Ett protokoll beskrivs som använder Illumina s Infinium analyser att utföra storskalig genotypning. Dessa analyser kan tillförlitligt genotyp miljoner SNP över hundratals enskilda DNA-prov i tre dagar. En gång skapats kan dessa genotyper användas för att kontrollera för föreningar med en mängd olika sjukdomar eller fenotyper.
Genotypning varianter i det mänskliga genomet har visat sig vara en effektiv metod för att identifiera genetiska associationer med fenotyper. Fördelningen av varianter inom familjer eller populationer kan underlätta identifiering av de genetiska faktorerna till sjukdom. Illumina s panel av genotypning BeadChips låter utredare till genotyp tusentals eller miljontals single nucleotide polymorphisms (SNP), eller för att analysera andra genomiska varianter, till exempel antal kopior, över ett stort antal DNA-prover. Dessa SNP kan spridas över hela genomet eller riktade i specifika områden för att maximera potentialen upptäckt. Den Infinium analysen har optimerats för att snabbt ge hög kvalitet, korrekta resultat. Med rätt inställning, kan en enda tekniker bearbeta från några hundra till över tusen DNA-prov per vecka, beroende på vilken typ av matris. Denna analys guidar användaren genom varje steg, med början med iskt DNA och slutar med skanning av arrayen. Använda propriety Reagents, prover förstärks, fragmenterad, fälls, suspenderas, hybridiserade till chip, förlängas med en enda bas, färgas, och skannas på antingen en iScan eller Hi Scan högupplösta optiska bildsystem. En övernattning steg krävs för att förstärka DNA. DNA denatureras och isotermt förstärks av hel-genom förstärkning, och därför är ingen PCR behövs. Proverna hybridiseras till uppsättningarna under en andra över natten steg. Genom den tredje dagen, proverna är redo att skannas och analyseras. Amplified DNA kan lagrade i stora mängder, vilket gör pärla arrayer som ska behandlas varje dag i veckan och därmed maximera genomströmningen.
Skriva single nucleotide polymorphisms (SNP) är en viktig metod för att identifiera riskvarianter i samband med sjukdom. Historiskt sett har omfattningen av genotypning experiment begränsats av tillgänglig teknik. Gelelektrofores-baserade genotyping metoder är begränsade i samplings-och SNP-throughput [1]. Att utveckla dessa analyser kan ofta vara arbetsintensiv, att förlita sig på smink och strukturen i regionen som omger varianten för optimering [1]. TaqMan genotypning analyser, som utvecklats av Life Technologies, kan köra ett stort antal prover snabbt och med minimal tekniker engagemang [2], men SNP-multiplexering begränsningar fortsätter att begränsa det totala antalet genotyper till väl under en miljon per dag [3,4 ]. Sequenom s IPLEX plattform kan också köra många prover på en gång, men som färre än hundra SNP kan hopmultiplexerade, är genomströmningen jämförelsevis låg total [5]. Beckman Coulter s SNP stream-teknikkan teoretiskt producera över tre miljoner genotyper per dag, men den här teknikens gränser projektområde till maximalt bara fyrtioåtta SNP per reaktion [4,6]. Medan Goldengate-analysen kan behandla nästan tvåhundra DNA-prover varje dag på hundratals eller tusentals SNP per prov, inte konkurrera med avancerade, ultra-high-throughput tekniker priset per genotyp när du skriver över tre tusen SNP på en gång [4,7 ]. För att behandla flera miljoner genotyper per dag, den omfattning som krävs för stora genomet hela föreningen studier har array-hybridiseringsanalyser blivit det mest kostnadseffektiva alternativet på marknaden.
Affymetrixs linje hybridisering matriser och Illumina linje Infinium-baserade matriser tillåter potentiellt hundratals prover som skall skrivas på hundratusentals eller miljontals SNP parallellt [4,8]. Dessa SNP kan vara utspridda över hela genomet, lokaliserade i områden av intresse, såsom exomes, eller anpassas till användarens önskemål. Dessa matriser har fördelen av att inte bara kunna korrekt genotyp en miljon SNP per prov på en gång, men också för att mäta antalet exemplar variation, potentiellt avtäckningen kromosomavvikelser. Infinium-inriktade OMNI BeadChip arrayer närvarande har förmågan att genotypa upp till nästan fem miljoner markörer per prov, inklusive en halv miljon unika loci, på upp till nästan hundra prover per dag.
Eftersom de flesta sjukdomar har en genetisk komponent, kan dessa storskaliga försök vara avgörande för att hitta gener som är förknippade med sjukdomen. Hög kapacitet genotypning möjliggör effektiv genotyp generation i prov sätter tillräckligt stor för att på ett övertygande sätt påvisa genetisk association vid lägre smärre allelfrekvenser. Hel-genom genotypning projekt kan användas för att lokalisera områden med statistiskt signifikant fall-kontroll allelfrekvens eller kopiera sifferskillnader [9,10,11]. Enligt National Human Genome Research Institute, genomet hela föreningen studier ledde till 1,490 separata publikationer mellan November 25, 2008 och jan 25, 2013, till följd av upptäckten av 8283 SNP med ett p-värde mindre än 1 x 10 -5 (se http:// www.genome.gov/gwastudies/). Dessa studier, som forskat villkor som sträcker sig från höjd till testikelcancer, dragit nytta av bred ansats ges av en genomet hela analysen. I fall som dessa, kanske hela regioner av intresse ha undgått varsel hade omfattningen av typning varit alltför restriktiv. Således, för storskalig förening analyser, är en genomet hela genotypning teknik tekniken med valet.
Olika versioner av Infinium analysen finns, var och en avsedd för specifika typer av arrayer. Den InfiniumUltra analysen diskuteras ingående nedan, är lämplig för många 12 – eller 24-prov array chips. Dessa genotyp ofta över hundra tusen SNP per DNA-prov och fokusera på targeted regioner, till exempel på exome eller anpassade paneler. Andra analys versioner kan krävas för andra chiptyper, såsom hel-genomet genotypning arrayer. Men som alla Infinium analyser har en gemensam grund och främst skiljer sig endast genom reagensnamn, reagensvolymer, eller den exakta färgningsreagens förfarande, tekniker fulländat på en analys version kan ofta vara allmänt tillämpas. Andra matriser, såsom metylering arrayer, kan använda en nästan identiskt protokoll, liksom. Försiktighet måste vidtas för att endast använda den version av analysen som krävs för chip typ används. Några typer, såsom sådana som mäter genuttryck nivå, kan kräva användningen av en nonInfinium protokoll.
Proverna skall behandlas i omgångar. Till exempel, med InfiniumUltra analysen prehybridisering reagensrören innehåller tillräckligt med volym för att köra 96 prover, och rören kan inte frysas. Därför måste prover köras i partier om 96 prover åt gången. Proverna kommer att förstärkas på granarnat dag. Efter ca 1 h av benchwork måste proverna upphettas i en konvektionsugn under 20-24 timmar. Följande dag kommer nästan 4 tim att spend fragmentering, utfällning och återsuspendering av prover, vid vilken punkt proverna kan antingen frysas för framtida användning eller hybridiserade till chipet. Laddar marker tar nästan två timmar, varefter prover kommer att hybridiseras över natten till 16-24 timmar. På den tredje dagen, tar färgning och förlängningssteg ~ 4 tim. En ytterligare timme kommer att spend tvättning, beläggning och torkning av chipsen. Slutligen är de arrayer skannas, vilket kan ta 15-60 min / chip, beroende på vilken typ som används.
Standardlaboratorie säkerhet och renlighet säkerhetsåtgärder gäller. Även förstärkningen inte PCR-baserad, separata arbetsstationer för pre-och postamplification förfaranden är nödvändiga för att minimera risken för kontaminering. Det identifieringsnummer för varje sats-levereras reagens som används måste vara inloggad för ett spårningsblad. Reagents ska tinas omedelbart före användning och inverterad flera gånger innan dispensering. Den DNA som skall skrivas måste vara av hög kvalitet genom-DNA (260/280 absorbansförhållande av 1,6 till 2,0, 260/230 absorbansförhållande av under 3,0), isoleras enligt standardmetoder och kvantifierades med en fluorometer. Nedbrytning av DNA är ofta en bidragande faktor i låg kvalitet analysresultat. Normalt är 200 ng av DNA som krävs, även om detta belopp kan variera för vissa chiptyper. En Tecan vätskehanteringsrobot kan automatisera många steg i protokollet och minimera den mänskliga faktorn som en faktor.
Storskaliga genotypning ansökningar har använts för att bättre förstå den genetiska mekanismen bakom många mänskliga sjukdomar. Upptäckten av betydande variant genom en genomet hela föreningen analys kan flagga en kandidatregion för vidare studier. Dessutom är genotypen uppgifter ett bra verktyg för kvalitetskontroll på sekvenseringsprojekt.
För att maximera provkapacitet kan flera provplattor förstärkas och lagras i deras splittrade, utspätt stater. Åtta plattor kan förstärkas på en enda dag, kombinerar de första 24 timmar av protokollet för flera partier och ge tillräckligt med material för ~ 2-8 dagar av chip-bearbetning. Om förstärkta plattor är lagrade i förväg, och om nya prover hybridiseras till chips direkt efter skanningen börjar på föregående körning, kan behandling köras kontinuerligt utan att behöva stanna upp ytterligare provberedning. Därför kommer though prover tar tre dagar för att genomgå en fullständigAnalysen kan data genereras dagligen. Assuming24 chips behandlas varje dag, gör att en 5 dagars arbetsvecka för över 1.000 DNA-prov som ska köras på en 12-prov pärla chip. Om något steg eller reagens har misslyckats, kan dock flera partier vara i riskzonen för dåliga resultat innan någon korrigering kan tillämpas. Fel kan undgå varsel tills arrayer skannas eller analyseras, alltså, om genomströmningen är maximerad, hundratals prover i olika skeden av protokollet kanske redan har fått samma defekt behandling vid upptäckt. Som förlorade reagenser och data inte kan återställas, måste användaren väga dessa risker mot behovet av ett snabbare arbetsflöde.
Den GenomeStudio analysprogram är det första chansen att verkligen mäta framgången för genotypning processen. Om Norm-R vs Norm-Theta intensitet tomter är korrekt klustrade, bör den genomsnittliga samtalshastighet (procent av totala SNP framgångsrikt skrivit) av proven närmar sig 99%, men detta värde varierar slightly beroende på array typ. Data från varje prov med ett samtal som är lägre än 85-90% är inte pålitliga och bör kasseras. För kvalitetskontroll, bör resultaten jämföras med de tidigare kända genotyper när det är möjligt. Om ingen sådan information finns, är avsiktligt prov dubbel ett användbart verktyg för att verifiera plåt eller array placeringar. Dessa dubbla par bör placeras på separata chips, tallrikar, partier, eller projekt, deras genotyper kontrolleras efter generation. Medan specifika QC begränsningar varierar beroende på utredarens önskemål, är vanliga SNP begränsningar baserade på provsamtal framgång, Hardy-Weinberg jämvikt, eller missingness mellan fall och kontroller, medan vanliga begränsningar prov baseras på samtalspriser, Mendels inkonsekvenser eller korsreferenser av X-kromosomen heterozygositet till kliniska data köns [13].
Om något problem uppstår, Kontroller Dashboard, framgår av analysen svit, kan lämnas in tillföretag för att fastställa orsaken. Dessa kontroller kan ofta begränsa frågan till den sann steget eller reagensfel. Om några SNP intressepunkter hittas genom en Infinium genotypning experiment, bör deras intensitet tomter vara dubbelkollade i GenomeStudio för klustring fel innan ytterligare forskning bedrivs.
En misslyckad Infinium genotypning experiment är sannolikt på grund av den mänskliga hanteringsfel eller dålig kvalitet input-DNA. Prov kvantifiering måste vara exakt och precis. För bästa resultat, alla reagenser läggs till varje prov eller chip måste dispens med den volym som fastställs i protokollet. Pipetter skall vara rätt kalibrerad. Reagens ska inte köras efter utgångsdatum och bör inte frysas om efter upptining, spara för RA1 reagens. För att minimera eventuella färgning och förlängnings fel, bör det formamid / EDTA-blandning beredas på nytt varje månad. Alla -20 ° C reagenser skall förvaras i bara manuell avfrostning frysar. Alla laboratorieutrustning som används i staining bör förlängning, och tvätta delar av protokollet sköljas noggrant med vatten och milt rengöringsmedel omedelbart efter glömska. Befuktnings reservoarer i Hyb kammaren skall avlägsnas med ett provrör borste och milt rengöringsmedel. De glas bör tvättas med 10% blekmedel, enligt instruktioner från sina handböcker, en gång i veckan.
The authors have nothing to disclose.
Finansieringen för detta arbete har tillhandahållits av NIH P20 GM103456, NIH RC2 AR058959, och NIH R56 AI063274
Consumable or Equipment | Manufacturer | Part Number | Minimum Required for 96 Samples |
0.8 ml Deep Well Plate | Thermo Scientific | AB-0765 | 1 |
Plate Mats | Thermo Scientific | AB-0674 | 2 |
Reagent Basin | Fisher Scientific | 13-681-502 | 9 |
Heat-seal Sheets | Thermo Scientific | AB-0559 | 1 |
Flow-through Spacer | Fisher Scientific | NC9563984 | 6 |
Pipette tips – 200 μl | Rainin | GP-L200F | 192 |
Pipette tips – 10 μl | Rainin | GP-L10F | 16 |
Pipette tips – 1,000 μl | Rainin | GP-L1000F | 16 |
DNA Suspension Buffer | Teknova | T0220 | 0.5 ml |
0.1 N NaOH | Fisher Scientific | AC12419-0010 | 0.5 ml |
Isopropanol (HPLC grade) | Fisher Scientific | A451 | 15 ml |
Ethanol (200-proof) | Sigma-Aldrich | 459836 | 330 ml |
Formamide (100%) | Thomas Scientific | C001K38 | 15 ml |
EDTA (0.5 M) | Amresco | E177 | 0.2 ml |
10 μl 8-channel Pipette | Rainin | L8-10XLS | 1 |
200 μl 8-channel Pipette | Rainin | L8-200XLS | 2 |
1,000 μl Single-channel Pipette | Rainin | L-1000XLS | 1 |
Microplate Shaker | VWR | 13500-890 | 1 |
Refrigerated Microplate Centrifuge | VWR | BK369434 | 1 |
Hybridization Oven | Illumina | SE-901-1001 | 1 |
Hybex Microsample Incubator | SciGene | 1057-30-0 | 1 |
Hybex MIDI Heat Block Insert | Illumina | BD-60-601 | 1 |
Heat Sealer | Thermo Scientific | AB-0384 | 1 |
Hyb Chamber w/ Insert and Mat | Illumina | BD-60-402 | 2 |
Surgical Scissors | Fisher Scientific | 13-804-20 | 1 |
Flow Through Assembly Parts | Illumina | WG-10-202 | 8 |
Wash Rack and Dish | Illumina | BD-60-450 | 1 |
Genepaint Chamber Rack | Tecan | 760-800 | 1 |
Temperature Probe | Illumina | A1-99-109 | 1 |
Staining Rack and Dish | Illumina | WG-10-207 | 1 |
Self-Closing Tweezers | Ted Pella, Inc | 5374-NM | 1 |
Vacuum Manifold | Ted Pella, Inc | 2240 | 1 |
iScan or HiScan | Illumina | – | 1 |