Electroporation परिवर्तन के रूप में जाना जाता प्रक्रिया में बैक्टीरिया में डीएनए को शुरू करने के लिए आमतौर पर कार्यरत विधि है. Electrocompetent कोशिकाओं की तैयारी के लिए पारंपरिक प्रोटोकॉल समय लगता है और श्रम गहन हैं. यह लेख एक वैकल्पिक, तेजी से, और वर्तमान में कुछ प्रयोगशालाओं द्वारा नियोजित electrocompetent कोशिकाओं की तैयारी के लिए कुशल विधि का वर्णन करता है.
Electroporation तेजी से और कुशलता से कोशिकाओं की एक विस्तृत श्रृंखला में विदेशी डीएनए को शुरू करने के लिए एक व्यापक रूप से इस्तेमाल तरीका बन गया है. Electrotransformation स्वाभाविक रूप से सक्षम नहीं हैं कि प्रोकीर्योट्स में डीएनए को शुरू करने के लिए चुनाव का तरीका बन गया है. Electroporation शुद्ध डीएनए और सक्षम बैक्टीरिया के अलावा, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध जीन नाड़ी नियंत्रक और cuvettes की आवश्यकता है, एक तेजी से, कुशल, और सुव्यवस्थित परिवर्तन विधि है. स्पंदन कदम के विपरीत, electrocompetent कोशिकाओं की तैयारी के मध्य लघुगणक चरण की हो गई दोहराया बाँझ, ठंडे पानी की मात्रा कम करने में centrifugation और washes के चक्कर, या संस्कृतियों की बड़ी मात्रा की गैर ईओण बफ़र्स शामिल गहन समय लगता है और श्रम है विकास. समय और प्रयास वाणिज्यिक स्रोतों से electrocompetent कोशिकाओं की खरीद से बचाया जा सकता है, लेकिन चयन आमतौर पर ई. कार्यरत तक सीमित है कोली प्रयोगशाला उपभेदों. हम इसके द्वारा एक तेजी से प्रसार कर रहे हैंelectrocompetent ई. तैयार करने के लिए कारगर तरीका कुछ समय के लिए जीवाणु विज्ञान प्रयोगशालाओं द्वारा उपयोग में, वी. के लिए अनुकूलित किया जा सकता है किया गया है जो कोलाई, कोलरा और अन्य प्रोकीर्योट्स. हम मूल तकनीक के विकास के लिए ऋण के लिए किसे पता नहीं लगा सकते हैं, हम इसके द्वारा वैज्ञानिक समुदाय के लिए यह उपलब्ध बना रहे हैं.
1980 के दशक में 1 'अपनी स्थापना के बाद से, electroporation के एक अभिन्न आणविक जीव विज्ञान तकनीक, परिपत्र या रैखिक न्यूक्लिक एसिड के साथ / transfect जीवित कोशिकाओं को बदलने के लिए कार्यरत होने की संभावना सबसे आम तरीका बन गया है. मूलतः कोशिकाओं 1 के अभिकर्मक के लिए विकसित की है, electroporation के बाद ई. के परिवर्तन के लिए अनुकूलित किया गया था कोली 2, 3. जीवाणु विज्ञान में, electroporation प्रयोगशाला मानक बन गया है और ग्राम नकारात्मक स्यूडोमोनास 4, Salmonellae 5, Vibrios 6, Serratiae, और Shigellae 7 सहित बैक्टीरिया की एक विस्तृत श्रृंखला को बदलने के लिए संशोधित किया गया है, ग्राम पॉजिटिव Clostridia 8, बेसिली 9, Lactobacilli 10 और enterococci 11. यहां तक कि कुछ archaebacteria Methanococci सहित electroporation द्वारा परिवर्तन करने के लिए उत्तरदायी सिद्ध कर दिया है </उन्हें> 12 और Sulfolobus प्रजातियों 13. एक व्यापक समीक्षा के लिए Aune और Aachmann 14 देखें. Electroporation द्वारा परिवर्तन की क्षमता रासायनिक क्षमता या गर्मी झटका 2 से कथित तौर पर 10-20 गुना अधिक है. हालांकि, बहुत से 1980 के दशक में 15 में डगलस Hanahan से अनुकूलित के रूप में रासायनिक क्षमता के लिए बैक्टीरिया की तैयारी की तरह, कोशिकाओं को भी electrocompetent होने के लिए तैयार रहना चाहिए.
Electroporation electrocompetent बैक्टीरिया, शुद्ध डीएनए, विद्युत आवेग उद्धार एक नाड़ी नियंत्रण मॉड्यूल, और एक इलेक्ट्रोड के रूप में कार्य है कि छोटे डिस्पोजेबल cuvettes accommodates कि एक कक्ष की आवश्यकता होती है, जीवाणु परिवर्तन की एक तेजी से और प्रभावी साधन है. संक्षेप में, ठंड, सक्षम बैक्टीरिया 30-45 मिनट के लिए 30-37 डिग्री सेल्सियस पर incubated विकास मीडिया में resuspended एक क्युवेट में एक उच्च वोल्टेज स्पंद के अधीन प्लास्मिड डीएनए,,, के साथ मिश्रित, और फिर semisolid मध्यम (पोषक तत्व अगर पर चढ़ाया जाता है appr के साथ प्लेट)चयनात्मक एंटीबायोटिक opriate.
स्पंदन कदम, electrocompetent ई. की तैयारी के विपरीत कोली को पारंपरिक रूप से बड़ी मात्रा में किया जाता है कि एक बहुखण्डीय प्रक्रिया बनी हुई है. संक्षेप में, बैक्टीरिया की एक रात में संस्कृति के विकास के मध्य लघुगणक चरण (<1.0 के आयुध डिपो 600) की वृद्धि हुई, और एक बाँझ गैर के साथ धारावाहिक washes के अधीन करने के लिए 1 एल Luria शोरबा (लेग) को 100 मिलीलीटर के साथ एक Erlenmeyer फ्लास्क में inoculated है ईओण 4 डिग्री सेल्सियस पर संस्करणों को कम करने में बफर या डबल आसुत जल (DDH 2 हे) महान देखभाल पूरी प्रक्रिया के दौरान ठंड कोशिकाओं रखने और प्रदूषण को रोकने के लिए लिया जाना चाहिए. इस autoclaved centrifugation बाल्टी और गैर ईओण buffers या DDH 2 ओ का उपयोग, एक कक्षीय प्रकार के बरतन इनक्यूबेटर, एक बड़ी मात्रा में उच्च गति प्रशीतित अपकेंद्रित्र और रोटार के एक सेट की आवश्यकता है. बैक्टीरिया अंत में 10% ग्लिसरॉल के साथ पूरक बफर की एक छोटी मात्रा में resuspended और ~ 40 μl संस्करणों, क में aliquoted रहे हैंआईसीएच उपयोग करें जब तक -80 डिग्री सेल्सियस पर जमा हो जाती है. कम तापमान भंडारण कारण अक्सर समय के साथ व्यवहार्यता के नुकसान तक की कमी परिवर्तन क्षमता में यह परिणाम है.
Electrocompetent बैक्टीरियल कोशिकाओं वाणिज्यिक स्रोतों की विविधता से लेकिन केवल (अक्सर पुनर्संयोजन की कमी) ई. के एक सीमित संख्या के लिए भी उपलब्ध हैं मेजबान plasmids के एक विस्तृत रेंज का प्रचार करने के रूप में कोलाई उपभेदों आमतौर पर कार्यरत हैं. नतीजतन शोधकर्ताओं परिवर्तन के लिए अपने स्वयं के उपभेदों / म्यूटेंट तैयार करने के लिए घर में तरीकों पर भरोसा करते हैं.
Electrocompetent ई. की तैयारी के लिए एक वैकल्पिक, तेजी से और कुशल प्रोटोकॉल कोली अब कुछ समय के लिए कुछ आणविक जीवाणु विज्ञान प्रयोगशालाओं द्वारा उपयोग में किया गया है और हमारे मामले वी. में, अतिरिक्त ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया के लिए बढ़ा दिया गया है कोलरा. यह समय के साथ अन्य शोधकर्ताओं द्वारा अनुकूलित किया गया है के रूप में प्रोटोकॉल के प्रवर्तक नहीं पहचाना जा सकता. यहाँ प्रस्तुत विधि हमारे Laborator में इस्तेमाल किया गया हैलगभग दो दशकों के लिए एँ, और यह हमारे साथियों के साथ इस उपयोगी प्रोटोकॉल साझा करने के लिए हमारा लक्ष्य है.
परिवर्तन दक्षता की परवाह किए बिना सक्षम कोशिकाओं को तैयार करने के लिए नियोजित विधि के कारकों की एक किस्म के अधीन है. अनुरूप चर इस विधि के लिए लागू होते हैं, महान ध्यान रखा जाना चाहिए कि कोशिकाओं वे लगातार ठंड तापमान (कोई उच्च ° 4 से सी) में रखा जाता है कि इस तरह अगर थाली से काटा जाता है एक बार. बैक्टीरियल लॉन सक्रिय रूप से संग्रह के समय में बढ़ जाना चाहिए, कोशिकाओं की वृद्धि के मध्य लघुगणक चरण में होना चाहिए. डीएनए (लवण की यानी संदूषण) की गुणवत्ता परिवर्तन दक्षता को प्रभावित करती है. इस विधि को रोजगार जब विशेष रूप से, अगर क्युवेट में अगर टुकड़े नाड़ी की arcing कारण होगा टूट नहीं किया जाना चाहिए.
इस तकनीक के साथ सामना करना पड़ा अधिकांश समस्याओं दो मुद्दों के साथ जुड़े रहे हैं, वे सक्रिय रूप से बढ़ रहे हैं जब अगर प्लेट से समय का उचित खिड़की के दौरान बैक्टीरिया का संग्रह. बहुत जल्द ही उन्हें इकट्ठा करने के लिए अपर्याप्त सेल नंबर निकलेगा और प्रस्तुत करना होगावे फार्म "pellicule" थाली की सतह से लिफ्ट करने के लिए मुश्किल है क्योंकि निराशा लेग अगर थाली बंद scraping. एकत्रित बैक्टीरिया बहुत देर हो चुकी नाटकीय ढंग से अपनी क्षमता में कमी होगी. समय की खिड़की स्वाभाविक रूप से लेग अगर प्लेटों पर चढ़ाया inoculum के घनत्व के आधार पर अलग अलग होंगे. दूसरा महत्वपूर्ण कदम है कि वे परिवर्तन निम्नलिखित लेग अगर पर चढ़ाया जाता है जब तक वे अगर प्लेट को उठा लिया और 2 CaCl या DDH 2 हे में resuspended पल से (4 डिग्री सेल्सियस) ठंड बैक्टीरिया रखने के लिए है. बैक्टीरिया, cuvettes और बफर युक्त microfuge ट्यूबों पूर्व ठंडा हो और बैक्टीरिया चढ़ाया जाता है जब तक हर समय बर्फ पर रखा जाना चाहिए. बाँझ DDH 2 हे या 2 CaCl वेग होते हैं या दूषित कर रहे हैं फिर भी, जब अतिरिक्त समस्याएं पैदा कर सकते हैं. इस कारण से हम इस अभिकर्मक ताजा तैयार करने की सलाह देते हैं.
समस्या निवारण परिवर्तन बीए बदलने जब नियंत्रण सहित द्वारा सुविधा हैcteria किसी भी विधि द्वारा सक्षम गाया. चयनात्मक मार्कर युक्त एक लेग अगर प्लेट पर चढ़ाया गैर तब्दील सक्षम बैक्टीरिया के एक बैच से मिलकर एक नकारात्मक नियंत्रण तेजी से थाली पर एंटीबायोटिक प्रभावी है कि यह निर्धारित करने में मदद मिलेगी. प्रयोगात्मक नमूने के रूप में एक ही चयनात्मक मार्कर को शरण देने के लिए अच्छी गुणवत्ता और मात्रा का एक ज्ञात प्लाज्मिड तैयारी के साथ एक सकारात्मक नियंत्रण परिवर्तन बैक्टीरिया सक्षम हैं लेकिन यह भी तब्दील प्रयोगात्मक डीएनए मात्रा या गुणवत्ता में पर्याप्त था कि क्या निर्धारित करने में सहायक होगा.
इस तकनीक के फायदे कई हैं, विधि एक परिवर्तन के लिए योजना बनाई है कि एक ही दिन के भीतर बाहर किया जा सकता है. हम (रातोंरात संस्कृति के पहले दिन शुरू करने के लिए भूल के बाद) "आपातकाल" स्थितियों में यह किया है, हम जम बैक्टीरियल ग्लिसरॉल स्टॉक electrocompetence में बिना किसी नुकसान के लेग अगर पर सीधे चढ़ाया जा सकता है कि मिल गया है. हम ई की परीक्षा नहीं सकता हैबहुत तनाव किसी भी ई., ज्ञात कोली या वी. electroporation द्वारा तब्दील किया जा सकता है कि कोलरा तनाव हमारे हाथ में इस प्रोटोकॉल के लिए उत्तरदायी किया गया है. तकनीक, तेजी से प्रभावी है, और पारंपरिक तरीकों को रोजगार electrocompetent बैक्टीरिया की तैयारी से प्राप्त उन लोगों के लिए पैदावार परिवर्तन क्षमता तुलनीय. विधि उच्च गति अपकेंद्रित्र और जुड़े रोटार, एक कक्षीय इनक्यूबेटर शेखर और बाँझ अपकेंद्रित्र बाल्टी (कंटेनर), और autoclaved बफर की बड़ी मात्रा के लिए आवश्यकता समाप्त. विशिष्ट अभिकर्मकों और उपकरणों की तालिका काफी व्यापक है, electroporation के बाहर ले जाने के लिए है कि सबसे प्रयोगशालाओं पहले से ही उपलब्ध इन सामग्रियों की, सबसे अधिक है, अगर नहीं होगा. शायद सबसे महत्वपूर्ण बात, तकनीक आसानी से तेजी से उत्परिवर्ती पृष्ठभूमि के साथ electrocompetent प्रयोगशाला विशिष्ट उपभेदों उत्पन्न करने के लिए लागू किया जा सकता है. यह चुनाव की तैयारी की पारंपरिक विधि बदल दिया गया है के रूप में हम इस तकनीक के किसी भी सीमाओं से अनजान हैंहमारी प्रयोगशालाओं में बैक्टीरिया trocompetent.
यहाँ दिखाए गए हमारे प्रयोगों के परिणामों 1 सप्ताह से अधिक समय नहीं के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया था कि परंपरागत विधि से उत्पादित ताजा electrocompetent कोशिकाओं के साथ किए गए. हालांकि, स्थिर electrocompetent सेल के शेयरों में भंडारण की विस्तारित अवधि से अधिक क्षमता और या व्यवहार्यता खो देते हैं. हमारा संक्षिप्त प्रोटोकॉल उसी दिन परिवर्तन की कमी हुई transformant उपज में हो सकता है, जो शेयर की उम्र के बारे में चिंताओं के बिना योजना बनाई है ताजा electrocompetent कोशिकाओं की तैयारी परमिट. हम यह आवश्यक नहीं किया गया है के रूप में एक और दिन पर उपयोग के लिए तेजी से विधि का उपयोग कर उत्पादन electrocompetent कोशिकाओं के संचय का प्रयास नहीं किया है.
यहाँ नहीं दिखाया गया है, वहीं electrocompetent कोशिकाओं की दक्षता हमारी तेजी से विधि बंधाव मिश्रण के लिए पर्याप्त है का उपयोग कर तैयार. गैर O1 वी. के लिए सूचना दी परिवर्तनों UNTERWEGER एट अल द्वारा हाल ही में एक लेख में कोलरा.17 (संयुग्मन द्वारा किए गए उन लोगों को छोड़कर) यहाँ वर्णित विधि द्वारा तैयार electrocompetent बैक्टीरिया का उपयोग किया गया. इस तकनीक को कोशिकाओं के बड़े समूहों को तैयार करने के लिए बिना तेजी से और प्रभावी ढंग से उत्परिवर्ती पृष्ठभूमि के साथ उपभेदों को बदलने के लिए शोधकर्ताओं देता है. Electrocompetent बैक्टीरिया विधि का यह तेजी से तैयारी की तैयारी के सिद्धांत के रूप में electroporation के लिए उत्तरदायी होना दिखाया गया है और electroporation सेटिंग्स पारंपरिक प्रोटोकॉल के रूप में एक ही होने जा रहे हैं कि अन्य प्रोकीर्योट्स लिए अनुकूलित किया जा सकता है.
The authors have nothing to disclose.
लेखक अपने सहयोगियों और इस तकनीक के विकास का समर्थन किया है कि वर्तमान और अतीत प्रयोगशालाओं के कर्मचारियों के लिए आभारी हैं. सपा की प्रयोगशाला के लिए कनाडा संस्थान द्वारा समर्थित है स्वास्थ्य अनुसंधान ऑपरेटिंग अनुदान एमओपी 84473 और (मेडिकल रिसर्च बंदोबस्ती फंड के लिए अलबर्टा विरासत फाउंडेशन द्वारा वित्त पोषित) अलबर्टा innovates-स्वास्थ्य समाधान. डी पी के MD001091-01 और GM068855-02 अनुदान स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया.
Name of the Equipment | Company | Catalogue number |
Gene Pulser Module | Bio-Rad | 165-2668 |
Gene Pulser Cuvette Chamber | Bio-Rad | 165-2669 |
Electrocuvettes (0.2 cm gap) | Bio-Rad | 165-2082 |
13 x 100 mm Pyrex Rimless Culture Tubes | Corning | 70820-13 |
13 mm Culture Tube Closures | Cole Parmer | EW-04500-00 |
6 x 250 mm Glass Rod | Lab Source | 11381D |
Disposable Petri Dishes | Fisher Scientific | 08-757-12 |
Roller Drum Motor Assembly | New Brunswick Scientific | M1053-4004 |
Roller Drum for 13 x 100 mm Culture Tubes | New Brunswick Scientific | M1053-0306 |
Calcium chloride | Sigma Chemicals | C5670 |
Ethanol, anhydrous/denatured | Sigma Chemicals | 227649 |
Inoculating Loop | Decon Labs | MP182-5 |
Refrigerated Microcentrifuge 5451 R | Eppendorf | 22621425 |
Bunsen Burner | Fisher Scientific | 03-917Q |
LB Broth MILLER | EMD | 1.10285.0500 |
Bacteriological Agar | Fisher Scientific | S25127 |