En protokol er beskrevet, der bruger Illumina s Infinium assays til at udføre storstilet genotypebestemmelse. Disse analyser kan pålideligt genotype millioner af SNPs tværs af hundredvis af enkelte DNA-prøver i tre dage. Når der genereres, kan disse genotyper bruges til at kontrollere for foreninger med en række forskellige sygdomme eller fænotyper.
Genotypebestemmelse varianter i det menneskelige genom har vist sig at være en effektiv metode til at identificere genetiske foreninger med fænotyper. Fordelingen af varianter inden for familier eller befolkningsgrupper kan lette identifikationen af de genetiske faktorer for sygdommen. Illumina panel af genotypebestemmelse BeadChips giver efterforskerne at genotype tusinder eller millioner af enkelt nukleotid polymorfier (SNP), eller til at analysere andre genomiske varianter, såsom kopiere nummer, på tværs af et stort antal DNA-prøver. Disse SNPs kan spredes over hele genomet eller målrettet i specifikke regioner med henblik på at maksimere potentialet opdagelse. Den Infinium analysen er optimeret til at give høj kvalitet og præcise resultater hurtigt. Med korrekt opstilling kan en enkelt tekniker behandle fra nogle få hundrede til over tusind DNA-prøver per uge, afhængigt af typen af matrix. Denne analyse guider brugeren gennem alle trin, startende med genomisk DNA og slutter med scanning af array. Brug sømmelighed ReageNTS der prøver forstærkes, fragmenteret, udfældet, resuspenderet, hybridiseret til chippen, forlænges med en enkelt base, farves, og scannet på enten en iScan eller Hi Scan høj opløsning optisk imaging system. Én overnight trin er nødvendigt at forstærke DNA. DNA denatureres og isotermisk amplificeret ved hel-genom-amplifikation og derfor er ingen PCR påkrævet. Prøver hybridiseres til arrays løbet af en anden natten trin. Ved den tredje dag er prøverne klar til at blive scannet og analyseres. Amplified DNA kan oplagres i store mængder, så perle arrays til at blive behandlet hver dag i ugen og dermed maksimere gennemløb.
Typing enkelt nukleotid polymorfier (SNP) er en vigtig metode til at identificere varianter risiko forbundet med sygdommen. Historisk set er omfanget af genotypebestemmelse eksperimenter været begrænset af den tilgængelige teknologi. Gelelektroforese-baserede genotypebestemmelse metoder er begrænset i sample-and SNP-throughput [1]. Udvikle disse analyser kan ofte være arbejdskrævende, stole på makeup og struktur i regionen omkring variant for optimering [1]. TaqMan genotypebestemmelse assays, udviklet af Life Technologies, kan køre et stort antal prøver hurtigt og med minimal tekniker involvering [2], men SNP-multiplexing restriktioner fortsat at begrænse det samlede antal genotyper til godt under en million om dagen [3,4 ]. Sequenom s IPLEX platform kan også køre mange prøver på en gang, men som færre end hundrede SNPs kan multiplekses sammen, gennemløb er forholdsvis lav samlet [5]. Beckman Coulter s SNP stream teknologikunne teoretisk producere mere end tre millioner genotyper per dag, men denne teknologi grænser projekt rækkevidde til et maksimum på kun otteogfyrre SNPs pr reaktion [4,6]. Mens GoldenGate analysen kan behandle næsten to hundrede DNA-prøver hver dag på hundredvis eller tusindvis af SNPs per prøve, prisen pr genotype ikke er konkurrencedygtig med avancerede, ultra-high-throughput-teknikker, når du skriver over tre tusinde SNPs på én gang [4,7 ]. For at kunne behandle flere millioner genotyper per dag, det nødvendige omfang for store genom-dækkende forening undersøgelser, har matrix-hybridiseringsanalyser blive den mest omkostningseffektive løsning på markedet.
Affymetrix linje af hybridisering arrays og Illumina linje af Infinium-baserede arrays tillader potentielt hundredvis af prøver, der skal skrives på hundreder af tusinder eller millioner af SNPs parallelt [4,8]. Disse SNPs kan være spredt over hele genomet, lokaliseret i regioner af interesse, såsom exomes, eller tilpasset til brugerens præferencer. Disse arrays har den fordel ikke kun at være i stand til præcist genotype en million SNPs per prøve på én gang, men også for at måle kopital variation potentielt afsløringen kromosomafvigelser. Infinium alliancefri OMNI BeadChip arrays i øjeblikket har mulighed for at genotype op til næsten fem millioner markører pr prøve, herunder en halv million brugerdefineret loci, på op til næsten et hundrede prøver hver dag.
Da de fleste sygdomme har en genetisk komponent, kan disse storskalaforsøg være afgørende i at finde gener forbundet med sygdom. High-throughput genotypebestemmelse giver mulighed for en effektiv genotype generation i prøve sætter stor nok til overbevisende afsløre genetisk association ved lavere mindre allelfrekvenserne. Hel-genom genotypebestemmelse projekter kan bruges til at lokalisere områder med statistisk signifikant case-control allelfrekvens eller kopital forskelle [9,10,11]. Ifølge National Menneskelige Genome Research Institute, genom-dækkende forening undersøgelser førte til 1.490 separate publikationer mellem November 25, 2008 og 25 januar 2013, stammer fra opdagelsen af 8.283 SNPs med en p-værdi mindre end 1 x 10 -5 (se http:// www.genome.gov/gwastudies/). Disse undersøgelser, der forsket vilkår spænder fra højden til testikelkræft, nydt godt af den brede tilgang ydes af en genom-dækkende analyse. I tilfælde som disse, måske hele regioner af interesse have undsluppet varsel havde omfanget af maskinskrivning været for restriktive. Således for store forening analyser, et genom-dækkende genotypebestemmelse teknik er teknik valg.
Forskellige versioner af Infinium analysen findes, hver beregnet til brug med specifikke typer af arrays. Den InfiniumUltra assay, drøftet indgående nedenfor, er egnet til mange 12 – eller 24-sample-chips. Disse ofte genotype over et hundrede tusinde SNPs pr DNA-prøve og fokusere på targeted regioner, såsom på exome eller brugerdefinerede paneler. Kan være påkrævet Andre assay versioner til andre chip typer, såsom de hel-genom genotypebestemmelse arrays. Men som alle Infinium analyser deler et fælles grundlag, og adskiller sig primært kun af reagens navne, reagensvolumener, eller den nøjagtige farvningsreagens procedure, teknikker perfektioneret på en assay-versionen kan ofte anvendes universelt. Andre arrays, såsom methylering arrays, kan bruge en næsten identisk protokol, så godt. Der skal udvises omhu til kun at bruge den version af assayet nødvendige for chip type brug. Nogle typer, såsom dem, der måler genekspression niveau, kan kræve brug af en nonInfinium protokol.
Prøverne skal behandles i partier. For eksempel med InfiniumUltra assay præhybridisering reagensglas indeholder tilstrækkeligt volumen til at køre 96 prøver, og rørene kan ikke genfryses. Derfor skal prøverne køres i partier af 96 prøver ad gangen. Prøverne vil blive forstærket på granert dag. Efter ca 1 time af benchwork, skal prøven opvarmes i en varmluftovn i 20-24 timer. Den følgende dag, næsten 4 timer blive brugt fragmentering, udfældning og resuspendere prøverne, på hvilket tidspunkt prøverne kan enten fryses til fremtidig brug eller hybridiseret til chippen. Henter chips tager næsten 2 timer, hvorefter prøverne vil blive hybridiseret natten over 16-24 timer. På den tredje dag, farvningen og udvidelse skridt tager ~ 4 timer. En yderligere en time vil blive brugt vask, belægning og tørring af chips. Endelig er arrays scannet, hvilket kan tage fra 15 til 60 min / chip, afhængigt af den anvendte type.
Standard laboratorium sikkerhed og renlighed forholdsregler gælder. Selvom amplifikation ikke PCR-baseret, er det nødvendigt separate arbejdsstationer til præ-og postamplification procedurer for at minimere sandsynligheden for forurening. Identifikationsnummeret på hver kit leveret reagens i brug skal være logget på en tracking ark. ReageNTS skal optøs umiddelbart før brug og omvendt flere gange før dispensering. DNA'et, der skal skrives, skal være af høj kvalitet genomisk DNA (260/280 absorbans forholdet 1,6-2,0, 260/230 absorbans forhold på under 3,0) isoleret ved standardmetoder og kvantificeres med et fluorometer. Nedbrydning af DNA ofte er en medvirkende faktor i lav kvalitet analyseresultater. Typisk er 200 ng DNA, der kræves, men dette beløb kan variere for nogle chiptyper. En Tecan væske-håndteringsrobot kan automatisere mange trin i protokollen og minimere menneskelige fejl som en faktor.
Storstilet genotypebestemmelse applikationer er blevet brugt til bedre at forstå den genetiske mekanisme bag mange menneskelige sygdomme. Opdagelsen af nogen væsentlig variant gennem en genom-dækkende forening analyse kan afmærke en kandidat region for yderligere undersøgelse. Desuden genotype data er et godt redskab til kvalitetskontrol på sekventering projekter.
For at maksimere prøve gennemløb, kan flere prøveplader blive forstærket og gemt i deres fragmenterede, resuspenderet stater. Otte pladerne kan forstærkes på en enkelt dag, der kombinerer den første 24 timers af protokollen for flere partier og give nok materiale til ~ 2-8 dage af chip-bearbejdning. Hvis forstærkede plader oplagret på forhånd, og hvis nye prøver hybridiseres til chips straks efter scanningen begynder på tidligere løb, kan behandlingen køre kontinuerligt uden behov for at holde pause for yderligere prøveforberedelse. Derfor vil selvom prøverne tage tre dage at gennemgå den fuldstændigeassay kan data genereres dagligt. Assuming24 chips behandles hver dag, en 5 dages arbejdsuge giver mulighed for mere end en 1.000 DNA-prøver, der skal køres på en 12-prøve perle chip. Hvis nogen skridt eller reagens mislykkedes dog muligvis flere partier være i risiko for dårlige resultater, før nogen korrektion kan anvendes. Fejl kan slippe varsel, indtil arrays scannes eller analyseres, og derfor hvis gennemløb er maksimeret, hundredvis af prøver i forskellige stadier af protokollen måske allerede har modtaget den samme defekt behandling efter opdagelsen. Som mistede reagenser og data ikke kan inddrives, skal brugeren afveje disse risici i forhold til behovet for en hurtigere arbejdsgang.
Den GenomeStudio analyse software er den første chance for virkeligt at måle succesen af genotypebestemmelse processen. Hvis Norm-R vs Norm-Theta intensitet plots er korrekt grupperet, skal den gennemsnitlige takst (procent af samlet SNPs succes indtastes) af prøverne nærmer 99%, selv om denne værdi varierer SLIghtly afhængig matrix type. Dataene fra en prøve med en opfordring lavere end 85-90% er ikke troværdige og bør kasseres. For kvalitetskontrol formål skal resultaterne ses i forhold til alle tidligere kendte genotyper muligt. Hvis der ikke findes sådanne oplysninger, forsætlig prøve dobbeltarbejde er et nyttigt redskab i at kontrollere plade eller array-placeringer. Disse to eksemplarer par bør placeres på separate chips, plader, batches, eller projekter, deres genotyper tjekket ved generation. Mens specifikke QC begrænsninger varierer efter investigators præference er almindelige SNP begrænsninger baseret på stikprøve opkald succes, Hardy-Weinberg ligevægt, eller missingness mellem cases og kontroller, mens de fælles prøve begrænsninger er baseret på takster, mendelske uoverensstemmelser eller krydshenvisninger X-kromosom heterozygositet kliniske køn data [13].
Opstår der problemer, Kontrolelementer Dashboard, der findes i analysen suite, kan indsendes tilselskab med henblik på at fastslå årsagen. Disse kontroller kan ofte indsnævre problemet til den mest sandsynlige trin eller reagens fiasko. Hvis der SNPs af interesse findes gennem en Infinium genotypebestemmelse eksperiment, deres intensitet plots være dobbelt-tjekket i GenomeStudio for klyngedannelse fejl, før yderligere forskning gennemføres.
En mislykket Infinium genotypebestemmelse eksperiment skyldes sandsynligvis forarbejdning fejl menneskers eller dårlig kvalitet input DNA. Prøve kvantificering skal være korrekte og præcise. For de bedste resultater, eventuelle reagenser tilsættes en stikprøve eller chip skal hældes på lydstyrken sat af protokollen. Pipetter skal være behørigt kalibreret. Reagenserne bør ikke løbe efter udløbet og bør ikke genfryses Optøede, bortset fra RA1 reagens. For at minimere eventuelle farvning og udvidelse fejlene bør formamid / EDTA-blanding fremstilles frisk hver måned. Alle -20 ° C reagenser skal opbevares i kun manuel afrimning frysere. Alt laboratorieudstyr anvendt i staining bør udvidelse, og vaske dele af protokollen skal skylles grundigt med vand og et mildt rengøringsmiddel straks efter ude af brug. Befugtningsopløsningen reservoirer i hyb kammer skal skrubbes med et reagensglas børste og et mildt rengøringsmiddel. De objektglas skal vaskes med 10% blegemiddel, efter instruks fra deres brugermanualer, en gang om ugen.
The authors have nothing to disclose.
Finansieringen af dette arbejde er blevet leveret af NIH P20 GM103456, NIH RC2 AR058959 og NIH R56 AI063274
Consumable or Equipment | Manufacturer | Part Number | Minimum Required for 96 Samples |
0.8 ml Deep Well Plate | Thermo Scientific | AB-0765 | 1 |
Plate Mats | Thermo Scientific | AB-0674 | 2 |
Reagent Basin | Fisher Scientific | 13-681-502 | 9 |
Heat-seal Sheets | Thermo Scientific | AB-0559 | 1 |
Flow-through Spacer | Fisher Scientific | NC9563984 | 6 |
Pipette tips – 200 μl | Rainin | GP-L200F | 192 |
Pipette tips – 10 μl | Rainin | GP-L10F | 16 |
Pipette tips – 1,000 μl | Rainin | GP-L1000F | 16 |
DNA Suspension Buffer | Teknova | T0220 | 0.5 ml |
0.1 N NaOH | Fisher Scientific | AC12419-0010 | 0.5 ml |
Isopropanol (HPLC grade) | Fisher Scientific | A451 | 15 ml |
Ethanol (200-proof) | Sigma-Aldrich | 459836 | 330 ml |
Formamide (100%) | Thomas Scientific | C001K38 | 15 ml |
EDTA (0.5 M) | Amresco | E177 | 0.2 ml |
10 μl 8-channel Pipette | Rainin | L8-10XLS | 1 |
200 μl 8-channel Pipette | Rainin | L8-200XLS | 2 |
1,000 μl Single-channel Pipette | Rainin | L-1000XLS | 1 |
Microplate Shaker | VWR | 13500-890 | 1 |
Refrigerated Microplate Centrifuge | VWR | BK369434 | 1 |
Hybridization Oven | Illumina | SE-901-1001 | 1 |
Hybex Microsample Incubator | SciGene | 1057-30-0 | 1 |
Hybex MIDI Heat Block Insert | Illumina | BD-60-601 | 1 |
Heat Sealer | Thermo Scientific | AB-0384 | 1 |
Hyb Chamber w/ Insert and Mat | Illumina | BD-60-402 | 2 |
Surgical Scissors | Fisher Scientific | 13-804-20 | 1 |
Flow Through Assembly Parts | Illumina | WG-10-202 | 8 |
Wash Rack and Dish | Illumina | BD-60-450 | 1 |
Genepaint Chamber Rack | Tecan | 760-800 | 1 |
Temperature Probe | Illumina | A1-99-109 | 1 |
Staining Rack and Dish | Illumina | WG-10-207 | 1 |
Self-Closing Tweezers | Ted Pella, Inc | 5374-NM | 1 |
Vacuum Manifold | Ted Pella, Inc | 2240 | 1 |
iScan or HiScan | Illumina | – | 1 |