, recession eller regression. Det beskrevne eksempel afspejler vores erfaringer med andre polyæblesyre-baserede nano lægemidler indikerer en høj grad af forudsigelighed, reproducerbarhed og fravær af bemærkelsesværdige toksicitet. De seneste resultater på toksicitet og effekt af flere targeted polyæblesyre konjugater til triple-negativ brystkræft behandling er i stærk støtte af dette begreb 18.. En vigtig funktion er, at vores nano stof er i stand til at trænge bio-barrierer: endotel barriere af ekstravasation i tumoren interstitielle tumoren cellemembran ved endosom optagelse samt endosom membran afbrydelse af virkningen af leucin-ethylester eller trileucine grupper. Ekstravasation og endosome optagelse pålideligt opnås ved de specifikke antistoffer knyttet til nano stof. Anti-muse transferrin receptorantistof medierer effektiv indstrømning i tumoren ved transcytose, sandsynligvis fordi receptoren er overudtrykt i de fleste tumorvaskulatur. Et andet antistof bundet på samme nano konjugatmolekyle funktioner specifikt dirigere nano lægemidlet i modtageren tumorcelle. Tilstedeværelsen af begge antistoffer, er afgørende for optimal funktion en for transcytose og den anden til endosom optagelse. Kvantitativ analyse af mAlic syre og antistof anbefales for at kontrollere optimale sammensætning af nano lægemidlet. Endelig skal det bemærkes, at den alt-i-én kovalente nano drug leverer stof i kemisk vedlagte tilmeldingsblanket undervejs gennem værten karrene i modtagerens tumor celle. Kemisk vedhæftet gør de fleste lægemidler inaktive (prodrugs), indtil de er rekonstitueret som frie lægemidler ved spaltning fra nano konjugat platform på målrettet websted. Dette er vigtigt, fordi reaktivering modalitet giver en høj grad af sikkerhed under leveringen og en minimal chance for at fremkalde skadelige bivirkninger. Alsidighed, effektivitet og sikkerhed er uundværlige egenskaber af god personlig medicin.
Disclosures
Forfatterne Julia Y. Ljubimova, Keith L. Sort, og Eggehard Holler er aktionærer i Arrogene Technology Inc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Mercapto-1-ethylamine (Cysteamine; 2MEA) | Sigma-Aldrich | 30078-25G | |
| 4’,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Vector Laboratories, Burlingame, CA | ||
| 90-Day release 17β-estradiol pellet | Innovative Research of America | ||
| Alexa Fluor 680 C2 maleimide | Invitrogen | A20344 | |
| Amberlite IR 120H | Sigma-Aldrich | 6428 | |
| Antifoam Y-30 Emulsion | Sigam-Aldrich | A5758 | |
| Anti-laminin-411 chain mAbs | Santa Cruz | SC-59980 | |
| Anti-pAkt mAb | Cell Signalling | 9271S | |
| Anti-PARB mAb | BD Biosciences | 556494 | |
| Anti-von Willebrand Factor antibody | Abcam | AB6994 | |
| Bacto Yeast Extract | Bacto, Dickinson/Sparks, MD | 212720 | |
| Beta-actin | Cell Signalling | 3700 | |
| BT-474 | ATCC | HTB-20 | |
| Calcium Carbonate | Alfa Aesar | 36337 | |
| Cell Proliferation Assay kit | Promega, Madison, WI, USA | PR-G3580 | |
| Centriplus 100 | Millipore | 4414 | |
| Dicyclohexylcarbodimide | Fluka | 36650 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Eosin | Cardinal Health | S7439-4 | |
| Galardin (MMP-inhibitors) | Santa Cruz | SC-994 | |
| GAPDH | Cell Signalling | 2118 | |
| Hematoxilin | Cardinal Health | S7439-3 | |
| Hemin from porcine | Sigma-Aldrich | 51280 | |
| Herceptin | Genentech | 15534 | |
| Herceptin (Western blotting) | Cell Signalling | 2165S | |
| IgG2a-kappa murine malignoma | Sigma | M77695X5m | |
| Immun-Star AP Substrate Pack | Biorad | 170-5012 | |
| Immun-StarTM AP Substrate Pack | Biorad | 170-5012 | |
| LAL Reagent water | Lonza, MD | W50-1000 | |
| Laminin-411 mAbs | Abcam | ||
| Leucine ethyl ester (LOEt) | Sigma-Aldrich | 61850-10G-F | |
| Limulus Amebocyte Lysate (LAL) PYROGENT-5000 tests | Cambrex BioScience | N384 | |
| Lissamin-Morpholino AON | Gene Tools | Custom made | |
| L-malic acid | Sigma-Aldrich | M6413 | |
| Malate dehydrogenase | Sigma-Aldrich | M2634 | |
| Mal-PEG-Mal | Laysan | mal-PEG-mal-3400 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354248 | |
| Milk, nonfat powdered | Proteomics | M203-10G | |
| Morpholino oligonucleotides | GeneTools | custom made | |
| mPEG5000 | Lysan | mPEG-NH2-5000 | |
| N-hydroxysuccinimde (NHS) | ACROS Organics | 15727100 | |
| Ninhydrin | Merck | 1.06762.0100 | |
| Nitrocellulose Membrane Filter Paper Sandwich | Invitrogen | LC2001 | |
| Nitrocellulose Membrane Filter Paper Sandwich, 0.45 µm | Invitrogen | LC2001 | |
| Novex ® Tris-Glycine Transfer Buffer (25x) | Invitrogen | LC3675 | |
| Nude Mice [Tac:Cr:(MCr)-Foxnnm] | Taconic | ||
| PBS pH 7.2 10x | Gibco | 10010-49 | |
| PBS pH 7.2 1x | Gibco | 70013 | |
| PD-10 desalting columns | GE Healthcare | 17-0851 | |
| Physarum polycephalum M3CVII | ATCC | 204388 | |
| Pierce BCA protein assay | Thermo Scientific | 23225 | |
| Protease inhibitor cocktail | Roche | 1.18362E+11 | |
| Protein Detector ELISA Kit | KPL | 54-62-18 | |
| Sephadex G-25 superfine | GE Healthcare | 17-0031 | |
| Sephadex G-75 | GE Healthcare | 17-0050 | |
| Sephadex-LH20 | GE Healthcare | 17-0090 | |
| SKBR-3 | ATCC | HTB-30 | |
| SPDP | Proteochem | C1116 | |
| Streamline-DEAE | GE Healthcare | 17-0994 | |
| Styryl Red FM 1-43 | Life Technologies | T-3163 | |
| TBS 10x | Bio-Rad | 170-6435 | |
| TCEP | Sigma-Aldrich | C4706-2G | |
| TLC, silica coated aluminia sheets | Merck, Darmstadt, DE | 60F254 | |
| Trileucine (LLL) | Bachem | H-3915 | |
| Triton X-114 | Sigma-Aldrich | X114 | |
| Tween®20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| Vivaspin 20 | VWR | 14005-302 | |
| DAPI | Vector Laboratories, Burlingame, CA | ||
| Dexmedetomidine | Pfizer | ||
| Atipamezole | Pfizer | ||
| Carprofen | Pfizer | ||
| Betadine | Foster and Smith, Wisconsin |
References
- Koboldt, D. C., Fulton, R. S., McLellan, M. D. Comprehensive molecular portraits of human breast tumors. Cancer Genome Atlas Network. Nature. 490, 61-70 (2012).
- Kwong, L. N., Costello, J. C., et al. Oncogenic NRAS signaling differentially regulates survival and proliferation in melanoma. Nat. Med. 18, 1503-1510 (2012).
- Gerlinger, M., Rowan, A. J., et al. Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing. N. Engl. J. Med. Gerlinger, M., Rowan, A. J. 366, 883-892 (2012).
- Yap, T. A., Workman, P. Exploiting the cancer genome: strategies for the discovery and clinical development of targeted molecular therapies. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 52, 549-573 (2012).
- Chatterjee, S. Cancer Biomarkers: Knowing the Present and Predicting the Future. Future Oncol. 1, 37-50 (2005).
- Suh, K. S., Sarojini, S., Youssif, M., et al. Tissue Banking, Bioinformatics, and Electronic Medical Records: The Front-End Requirements for Personalized Medicine. J. Oncology. , (2013).
- Ljubimova, J. Y., Holler, E. Biocompatible nanopolymers: the next generation of breast cancer treatment. Future Medicine, Nanomedicine. 7, 1-4 (2012).
- Lee, B. -S., Vert, M., Holler, E. Water-soluble aiphatic polyesters: poly(malic acid)s. Biopolymers 3a. Steinbüchel, A. , Wiley VCH. Weinheim (Bergstrasse). 75-103 (2002).
- Lee, B. -S., Fujita, M., et al. Polycefin, a new prototype of multifunctional nanoconjugate based on poly(beta-L-malic acid) for drug delivery. Bioconjugate Chem. 17, 317-326 (2006).
- Nag, A., Mitra, G., et al. A colorimetric assay for estimation of polyethylene glycol and polyethylene glycolated protein using ammonium ferrothiocyanate. Analytical Biochem. 237, 224-231 (1996).
- Ding, H., Inoue, S., et al. Inhibition of brain tumor growth by intravenous poly(beta-L-malic) acid nanobioconjugate with pH-dependent drug release. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 18143-18148 (2010).
- Inoue, S., Ding, H., et al. Nanobioconjugate inhibition of HER2/neu signaling and synthesis provides efficient mouse breast cancer treatment. Cancer Research. 71, 1454-1464 (2011).
- Maeda, H., Sawa, T., Konno, T. Mechanism of tumor-targeted delivery of macromolecular drugs, including the EPR effect in solid tumor and clinical overview of the prototype polymeric drug SMANS. J. Control. Release. 74, 47-61 (2001).
- Ljubimova, J. Y., Fujita, M., Ljubimov, Y. J., et al. Poly(malic acid) nanoconjugates containing various antibodies and oligonucleotides for multitargeting drug delivery. Nanomed. 3, 247-265 (2008).
- Inoue, S., Patil, R., Portilla-Arias, J., et al. Novel nanobioconjugate inhibiting EGFR expression in triple negative breast cancer. PLoS One. 7, 1-9 (2012).
- Patil, R., Portilla-Arias, J., Ding, H., et al. Cellular Delivery of Doxorubicin via pH-Controlled Hydrazone Linkage Using Multifunctional Nano Vehicle Based on Poly(β-L-malic Acid). Int. J. Mol. Sci. 13, 11681-11693 (2012).
- Patil, R., Portilla-Arias, J., Ding, H., et al. Temozolomide delivery to tumor cells by a multifunctional nano vehicle based on poly(β-L-malic acid). Pharm. Res. 27, 2317-2329 (2010).
- Ljubimova, J. Y., Portilla-Arias, J., Patil, R., et al. Toxicity and efficacy evaluation of multiple targeted polymalic acid conjugates for triple-negative breast cancer treatment. J. Drug Target. 21, 956-967 (2013).
