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Biology

Electrocompetent की तैयारी के लिए रैपिड प्रोटोकॉल doi: 10.3791/50684 Published: October 8, 2013

Summary

Electroporation परिवर्तन के रूप में जाना जाता प्रक्रिया में बैक्टीरिया में डीएनए को शुरू करने के लिए आमतौर पर कार्यरत विधि है. Electrocompetent कोशिकाओं की तैयारी के लिए पारंपरिक प्रोटोकॉल समय लगता है और श्रम गहन हैं. यह लेख एक वैकल्पिक, तेजी से, और वर्तमान में कुछ प्रयोगशालाओं द्वारा नियोजित electrocompetent कोशिकाओं की तैयारी के लिए कुशल विधि का वर्णन करता है.

Abstract

Electroporation तेजी से और कुशलता से कोशिकाओं की एक विस्तृत श्रृंखला में विदेशी डीएनए को शुरू करने के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल तरीका बन गया है. Electrotransformation स्वाभाविक रूप से सक्षम नहीं हैं कि प्रोकीर्योट्स में डीएनए को शुरू करने के लिए चुनाव का तरीका बन गया है. Electroporation शुद्ध डीएनए और सक्षम बैक्टीरिया के अलावा, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध जीन नाड़ी नियंत्रक और cuvettes की आवश्यकता है, एक तेजी से, कुशल, और सुव्यवस्थित परिवर्तन विधि है. स्पंदन कदम के विपरीत, electrocompetent कोशिकाओं की तैयारी के मध्य लघुगणक चरण की हो गई दोहराया बाँझ, ठंडे पानी की मात्रा कम करने में centrifugation और washes के चक्कर, या संस्कृतियों की बड़ी मात्रा की गैर ईओण बफ़र्स शामिल गहन समय लगता है और श्रम है विकास. समय और प्रयास वाणिज्यिक स्रोतों से electrocompetent कोशिकाओं की खरीद से बचाया जा सकता है, लेकिन चयन आमतौर पर ई. कार्यरत तक सीमित है कोली प्रयोगशाला उपभेदों. हम इसके द्वारा एक तेजी से प्रसार कर रहे हैंelectrocompetent ई. तैयार करने के लिए कारगर तरीका कुछ समय के लिए जीवाणु विज्ञान प्रयोगशालाओं द्वारा उपयोग में, वी. के लिए अनुकूलित किया जा सकता है किया गया है जो कोलाई, कोलरा और अन्य प्रोकीर्योट्स. हम मूल तकनीक के विकास के लिए ऋण के लिए किसे पता नहीं लगा सकते हैं, हम इसके द्वारा वैज्ञानिक समुदाय के लिए यह उपलब्ध बना रहे हैं.

Introduction

1980 के दशक में 1 'अपनी स्थापना के बाद से, electroporation के एक अभिन्न आणविक जीव विज्ञान तकनीक, परिपत्र या रैखिक न्यूक्लिक एसिड के साथ / transfect जीवित कोशिकाओं को बदलने के लिए कार्यरत होने की संभावना सबसे आम तरीका बन गया है. मूलतः कोशिकाओं 1 के अभिकर्मक के लिए विकसित की है, electroporation के बाद ई. के परिवर्तन के लिए अनुकूलित किया गया था कोली 2, 3. जीवाणु विज्ञान में, electroporation प्रयोगशाला मानक बन गया है और ग्राम नकारात्मक स्यूडोमोनास 4, Salmonellae 5, Vibrios 6, Serratiae, और Shigellae 7 सहित बैक्टीरिया की एक विस्तृत श्रृंखला को बदलने के लिए संशोधित किया गया है, ग्राम पॉजिटिव Clostridia 8, बेसिली 9, Lactobacilli 10 और enterococci 11. यहां तक कि कुछ archaebacteria Methanococci सहित electroporation द्वारा परिवर्तन करने के लिए उत्तरदायी सिद्ध कर दिया है 12 और Sulfolobus प्रजातियों 13. एक व्यापक समीक्षा के लिए Aune और Aachmann 14 देखें. Electroporation द्वारा परिवर्तन की क्षमता रासायनिक क्षमता या गर्मी झटका 2 से कथित तौर पर 10-20 गुना अधिक है. हालांकि, बहुत से 1980 के दशक में 15 में डगलस Hanahan से अनुकूलित के रूप में रासायनिक क्षमता के लिए बैक्टीरिया की तैयारी की तरह, कोशिकाओं को भी electrocompetent होने के लिए तैयार रहना चाहिए.

Electroporation electrocompetent बैक्टीरिया, शुद्ध डीएनए, विद्युत आवेग उद्धार एक नाड़ी नियंत्रण मॉड्यूल, और एक इलेक्ट्रोड के रूप में कार्य है कि छोटे डिस्पोजेबल cuvettes accommodates कि एक कक्ष की आवश्यकता होती है, जीवाणु परिवर्तन की एक तेजी से और प्रभावी साधन है. संक्षेप में, ठंड, सक्षम बैक्टीरिया 30-45 मिनट के लिए 30-37 डिग्री सेल्सियस पर incubated विकास मीडिया में resuspended एक क्युवेट में एक उच्च वोल्टेज स्पंद के अधीन प्लास्मिड डीएनए,,, के साथ मिश्रित, और फिर semisolid मध्यम (पोषक तत्व अगर पर चढ़ाया जाता है appr के साथ प्लेट)चयनात्मक एंटीबायोटिक opriate.

स्पंदन कदम, electrocompetent ई. की तैयारी के विपरीत कोली को पारंपरिक रूप से बड़ी मात्रा में किया जाता है कि एक बहुखण्डीय प्रक्रिया बनी हुई है. संक्षेप में, बैक्टीरिया की एक रात में संस्कृति के विकास के मध्य लघुगणक चरण (<1.0 के आयुध डिपो 600) की वृद्धि हुई, और एक बाँझ गैर के साथ धारावाहिक washes के अधीन करने के लिए 1 एल Luria शोरबा (लेग) को 100 मिलीलीटर के साथ एक Erlenmeyer फ्लास्क में inoculated है ईओण 4 डिग्री सेल्सियस पर संस्करणों को कम करने में बफर या डबल आसुत जल (DDH 2 हे) महान देखभाल पूरी प्रक्रिया के दौरान ठंड कोशिकाओं रखने और प्रदूषण को रोकने के लिए लिया जाना चाहिए. इस autoclaved centrifugation बाल्टी और गैर ईओण buffers या DDH 2 ओ का उपयोग, एक कक्षीय प्रकार के बरतन इनक्यूबेटर, एक बड़ी मात्रा में उच्च गति प्रशीतित अपकेंद्रित्र और रोटार के एक सेट की आवश्यकता है. बैक्टीरिया अंत में 10% ग्लिसरॉल के साथ पूरक बफर की एक छोटी मात्रा में resuspended और ~ 40 μl संस्करणों, क में aliquoted रहे हैंआईसीएच उपयोग करें जब तक -80 डिग्री सेल्सियस पर जमा हो जाती है. कम तापमान भंडारण कारण अक्सर समय के साथ व्यवहार्यता के नुकसान तक की कमी परिवर्तन क्षमता में यह परिणाम है.

Electrocompetent बैक्टीरियल कोशिकाओं वाणिज्यिक स्रोतों की विविधता से लेकिन केवल (अक्सर पुनर्संयोजन की कमी) ई. के एक सीमित संख्या के लिए भी उपलब्ध हैं मेजबान plasmids के एक विस्तृत रेंज का प्रचार करने के रूप में कोलाई उपभेदों आमतौर पर कार्यरत हैं. नतीजतन शोधकर्ताओं परिवर्तन के लिए अपने स्वयं के उपभेदों / म्यूटेंट तैयार करने के लिए घर में तरीकों पर भरोसा करते हैं.

Electrocompetent ई. की तैयारी के लिए एक वैकल्पिक, तेजी से और कुशल प्रोटोकॉल कोली अब कुछ समय के लिए कुछ आणविक जीवाणु विज्ञान प्रयोगशालाओं द्वारा उपयोग में किया गया है और हमारे मामले वी. में, अतिरिक्त ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया के लिए बढ़ा दिया गया है कोलरा. यह समय के साथ अन्य शोधकर्ताओं द्वारा अनुकूलित किया गया है के रूप में प्रोटोकॉल के प्रवर्तक नहीं पहचाना जा सकता. यहाँ प्रस्तुत विधि हमारे Laborator में इस्तेमाल किया गया हैलगभग दो दशकों के लिए एँ, और यह हमारे साथियों के साथ इस उपयोगी प्रोटोकॉल साझा करने के लिए हमारा लक्ष्य है.

Protocol

1. बैक्टीरियल संस्कृतियों, उपकरण, और अभिकर्मकों की तैयारी (1 दिन, दोपहर)

  1. देर से दोपहर में, 1-5 मिलीलीटर बाँझ में autoclaved लेग शोरबा बैक्टीरिया (ई. कोलाई या वी. कोलरा) के एक छोटे से विभाज्य साथ (उदाहरण के लिए, 100 x 13 मिमी) borosilicate ग्लास टेस्ट ट्यूब टीका लगाना.
  2. , 37 डिग्री सेल्सियस तापमान (गर्म कमरे या इनक्यूबेटर) में रखे एक रोलर ड्रम में टीका टेस्ट ट्यूब सेट उच्च गति पर रोलर ड्रम पर बारी, और ओ / एन सेते
  3. कांच softens जब तक एक लैम्प बर्नर की लौ में रॉड के बीच हीटिंग द्वारा एक गिलास छड़ी से एक "हॉकी स्टिक" के रूप में एक सेल स्प्रेडर तैयार करें और फिर एक 135 डिग्री कोण में चिमटी या सरौता के साथ धीरे मोड़ प्रत्यक्ष . एक बार फिर अंत और पहले मोड़ के बीच मध्य बिंदु में छड़ी गर्मी और (पहले मोड़ पर विपरीत दिशा में) अंदर की ओर एक 45 डिग्री के कोण पर मोड़.
  4. एंटीबायोटिक दवाओं के बिना लेग अगर तैयार है और की तैयारी में पेट्री डिश में डाल देना4 डिग्री सेल्सियस पर उचित (electroporated जा करने के लिए वेक्टर पर प्रतिरोध मार्कर के अनुसार) एंटीबायोटिक, और दुकान युक्त electrocompetence प्रोटोकॉल, और लेग अगर प्लेट
  5. 2 मिमी CaCl वी. के लिए 2 समाधान निष्फल एक फिल्टर की तैयारी ई. के लिए कोलरा, या आटोक्लेव DDH 2 हे 4 डिग्री सेल्सियस पर कोलाई, और दुकान

2. Electrocompetent जीवाणुओं के विकास (2 दिन, सुबह)

  1. प्रत्येक लेग अगर थाली पर ओ / एन जीवाणु संस्कृति की 100 μl उद्धार, जमे हुए ग्लिसरॉल शेयरों में भी उपयोग किया और सीधे प्लेट पर दिया जा सकता है.
  2. 100% EtOH में हॉकी स्टिक के आकार का सेल स्प्रेडर डुबकी, संक्षेप में नाली और उपयोग करने से पहले और प्रसार यह बाँझ शेष EtOH से जला है. बाँझ कांच सेल स्प्रेडर (विराम) अगर सतह को बाधित करने के लिए यकीन नहीं बनाने के साथ समान रूप से 100 μl हे / एन जीवाणु संस्कृति बिखरा हुआ है.
  3. बैक्टीरियल वृद्धि की एक पतली लॉन हो जब तक 4-6 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली सेते हैं, याअलग पहचाना आता है. सक्रिय रूप से बढ़ जब कोशिकाओं सबसे सक्षम हैं.

3. Electrocompetent बैक्टीरियल कोशिकाओं की तैयारी (2 दिन, दोपहर)

  1. अगर की सतह बेध या तोड़ने के लिए यकीन नहीं कर रही एक बाँझ inoculating पाश के साथ बैक्टीरिया हार्वेस्ट. एक 2 मिमी व्यास बैक्टीरियल जन एक भी परिवर्तन के लिए पर्याप्त है. आमतौर पर, इस inoculating पाश दो या तीन बार के साथ पतली लॉन की सतह scraping की आवश्यकता है. (आमतौर पर 4-6 के बीच) कई नमूने एक ही थाली से एकत्र किया जा सकता है.
  2. 1 मिलीलीटर ठंडा 2 मिमी 2 CaCl (वी. कोलरा के लिए) या ​​बाँझ DDH 2(ई. कोलाई के लिए) में बैक्टीरियल जन Resuspend और कोई clumps दिखाई दे रहे हैं, जब तक मिश्रण अच्छी तरह से, बर्फ पर रहते हैं.
  3. अपकेंद्रित्र 4 डिग्री सेल्सियस, या 4 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट एक ठंडे कमरे में संग्रहीत एक microcentrifuge में करने के लिए सेट एक प्रशीतित microcentrifuge में 5,000 XG पर 5 मिनट के लिए प्रत्येक जीवाणु निलंबन
  4. सतह पर तैरनेवाला, resusp त्यागेंठंडा 2 मिमी 2 CaCl या बाँझ DDH 2 हे की एक ही मात्रा में बैक्टीरिया गोली खत्म, और तीन washes के एक कुल के लिए दो बार अधिक से पहले किया रूप centrifugation कदम दोहराएँ.
  5. सतह पर तैरनेवाला, resuspend निकालें, और फिर 40 μl बर्फ ठंड में अच्छी तरह से 2 मिमी 2 CaCl या बाँझ DDH 2 हे बैक्टीरिया गोली ढीला और बर्फ पर रख.

4. Electrocompetent जीवाणु के परिवर्तन (2 दिन, दोपहर)

  1. 40 μl जीवाणु निलंबन को प्लाज्मिड डीएनए (अप करने के लिए 1 μl पानी या Tris-EDTA बफर में) की 1 ग्राम के लिए ऊपर जोड़ें और एक पूर्व ठंडा, बाँझ 0.2 सेमी अंतराल क्युवेट में स्थानांतरण इस मिश्रण. डीएनए नमूने में नमक एकाग्रता यह अगले चरण में नाड़ी की arcing के लिए योगदान देगा के रूप में, कम एक होना चाहिए.
  2. पल्स नियंत्रण मॉड्यूल की electroporation चेंबर में क्युवेट डालें, और 1.8 केवी, 25 μF पर electroporate. समय निरंतर ~ 5.0 मिसे होना चाहिए, और कोई arcing हो जाना चाहिए.
  3. जल्दी से 1 मिलीलीटर लेग शोरबा में resuspending द्वारा सेल निलंबन की वसूली और पहले से autoclaved borosilicate ग्लास टेस्ट ट्यूब में स्थानांतरण.
  4. कोशिकाओं एंटीबायोटिक चयन के बिना 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस (एक रोलर ड्रम में) वातित विकास परिस्थितियों incubating द्वारा ठीक करने की अनुमति दें.
  5. उपयुक्त चयनात्मक एजेंट (एंटीबायोटिक) की उपस्थिति में पहले से तैयार लेग अगर प्लेटों पर बैक्टीरिया प्लेट, और 37 डिग्री सीओ / एन सेते बैक्टीरिया शुद्ध किया वेक्टर (0.1-1 ग्राम supercoiled प्लाज्मिड) के एक उच्च एकाग्रता के साथ बदल रहे हैं, तो लेग अगर थाली के किनारे पर और चतुर्थ भाग लकीर विधि का उपयोग कर अलग कालोनियों के लिए एक बाँझ inoculating पाश लकीर साथ जीवाणु संस्कृति के 10 μl उद्धार. एक बंधाव मिश्रण तब्दील हो गया था, तो प्रत्येक अगर प्लेट पर बैक्टीरिया संस्कृति की 100 μl देने और समान रूप से निष्फल ग्लास सेल स्प्रेडर के साथ यह फैल गया.

एक समय लगातार (हो कम हैकम 3.5 मिसे), या स्पंदन तो, डीएनए नमूने फिर से वेग सूखने से पहले लवण दूर करने के लिए दो बार 70% EtOH से धो लें और ते बफर में resuspending, arcing की ओर जाता है.

Representative Results

हम ई. साथ परिवर्तनों का एक सेट से बाहर किया कोली और वी. कोलरा मूल रूप से electrocompetent बैक्टीरिया की तैयारी के लिए दहेज एट अल. 2 द्वारा वर्णित (परंपरागत) पद्धति पर आधारित एक फिल्म के साथ हमारे तेजी से पद्धति के परिवर्तन दक्षता तुलना करने के लिए. सक्षम कोशिकाओं की पारंपरिक तैयारी के लिए बाहर ले, एक 2 एल Erlenmeyer फ्लास्क में 500 मिलीलीटर लेग ई. के 500 μl रातोंरात संस्कृति के साथ inoculated थे कोलाई DH5α या वी. एक कक्षीय हिलनेवाला (37 डिग्री सेल्सियस पर 215 आरपीएम) में incubated और 0.5-1.0 के बीच की 600 आयुध डिपो में काटा कोलरा O395,. कुप्पी बर्फ पर ठंडा था और संस्कृतियों 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 4000 XG पर एक पूर्व ठंडा रोटर में centrifuged सेल छर्रों अच्छी तरह वी. के लिए 500 मिलीलीटर ठंडा 2 मिमी 2 CaCl में resuspended थे ई. के लिए कोलरा और DDH 2 हे कोली, और फिर centrifuged ही परिस्थितियों में. मेजबान एक के बाद के दौरडी centrifugation यकीन संस्कृति 4 डिग्री सेल्सियस पर ठंडा बना रहा बनाने में 200 की मात्रा और 100 मिलीग्राम संस्करणों को कम करने में बाहर किया गया अंत में, एक 10 मिलीलीटर की मात्रा में एक मेजबान और centrifugation 10% ग्लिसरॉल के साथ किया गया. अंतिम गोली 2 मिलीलीटर 10% ग्लिसरॉल में resuspended किया गया था और 40 μl aliquots -80 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर है और पिछले electroporation के लिए एक सप्ताह से अधिक समय नहीं जमा थे.

पल्स सेटिंग और क्युवेट आकार सहित electroporation स्थितियों की परवाह किए बिना सक्षम कोशिकाओं की तैयारी की विधि के सभी electroporations में दोनों प्रजातियों के जीवाणु के लिए समान थे. फर्क सिर्फ इतना है कि हम ठंड DDH में ई. के लिए 2 हे washes के बाहर किया गया था कि कोली और वी. के लिए ठंड 2 मिमी 2 CaCl कोलरा. 1 टेबल शो हूबहू लेकिन तेजी से प्रोटोकॉल के साथ या पारंपरिक विधि के साथ या तो सक्षम गाया electroporation द्वारा तब्दील बैक्टीरिया का परिणाम है. हम आम के रूप में तनाव O395 और DH5α कार्यरतवी. के ly इस्तेमाल किया, प्रतिनिधि उपभेदों कोलरा और ई. क्रमशः कोलाई, इसी तरह के परिणाम (हर एक तनाव परीक्षण किया गया है नहीं यद्यपि) एक ही प्रजाति के अन्य उपभेदों के साथ प्राप्त की है और संभावना शायद परे अन्य ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया और अनुकूलित किया जा सकता.

बराबर सेल नंबर स्पंदित प्रत्येक बैच में मौजूद थे कि बीमा करने के लिए, तेजी से विधि का उपयोग उत्पन्न electrocompetent बैक्टीरिया, संग्रह पर जमा मिलाया, homogenously निलंबित रखा है, और कुछ ही समय पूर्व electroporation के लिए 40 μl मात्रा में aliquoted थे. पारंपरिक पद्धति का उपयोग उत्पन्न Electrocompetent बैक्टीरिया इसी पिछले 40 μl aliquots में ठंड के लिए इलाज किया गया. नाड़ी की डिलीवरी के बाद, 40 μl electroporated बैक्टीरिया के प्रत्येक बैच के 400 μl लेग में निलंबित कर दिया और क्रमानुसार पतला 1:10 गया था. प्रत्येक कमजोर पड़ने से एक सौ microliters 100 माइक्रोग्राम / एमएल एम्पीसिलीन की मौजूदगी में लेग अगर पर चढ़ाया और एक बाँझ कांच सेल स्प्रेडर का उपयोग कर फैलाई गईऔर रात में 37 डिग्री सेल्सियस पर incubated. प्रत्येक परिवर्तन में कार्यरत बैक्टीरिया की कुल संख्या यों, प्रत्येक तैयार बैच के electrocompetent बैक्टीरिया की 40 μl संस्करणों क्रमानुसार पतला, और हूबहू समानांतर में एंटीबायोटिक दवाओं के बिना लेग अगर पर चढ़ाया गया. प्रत्येक बैच से समान रूप से इलाज बैक्टीरिया के एक विभाज्य डीएनए बिना 1 μl Tris EDTA (ते) बफर लेकिन (नकली परिवर्तन), क्रमानुसार के वितरण से खो कोशिकाओं की संख्या का अनुमान लगाने के लिए एंटीबायोटिक दवाओं के बिना पतला और लेग अगर पर चढ़ाया साथ electroporated किया गया था बिजली नाड़ी. अन्त में, प्रयोग करने के लिए एक अतिरिक्त भिन्नता electroporation लेकिन लेग अगर पर चढ़ाना करने से पहले बदल कोशिकाओं की वसूली प्रभावित करेगा के बाद 1 मिलीलीटर लेग में 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 चाहे मिनट incubations निर्धारित करने के लिए किया गया. कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFUs) अगले दिन गिनाए थे.

इस प्रयोग के लिए हम pUC18, एक आम प्रयोगशाला प्लाज्मिड कार्यरत हैं, और सक्षम बैक्टीरिया के बैच एक से मिलकरpproximately कोशिकाओं के लिए 10 8 CFUs पारंपरिक विधि और तेजी से प्रोटोकॉल उपयोग के लिए तैयार की कोशिकाओं के लिए 10 7 CFUs उपयोग के लिए तैयार. (डीएनए) के बिना अकेले electroporation पर ध्यान दिए बिना electrocompetent कोशिकाओं को तैयार करने के लिए प्रयोग किया जाता विधि के गुना 10-100 से व्यवहार्य CFUs कम कर दिया. तालिका 1 में दिखाया गया है, transformant उपज ई. के लिए तीन को दोहराने के प्रयोगों (कोष्ठक में मानक विचलन) में डीएनए श्रृंखला की 10 6 -10 7 CFUs / ग्राम भीतर था कोली (DH5α) और वी. कोलरा (O395) क्रमश electrocompetent सेल तैयार करने के लिए पारंपरिक, लंबी विधि का उपयोग. Transformant उपज ई. के लिए तीन को दोहराने के प्रयोगों (कोष्ठक में मानक विचलन) में डीएनए के 10 5 -10 6 CFUs / ग्राम तक की कमी 10 गुना दिखाई दिया कोली और वी. तेजी से विधि का उपयोग क्रमश कोलरा. इस कारण से हम बदल CFUs विभाजित करके तब्दील बैक्टीरिया का प्रतिशत निर्धारितCFUs की संख्या सक्षम कोशिकाओं की अन्यथा समान बैचों से (प्लाज्मिड के बिना) "नकली परिवर्तनों" से बरामद द्वारा. तब्दील बैक्टीरिया का प्रतिशत की परवाह किए बिना तैयारी और (1 टेबल bracketed संख्या) बदल प्रजातियों की विधि से एक प्रवेश (2.5-9.4%) के भीतर था. इन परिणामों से तेजी से विधि की दक्षता सक्षम कोशिकाओं की तैयारी और विब्रियो कोलरा और Escherichia कोलाई के प्रतिनिधि उपभेदों तेजी से प्रक्रिया के लिए समान रूप से उत्तरदायी हैं कि के पारंपरिक लंबी प्रक्रिया के बराबर है कि सुझाव है.

हम β-lactamase कैसेट शरण pUC18 तरह plasmids के लिए, लेग शोरबा में 30 मिनट वसूली समय से प्रभावित नहीं है, कि परिवर्तन दक्षता पाया. transformants की एक ही नंबर सीधे, electroporation के बाद, या वे एक 30-45 मिनट वसूली समय की अनुमति दी गई है कि क्या कोशिकाओं एम्पीसिलीन की मौजूदगी में लेग अगर को चढ़ाया गया कि क्या बरामद किया गया थापूर्व चढ़ाना को 37 डिग्री सेल्सियस पर लेग शोरबा में. एम्पीसिलीन प्रतिरोध nonselective परिस्थितियों में परिणाम की आवश्यकता नहीं है कि हमारा निष्कर्ष β-lactamase अभिव्यक्ति परिवर्तन पर पर्याप्त तेजी से होता है कि पता चलता है. हालांकि, यह हम बिजली के झटके से वसूली करने के लिए योगदान दिया है और जीन अभिव्यक्ति आरंभ हो सकता है जो लेग शोरबा, में स्पंदित बैक्टीरिया के धारावाहिक dilutions बाहर किया कि ध्यान दिया जाना चाहिए.

चित्रा 1
चित्रा 1. Electrocompetent बैक्टीरिया के तेजी से तैयार करने के लिए कार्यप्रणाली की चित्रमय चित्रण. 4-6 घंटे के बाद (inocula के घनत्व पर निर्भर करता है) बैक्टीरिया की पर्याप्त संख्या एक एकल लेग अगर थाली से 4-6 परिवर्तनों बाहर ले जाने के लिए एकत्र किया जा सकता है. Electroporated होने के लिए प्रत्येक अंतिम मात्रा के लिए सक्षम कोशिकाओं की संख्या बराबर का बीमा करने के लिए, लेग अगर थाली से एकत्र बैक्टीरिया शुरू में अल फिर एक साथ जमा और धोया गयागोली के आकार के आधार पर 40 μl मात्रा में iquoted (बड़ा छर्रों 40 μl विभाज्य द्वारा बड़ी मात्रा में पतला कर रहे थे).

एम्पीसिलीन प्रतिरोधी transformants / ग्राम डीएनए की संख्या (एम्पीसिलीन प्रतिरोधी transformants बरामद [%])
तनाव पारंपरिक विधि तेजी से विधि
कोली (DH5α) 2.3 x 10 6 (5 से 10 x 7.3 ±) [9.4%] 3 एक्स 10 6 (5 से 10 x 7.1 ±) [2.5%]
वी. कोलरा (O395) 4 10 x 7 (7 से 10 एक्स 1.7 ±) [5%] 6.7 x 10 5 (5 से 10 x 2.1 ±) [3.3%]

तालिका 1. Electrocompetent बी का डीएनए (pUC18) की माइक्रोग्राम प्रति परिवर्तन दक्षताacteria तेजी से विधि की तुलना में परंपरागत विधि से तैयार किया.

सभी परिवर्तनों (1% agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा कल्पना के रूप में ~ 80% supercoiled डीएनए) 500 एनजी pUC18 डीएनए के साथ किए गए और electroporated कोशिकाओं क्रमानुसार एंटीबायोटिक दवाओं के साथ लेग अगर पर CFU के लिए चढ़ाना करने से पहले लेग शोरबा में 10 गुना पतला थे. गैर electroporated बैक्टीरिया की और प्लाज्मिड बिना electroporated बैक्टीरिया का नियंत्रण, क्रमानुसार एंटीबायोटिक दवाओं के बिना पतला और लेग अगर पर चढ़ाया पूर्व और स्पंदन के बाद व्यवहार्य बैक्टीरिया की कुल संख्या का निर्धारण करने के लिए परिवर्तनों के प्रत्येक सेट के लिए किए गए. electroporated नियंत्रण सफलतापूर्वक बदल व्यवहार्य बैक्टीरिया के प्रतिशत के आधार रेखा का प्रतिनिधित्व किया.

Discussion

परिवर्तन दक्षता की परवाह किए बिना सक्षम कोशिकाओं को तैयार करने के लिए नियोजित विधि के कारकों की एक किस्म के अधीन है. अनुरूप चर इस विधि के लिए लागू होते हैं, महान ध्यान रखा जाना चाहिए कि कोशिकाओं वे लगातार ठंड तापमान (कोई उच्च ° 4 से सी) में रखा जाता है कि इस तरह अगर थाली से काटा जाता है एक बार. बैक्टीरियल लॉन सक्रिय रूप से संग्रह के समय में बढ़ जाना चाहिए, कोशिकाओं की वृद्धि के मध्य लघुगणक चरण में होना चाहिए. डीएनए (लवण की यानी संदूषण) की गुणवत्ता परिवर्तन दक्षता को प्रभावित करती है. इस विधि को रोजगार जब विशेष रूप से, अगर क्युवेट में अगर टुकड़े नाड़ी की arcing कारण होगा टूट नहीं किया जाना चाहिए.

इस तकनीक के साथ सामना करना पड़ा अधिकांश समस्याओं दो मुद्दों के साथ जुड़े रहे हैं, वे सक्रिय रूप से बढ़ रहे हैं जब अगर प्लेट से समय का उचित खिड़की के दौरान बैक्टीरिया का संग्रह. बहुत जल्द ही उन्हें इकट्ठा करने के लिए अपर्याप्त सेल नंबर निकलेगा और प्रस्तुत करना होगावे फार्म "pellicule" थाली की सतह से लिफ्ट करने के लिए मुश्किल है क्योंकि निराशा लेग अगर थाली बंद scraping. एकत्रित बैक्टीरिया बहुत देर हो चुकी नाटकीय ढंग से अपनी क्षमता में कमी होगी. समय की खिड़की स्वाभाविक रूप से लेग अगर प्लेटों पर चढ़ाया inoculum के घनत्व के आधार पर अलग अलग होंगे. दूसरा महत्वपूर्ण कदम है कि वे परिवर्तन निम्नलिखित लेग अगर पर चढ़ाया जाता है जब तक वे अगर प्लेट को उठा लिया और 2 CaCl या DDH 2 हे में resuspended पल से (4 डिग्री सेल्सियस) ठंड बैक्टीरिया रखने के लिए है. बैक्टीरिया, cuvettes और बफर युक्त microfuge ट्यूबों पूर्व ठंडा हो और बैक्टीरिया चढ़ाया जाता है जब तक हर समय बर्फ पर रखा जाना चाहिए. बाँझ DDH 2 हे या 2 CaCl वेग होते हैं या दूषित कर रहे हैं फिर भी, जब अतिरिक्त समस्याएं पैदा कर सकते हैं. इस कारण से हम इस अभिकर्मक ताजा तैयार करने की सलाह देते हैं.

समस्या निवारण परिवर्तन बीए बदलने जब नियंत्रण सहित द्वारा सुविधा हैcteria किसी भी विधि द्वारा सक्षम गाया. चयनात्मक मार्कर युक्त एक लेग अगर प्लेट पर चढ़ाया गैर तब्दील सक्षम बैक्टीरिया के एक बैच से मिलकर एक नकारात्मक नियंत्रण तेजी से थाली पर एंटीबायोटिक प्रभावी है कि यह निर्धारित करने में मदद मिलेगी. प्रयोगात्मक नमूने के रूप में एक ही चयनात्मक मार्कर को शरण देने के लिए अच्छी गुणवत्ता और मात्रा का एक ज्ञात प्लाज्मिड तैयारी के साथ एक सकारात्मक नियंत्रण परिवर्तन बैक्टीरिया सक्षम हैं लेकिन यह भी तब्दील प्रयोगात्मक डीएनए मात्रा या गुणवत्ता में पर्याप्त था कि क्या निर्धारित करने में सहायक होगा.

इस तकनीक के फायदे कई हैं, विधि एक परिवर्तन के लिए योजना बनाई है कि एक ही दिन के भीतर बाहर किया जा सकता है. हम (रातोंरात संस्कृति के पहले दिन शुरू करने के लिए भूल के बाद) "आपातकाल" स्थितियों में यह किया है, हम जम बैक्टीरियल ग्लिसरॉल स्टॉक electrocompetence में बिना किसी नुकसान के लेग अगर पर सीधे चढ़ाया जा सकता है कि मिल गया है. हम ई की परीक्षा नहीं सकता हैबहुत तनाव किसी भी ई., ज्ञात कोली या वी. electroporation द्वारा तब्दील किया जा सकता है कि कोलरा तनाव हमारे हाथ में इस प्रोटोकॉल के लिए उत्तरदायी किया गया है. तकनीक, तेजी से प्रभावी है, और पारंपरिक तरीकों को रोजगार electrocompetent बैक्टीरिया की तैयारी से प्राप्त उन लोगों के लिए पैदावार परिवर्तन क्षमता तुलनीय. विधि उच्च गति अपकेंद्रित्र और जुड़े रोटार, एक कक्षीय इनक्यूबेटर शेखर और बाँझ अपकेंद्रित्र बाल्टी (कंटेनर), और autoclaved बफर की बड़ी मात्रा के लिए आवश्यकता समाप्त. विशिष्ट अभिकर्मकों और उपकरणों की तालिका काफी व्यापक है, electroporation के बाहर ले जाने के लिए है कि सबसे प्रयोगशालाओं पहले से ही उपलब्ध इन सामग्रियों की, सबसे अधिक है, अगर नहीं होगा. शायद सबसे महत्वपूर्ण बात, तकनीक आसानी से तेजी से उत्परिवर्ती पृष्ठभूमि के साथ electrocompetent प्रयोगशाला विशिष्ट उपभेदों उत्पन्न करने के लिए लागू किया जा सकता है. यह चुनाव की तैयारी की पारंपरिक विधि बदल दिया गया है के रूप में हम इस तकनीक के किसी भी सीमाओं से अनजान हैंहमारी प्रयोगशालाओं में बैक्टीरिया trocompetent.

यहाँ दिखाए गए हमारे प्रयोगों के परिणामों 1 सप्ताह से अधिक समय नहीं के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया था कि परंपरागत विधि से उत्पादित ताजा electrocompetent कोशिकाओं के साथ किए गए. हालांकि, स्थिर electrocompetent सेल के शेयरों में भंडारण की विस्तारित अवधि से अधिक क्षमता और या व्यवहार्यता खो देते हैं. हमारा संक्षिप्त प्रोटोकॉल उसी दिन परिवर्तन की कमी हुई transformant उपज में हो सकता है, जो शेयर की उम्र के बारे में चिंताओं के बिना योजना बनाई है ताजा electrocompetent कोशिकाओं की तैयारी परमिट. हम यह आवश्यक नहीं किया गया है के रूप में एक और दिन पर उपयोग के लिए तेजी से विधि का उपयोग कर उत्पादन electrocompetent कोशिकाओं के संचय का प्रयास नहीं किया है.

यहाँ नहीं दिखाया गया है, वहीं electrocompetent कोशिकाओं की दक्षता हमारी तेजी से विधि बंधाव मिश्रण के लिए पर्याप्त है का उपयोग कर तैयार. गैर O1 वी. के लिए सूचना दी परिवर्तनों UNTERWEGER एट अल द्वारा हाल ही में एक लेख में कोलरा.17 (संयुग्मन द्वारा किए गए उन लोगों को छोड़कर) यहाँ वर्णित विधि द्वारा तैयार electrocompetent बैक्टीरिया का उपयोग किया गया. इस तकनीक को कोशिकाओं के बड़े समूहों को तैयार करने के लिए बिना तेजी से और प्रभावी ढंग से उत्परिवर्ती पृष्ठभूमि के साथ उपभेदों को बदलने के लिए शोधकर्ताओं देता है. Electrocompetent बैक्टीरिया विधि का यह तेजी से तैयारी की तैयारी के सिद्धांत के रूप में electroporation के लिए उत्तरदायी होना दिखाया गया है और electroporation सेटिंग्स पारंपरिक प्रोटोकॉल के रूप में एक ही होने जा रहे हैं कि अन्य प्रोकीर्योट्स लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

Disclosures

कोई खुलासे लागू कर रहे हैं.

Acknowledgments

लेखक अपने सहयोगियों और इस तकनीक के विकास का समर्थन किया है कि वर्तमान और अतीत प्रयोगशालाओं के कर्मचारियों के लिए आभारी हैं. सपा की प्रयोगशाला के लिए कनाडा संस्थान द्वारा समर्थित है स्वास्थ्य अनुसंधान ऑपरेटिंग अनुदान एमओपी 84473 और (मेडिकल रिसर्च बंदोबस्ती फंड के लिए अलबर्टा विरासत फाउंडेशन द्वारा वित्त पोषित) अलबर्टा innovates-स्वास्थ्य समाधान. डी पी के MD001091-01 और GM068855-02 अनुदान स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Gene Pulser Module Bio-Rad 165-2668
Gene Pulser Cuvette Chamber Bio-Rad 165-2669
Electrocuvettes (0.2 cm gap) Bio-Rad 165-2082
13 x 100 mm Pyrex Rimless Culture Tubes Corning 70820-13
13 mm Culture Tube Closures Cole Parmer EW-04500-00
6 x 250 mm Glass Rod Lab Source 11381D
Disposable Petri Dishes Fisher Scientific 08-757-12
Roller Drum Motor Assembly New Brunswick Scientific M1053-4004
Roller Drum for 13 x 100 mm Culture Tubes New Brunswick Scientific M1053-0306
Calcium chloride Sigma Chemicals C5670
Ethanol, anhydrous/denatured Sigma Chemicals 227649
Inoculating Loop Decon Labs MP182-5
Refrigerated Microcentrifuge 5451 R Eppendorf 22621425
Bunsen Burner Fisher Scientific 03-917Q
LB Broth MILLER EMD 1.10285.0500
Bacteriological Agar Fisher Scientific S25127

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References

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Electrocompetent की तैयारी के लिए रैपिड प्रोटोकॉल<em&gt; कोलाई</em&gt; और<em&gt; विब्रियो</em
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Gonzales, M. F., Brooks, T., Pukatzki, S. U., Provenzano, D. Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae. J. Vis. Exp. (80), e50684, doi:10.3791/50684 (2013).More

Gonzales, M. F., Brooks, T., Pukatzki, S. U., Provenzano, D. Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae. J. Vis. Exp. (80), e50684, doi:10.3791/50684 (2013).

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