Summary
التثقيب الكهربائي هو طريقة تستخدم عادة لإدخال الحمض النووي في البكتيريا في عملية تعرف باسم التحول. البروتوكولات التقليدية لإعداد الخلايا electrocompetent هي مضيعة للوقت وكثيفة العمالة. توضح هذه المقالة بديلة وسريعة، وسيلة فعالة لإعداد الخلايا electrocompetent المستخدمة حاليا من قبل بعض المختبرات.
Abstract
أصبح التثقيب الكهربائي وهي طريقة تستخدم على نطاق واسع لبسرعة وكفاءة تقديم دنا غريب في مجموعة واسعة من الخلايا. أصبح Electrotransformation الأسلوب المفضل لإدخال الحمض النووي في بدائيات النوى التي ليست مختصة بشكل طبيعي. التثقيب الكهربائي هو أسلوب التحول السريع والكفاءة، وتبسيط ذلك، بالإضافة إلى تنقية الحمض النووي والبكتيريا المختصة، يتطلب متاحة تجاريا الجينات تحكم النبض وcuvettes. وعلى النقيض من الخطوة النبض، وإعداد الخلايا electrocompetent هو مضيعة للوقت وكثيفة العمالة التي تنطوي جولات متكررة من الطرد المركزي ويغسل في خفض حجم العقيمة، والماء البارد، أو مخازن غير الأيونية كميات كبيرة من الثقافات نمت لمرحلة منتصف لوغاريتمي من النمو. يمكن حفظ الوقت والجهد من خلال شراء خلايا electrocompetent من مصادر تجارية، ولكن اختيار يقتصر على استخداما E. سلالات مختبر القولونية. نحن هنا لنشر السريع وطريقة فعالة لإعداد electrocompetent E. كولاي، والتي تم استخدامها من قبل في مختبرات علم الجراثيم لبعض الوقت، يمكن تكييفها لV. الكوليرا وغيرها من بدائيات النوى. في حين أننا لا نستطيع التأكد من أن الفضل في تطوير تقنية الأصلي، ونحن هنا مما يجعلها متاحة للمجتمع العلمي.
Introduction
منذ ان 'تأسيسها في أوائل 1980s 1، أصبح التثقيب الكهربائي تقنية البيولوجيا الجزيئية لا يتجزأ، من المحتمل واحدة الأسلوب الأكثر شيوعا المستخدمة لتحويل / بالنقل الخلايا الحية مع الأحماض النووية دائري أو خطي. وضعت أصلا لترنسفكأيشن من الخلايا حقيقية النواة 1، تم تكييفها التثقيب الكهربائي في وقت لاحق لتحويل E. القولونية 2، 3. في علم الجراثيم، أصبحت التثقيب الكهربائي معيار المختبر، وقد تم تعديلها لتحويل مجموعة واسعة من البكتيريا سالبة الجرام بما في ذلك الزائفة 4، 5 السالمونيلا، الضمات 6، Serratiae، وشيغيلات 7؛ المطثيات إيجابية الجرام 8، 9 البكتيريا، البكتريا المكونة 10 والمكورات المعوية 11. وقد ثبت حتى بعض العتائق قابلة للتحويل عن طريق التثقيب الكهربائي، بما في ذلك Methanococci 12> وSulfolobus الأنواع 13. لإجراء استعراض شامل يرجى الرجوع إلى لغزة وAachmann 14. كفاءة التحول عن طريق التثقيب الكهربائي يقال 10-20 أضعاف أعلى من الكفاءة الكيميائية أو الحرارة صدمة 2. ومع ذلك، مثل الكثير من البكتيريا إعداد لاختصاص الكيميائية على النحو الأمثل من قبل دوغلاس هاناهان في 1980s 15، كما يجب أن تكون مستعدة لتكون خلايا electrocompetent.
التثقيب الكهربائي هو وسيلة سريعة وفعالة للتحول البكتيرية، والتي تتطلب البكتيريا electrocompetent، الحمض النووي النقي، وحدة تحكم نبض من شأنها أن توفر الدافع الكهربائية، وغرفة تستوعب cuvettes المتاح الصغيرة التي تعمل بمثابة القطب. لفترة وجيزة، يتم خلط الباردة، والبكتيريا المختصة مع الحمض النووي البلازميد، تعرض لنبض عالية الجهد في كوفيت، معلق في وسائط النمو، المحتضنة في 30-37 درجة مئوية لمدة 30-45 دقيقة، ثم مطلي على المتوسط نصف صلبة (المغذيات آجار لوحات) مع APPRopriate المضادات الحيوية انتقائية.
وعلى النقيض من الخطوة النبض، وإعداد electrocompetent E. يبقى القولونية إجراء متعددة الأجزاء التي تتم عادة في كميات كبيرة. لفترة وجيزة، تم تلقيح ثقافة بين عشية وضحاها من البكتيريا إلى دورق مخروطي مع 100 مل إلى 1 لتر مرق لوريا (LB)، ونمت إلى مرحلة منتصف لوغاريتمي النمو (OD 600 من <1.0)، وتعرض ليغسل المسلسل مع غير معقمة الأيونية عازلة أو الماء المقطر المزدوج ([ده 2 O) في خفض كميات في 4 درجات مئوية. يجب توخي الحذر الشديد للحفاظ على الخلايا الباردة في جميع أنحاء الإجراء بأكمله ومنع التلوث. هذا يتطلب استخدام الدلاء الطرد المركزي تعقيمها ومخازن غير الأيونية أو [ده 2 O، حاضنة شاكر المداري، كمية كبيرة عالية السرعة المبردة الطرد المركزي ومجموعة من الدوارات. ومعلق البكتيريا أخيرا في حجم صغير من العازلة تستكمل مع 10٪ الجلسرين وaliquoted في ~ 40 مجلدات ميكرولتر، ذوي الخوذات البيضاءيتم تخزين معنوى في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام. تخزين درجات الحرارة المنخفضة غالبا ما يؤدي إلى انخفاض كفاءة التحول بسبب فقدان جدوى مع مرور الوقت.
الخلايا البكتيرية Electrocompetent وتتوفر أيضا من مجموعة متنوعة من المصادر التجارية ولكن فقط لعدد محدود من (غالبا ما تكون ناقصة إعادة التركيب) E. سلالات القولونية استخداما باعتبارها الدولة المضيفة لنشر مجموعة واسعة من البلازميدات. ونتيجة لذلك تعتمد على أساليب الباحثين في المنزل لإعداد هذه السلالات الخاصة / المسوخ للتحول.
بديل، بروتوكول سريعة وفعالة لإعداد electrocompetent E. وقد القولونية قيد الاستخدام من قبل عدد قليل من المختبرات الجراثيم الجزيئية لبعض الوقت الآن، ولقد تم تمديد للبكتيريا سلبية الغرام إضافية، في حالة V. لدينا الكوليرا. لا يمكن تحديد المنشئ للبروتوكول كما تم تحسين من قبل باحثين آخرين مع مرور الوقت. طريقة المقدمة هنا قد استخدمت في المختبر لديناالمنشأ منذ ما يقرب من عقدين من الزمن، وذلك هو هدفنا لمشاركة هذه بروتوكول مفيدة مع أقراننا.
Protocol
1. إعداد الثقافات البكتيرية، أدوات، والكواشف (DAY 1، بعد الظهر)
- في وقت متأخر بعد الظهر، تطعيم 1-5 مل مرق LB تعقيمها في العقيمة (على سبيل المثال، 100 × 13 ملم) أنابيب الاختبار الزجاجية البورسليكات مع قسامة صغيرة من البكتيريا (إي كولاي أو ضمة الكوليرا).
- تعيين أنابيب الاختبار تلقيح في طبلة بكرة يضم عند 37 درجة مئوية درجة الحرارة (غرفة دافئة أو الحاضنة)، بدوره على طبل الدوارة بسرعة عالية، واحتضان O / N.
- إعداد رش خلية في شكل "عصا الهوكي" من قضيب عن طريق تسخين الزجاج منتصف قضيب في لهب الموقد بنسن حتى يخفف من الزجاج ومن ثم توجيه ينحني برفق مع ملاقط أو كماشة إلى 135 ° زاوية . تسخين قضيب مرة أخرى في نقطة الوسط بين نهاية وأول منعطف وثنيه في زاوية 45 درجة إلى الداخل (في الاتجاه المعاكس من أول منعطف).
- إعداد LB-أجار دون المضادات الحيوية وتصب في أطباق بتري في إعدادبروتوكول electrocompetence، وLB-أجار لوحات تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة (وفقا لعلامة مقاومة على ناقلات إلى أن electroporated)، وتخزينها في 4 درجات مئوية.
- إعداد تصفية تعقيمها 2 مم CaCl 2 حل لV. الكوليرا، أو الأوتوكلاف DDH 2 O لE. القولونية، وتخزينها في 4 درجات مئوية.
2. نمو البكتيريا Electrocompetent (DAY 2، صباح)
- تسليم 100 ميكرولتر من ثقافة O / N البكتيرية على كل لوحة LB أجار، ويمكن أيضا أن تستخدم الأسهم الجلسرين المجمدة وتسليمها على طبق مباشرة.
- تراجع الهوكي على شكل عصا خلية رش في 100٪ ETOH، واستنزاف لفترة وجيزة وحرق ETOH المتبقية لتعقيم أنه قبل استخدامها وانتشارها. نشر ثقافة 100 ميكرولتر O / N البكتيرية بالتساوي مع رش الخلايا العقيمة الزجاج والتأكد من عدم تعطيل (استراحة) سطح أجار.
- احتضان لوحة في 37 درجة مئوية لمدة 4-6 ساعة، أو حتى في الحديقة رقيقة من نمو البكتيريا تكونيأتي تمييزها. الخلايا هي الأكفأ عندما بنشاط متزايد.
3. إعداد الخلايا البكتيرية Electrocompetent (DAY 2، بعد الظهر)
- حصاد البكتيريا مع حلقة بتلقيح العقيمة التأكد من عدم اختراق أو كسر سطح أجار. واحد 2 مم الشامل البكتيرية كافية لتحول واحد. عادة، وهذا يتطلب كشط سطح العشب رقيقة مع حلقة بتلقيح مرتين أو ثلاث مرات. عدة عينات (عادة ما بين 4-6) يمكن جمعها من نفس اللوحة.
- resuspend والشامل البكتيرية في 1 مل من الجليد الباردة 2 مم CaCl 2 (لضمة الكوليرا) أو العقيمة DDH 2 O (للكولاي) وتخلط جيدا حتى عدم وجود كتل واضحة، والحفاظ على الجليد.
- أجهزة الطرد المركزي كل تعليق البكتيرية لمدة 5 دقائق عند 5،000 x ج في microcentrifuge المبردة تعيين إلى 4 درجة مئوية، أو في microcentrifuge تخزينها في غرفة باردة لتعيين 4 درجات مئوية.
- تجاهل طاف، resuspإنهاء بيليه البكتيرية في نفس الحجم من الجليد الباردة 2 مم CaCl 2 أو العقيمة DDH 2 O، وكرر الخطوة الطرد المركزي كما فعلت من قبل مرتين أكثر ليصبح المجموع ثلاثة يغسل.
- إزالة طاف، في resuspend، ومن ثم تخفيف بيليه البكتيرية بدقة في 40 ميكرولتر الجليد الباردة 2 مم CaCl 2 أو العقيمة DDH 2 O والحفاظ على الجليد.
4. تحول البكتيريا Electrocompetent (DAY 2، بعد الظهر)
- تضيف ما يصل إلى 1 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد (في ما يصل إلى 1 ميكرولتر المياه أو عازلة تريس، EDTA) إلى 40 ميكرولتر تعليق البكتيرية ونقل هذا الخليط في قبل المبردة، معقمة 0.2 سم كفيت الفجوة. يجب أن يكون تركيز الملح في عينة من الحمض النووي منخفضة لذلك، لأنها سوف تساهم في الانحناء للنبض في الخطوة التالية.
- إدراج كفيت في غرفة التثقيب الكهربائي وحدة تحكم النبض، وelectroporate في 1.8 كيلو فولت، 25 μF. يجب أن يكون ثابتا وقت ~ 5.0 ميللي ثانية، وينبغي أن يحدث أي الانحناء.
- يتعافى سريعا تعليق الخلية عن طريق إعادة التعليق في 1 مل مرق LB ونقل إلى تعقيمها سابقا أنبوب اختبار الزجاج البورسليكات.
- تسمح للخلايا لاسترداد التي يحتضنها في ظل ظروف النمو الخلوية (في طبلة بكرة) عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة دون اختيار المضادات الحيوية.
- لوحة البكتيريا على معدة مسبقا لوحات أجار LB بحضور وكيل انتقائية مناسبة (المضادات الحيوية)، واحتضان عند 37 درجة CO / N. إذا تحولت البكتيريا مع تركيز عال من ناقلات تنقيته (0.1-1 ميكروغرام البلازميد supercoiled)، وتقديم 10 ميكرولتر من ثقافة البكتيرية على حافة لوحة LB أجار ومع العقيمة متتالية حلقة بتلقيح للمستعمرات معزولة باستخدام طريقة خط رباعي. إذا تم تحويل خليط الربط، تسليم 100 ميكرولتر من ثقافة البكتيرية على كل لوحة أجار وانتشاره بالتساوي مع رش خلية الزجاج معقمة.
وإذا كانت ثابتة الوقت قصير (يكونمنخفضة 3.5 ميللي ثانية)، أو النبض يؤدي إلى الانحناء، ثم إعادة يعجل-عينة الحمض النووي، ويغسل مع 70٪ ETOH مرتين لإزالة الأملاح قبل التجفيف وإعادة التعليق في TE العازلة.
Representative Results
أجرينا مجموعة من التحولات مع E. القولونية وV. الكوليرا لمقارنة كفاءة تحويل منهجيتنا السريع مع التكيف للأسلوب (التقليدية) وصفت في الأصل من قبل الميراث وآخرون. 2 لإعداد البكتيريا electrocompetent. لتنفيذ إعداد التقليدية من الخلايا المختصة، تم تلقيح 500 مل LB في 2 L-دورق مخروطي سعة 500 ميكرولتر مع الثقافة بين عشية وضحاها من E. القولونية DH5α أو V. الكوليرا O395، المحتضنة في شاكر المداري (215 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية) وتحصد في OD 600 من بين 0.5-1.0. تم تبريد القارورة على الجليد والثقافات طرد في الدوار قبل المبردة في 4،000 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. ومعلق الكريات الخلايا بدقة في 500 مل من الجليد الباردة 2 مم CaCl 2 لV. الكوليرا وده 2 O لE. القولونية، وطرد مرة أخرى في ظل نفس الظروف. الجولات اللاحقة من إعادة تعليق لنفذت د الطرد المركزي في خفض حجم 200 مل و 100 مجلدا التأكد ظلت الثقافة المبردة في 4 درجات مئوية. أخيرا، تم إجراء إعادة تعليق والطرد المركزي في حجم 10 مل من الجلسرين مع 10٪. كان بيليه معلق النهائي في 2 مل 10٪ الجلسرين وجمدت 40 ميكرولتر مأخوذة في -80 درجة مئوية وتخزينها لا تزيد عن أسبوع واحد قبل التثقيب الكهربائي.
كانت الظروف التثقيب الكهربائي بما في ذلك إعدادات النبض وحجم كفيت متطابقة لكل من الأنواع البكتيرية في جميع electroporations بغض النظر عن طريقة إعداد الخلايا المختصة. وكان الفرق الوحيد أننا نفذت يغسل في DDH 2 O الباردة لE. القولونية والباردة 2 مم CaCl 2 لV. الكوليرا. يبين الجدول 1 النتائج من البكتيريا تحويلها من قبل التثقيب الكهربائي مماثل ولكن المقدمة المختصة إما مع بروتوكول السريع أو مع الطريقة التقليدية. استخدمناها O395 سلالة DH5α وكما هو شائعتستخدم لاي، ممثل سلالات V. الكوليرا وE. القولونية على التوالي، ويمكن الحصول على نتائج مماثلة مع سلالات أخرى من نفس النوع (وإن لم يكن قد تم اختبار كل سلالة واحدة)، ومن المرجح تكييفها مع غيرها من البكتيريا سلبية الغرام، وربما بعده.
لضمان أن أعداد الخلايا متساوية كانت موجودة في كل دفعة نابض، وكان يتم تجميع البكتيريا electrocompetent إنشاؤها باستخدام الأسلوب السريع على جمع ومختلطة، وأبقى معلقة متجانس، وaliquoted في 40 مجلدات ميكرولتر قبل فترة وجيزة إلى التثقيب الكهربائي. تم علاج البكتيريا Electrocompetent إنشاؤها باستخدام الطريقة التقليدية بالمثل قبل تجميد في 40 ميكرولتر مأخوذة. بعد تسليم النبض، علقت كل دفعة من 40 ميكرولتر البكتيريا electroporated إلى 400 ميكرولتر LB والمخففة متسلسل 01:10. كانت مطلية مائة ميكرولتر من كل تخفيف على LB أجار في وجود 100 ميكروغرام / مل الأمبيسلين وانتشر استخدام رش خلية زجاجية معقمةوالمحتضنة في 37 درجة مئوية خلال الليل. لتحديد العدد الكلي للبكتريا تستخدم في كل تحول، 40 مجلدات ميكرولتر من البكتيريا electrocompetent من كل دفعة على استعداد تم تخفيفه بشكل متسلسل، ومطلي على LB أجار دون المضادات الحيوية مماثل في نفس الوقت. تم electroporated احد قسامة من البكتيريا تعامل على قدم المساواة من كل دفعة مع 1 ميكرولتر تريس، EDTA (TE) العازلة ولكن من دون الحمض النووي (التحول وهمية)، مخففة متسلسل ومطلي على LB أجار دون المضادات الحيوية لتقدير عدد الخلايا فقدت من تسليم نبض كهربائي. أخيرا، جرى الاختلاف إضافية واحدة لتجربة لتحديد ما إذا كانت 30 دقيقة حضانات عند 37 درجة مئوية في 1 مل LB بعد أن التثقيب الكهربائي ولكن قبل الطلاء على LB-أجار تؤثر على الانتعاش من الخلايا المتحولة. تم تعداد الوحدات تشكيل مستعمرة (CFUs) في اليوم التالي.
لهذه التجربة قمنا بتوظيف pUC18، البلازميد المختبر المشتركة، ودفعات من البكتيريا المختصة تتألف منpproximately 10 8 CFUs للخلايا التي أعدت باستخدام الطريقة التقليدية و 10 7 CFUs للخلايا التي أعدت باستخدام بروتوكول السريع. التثقيب الكهربائي وحدها (دون DNA) خفضت CFUs قابلة للحياة من خلال 10-100 أضعاف بغض النظر عن الطريقة المستخدمة لإعداد الخلايا electrocompetent. كما هو مبين في الجدول رقم 1، وكان العائد المحولة داخل 10 -10 6 7 CFUs / ميكروغرام من الحمض النووي في نطاق ثلاث تجارب تكرار (الانحرافات المعيارية بين قوسين) لE. القولونية (DH5α) وV. الكوليرا (O395) على التوالي باستخدام التقليدية، وطريقة إعداد أطول لخلية electrocompetent. ظهرت العائد المحولة انخفضت 10 أضعاف إلى 10 -10 5 6 CFUs / ميكروغرام من الحمض النووي في ثلاث تجارب تكرار (الانحراف المعياري بين قوسين) لE. القولونية وV. الكوليرا على التوالي باستخدام طريقة سريعة. لهذا السبب قررنا أن نسبة البكتيريا تحول بقسمة CFUs حولتقبل استرداد عدد من CFUs من "التحولات وهمية" (بدون البلازميد) من دفعات مماثلة إلا من الخلايا المختصة. كانت نسبة البكتيريا داخل حولت سجل واحد (2،5-9،4٪) بغض النظر عن طريقة التحضير والأنواع تحول (الجدول 1 الأرقام بين قوسين). وتشير هذه النتائج إلى أن كفاءة طريقة سريعة هو مشابه لذلك من الإجراء أطول التقليدية إعداد الخلايا المختصة وأن سلالات ممثل ضمة الكوليرا وكولاي قابلة بالمثل على الإجراء السريع.
وجدنا أن كفاءة التحول، لالبلازميدات مثل pUC18 إيواء أشرطة β-اكتاماز، لا يتأثر الانتعاش مرة 30 دقيقة في مرق LB. تم العثور على نفس العدد من transformants سواء كانت مطلية الخلايا LB أجار في وجود الأمبيسلين مباشرة، وبعد التثقيب الكهربائي، أو ما إذا سمح لهم وقت الانتعاش 30-45 دقيقةفي مرق LB عند 37 درجة مئوية قبل الطلاء. النتائج التي توصلنا إليها أن الأمبيسلين المقاومة لا يتطلب ثمرة في ظل ظروف غير انتقائية يوحي بأن β-اكتاماز التعبير يحدث بسرعة كافية على التحول. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن أجرينا التخفيفات المسلسل من البكتيريا نابض في مرق LB، والتي قد ساهمت في التعافي من الصدمات الكهربائية والشروع في التعبير الجيني.
الشكل 1. تصوير بياني لمنهجية إعداد السريع للبكتيريا electrocompetent. بعد 4-6 ساعة (تبعا لكثافة قائح) أعداد كافية من البكتيريا التي يمكن جمعها لتنفيذ 4-6 التحولات من نفس واحدة LB لوحة أجار. لضمان عدد متساو من الخلايا المختصة لكل وحدة تخزين النهائي ليتم electroporated، تم جمعها من البكتيريا لوحة آغار LB المجمعة في البداية وغسلها معا ثم آلiquoted في 40 مجلدات ميكرولتر اعتمادا على حجم الكرية (كانت مخففة الكريات أكبر في حجم أكبر القسمة على 40 ميكرولتر).
| عدد من مقاومة للأمبيسيلين الحمض النووي transformants / ميكروغرام (transformants المقاوم للالأمبيسلين تعافى [٪]) | ||
| سلالة | الطريقة التقليدية | طريقة سريعة |
| كولاي (DH5α) | 2.3 × 10 6 (± 7.3 × 10 5) [9.4٪] | 3 × 10 6 (± 7.1 × 10 5) [2.5٪] |
| ضمة الكوليرا (O395) | 4 × 10 7 (± 1.7 × 10 7) [5٪] | 6.7 × 10 5 (± 2.1 × 10 5) [3.3٪] |
الجدول 1. كفاءة التحول في ميكروغرام من الحمض النووي (pUC18) من electrocompetent بacteria من الطريقة التقليدية مقارنة مع طريقة سريعة أعدت.
ونفذت جميع التحولات خارجا مع 500 نانوغرام pUC18 الحمض النووي (DNA ~ supercoiled 80٪ كما تصور بنسبة 1٪ الاغاروز الكهربائي للهلام) وكانت مخففة الخلايا electroporated متسلسل 10 أضعاف في مرق LB قبل الطلاء لكفو على LB-أجار مع المضادات الحيوية. ضوابط البكتيريا غير electroporated والبكتيريا دون electroporated البلازميد، المخفف متسلسل ومطلي على LB أجار دون المضادات الحيوية نفذت لكل مجموعة من التحولات لتحديد العدد الكلي للبكتيريا قابلة للحياة قبل وبعد يتقطع. تمثل الضوابط electroporated خط الأساس لفي المئة من البكتيريا قادرة على البقاء تحولت بنجاح.
Discussion
كفاءة التحول يخضع لمجموعة متنوعة من العوامل بغض النظر عن الطريقة المستخدمة لإعداد الخلايا المختصة. تطبيق متغيرات مماثلة لهذه الطريقة، ويجب توخي الحذر الشديد أنه بمجرد أن يتم حصاد الخلايا من لوحة آغار بحيث يتم الحفاظ على درجة حرارة ثابتة الباردة (لا تزيد عن 4 درجات مئوية). العشب البكتيرية يجب بنشاط متزايد في وقت جمع؛ يجب أن تكون الخلايا في مرحلة منتصف لوغاريتمي من النمو. نوعية الحمض النووي (أي تلوث من الأملاح) يؤثر كفاءة التحول. على وجه التحديد، عندما تستخدم هذا الأسلوب، لا ينبغي أن كسر أجار أجار في كأجزاء كفيت سوف يسبب الانحناء للنبض.
وترتبط معظم المشاكل التي واجهتها مع هذه التقنية مع قضيتين؛ جمع البكتيريا خلال نافذة السليم لوقت من لوحة أجار عندما يتم بنشاط متزايد. سوف جمعها في وقت قريب جدا تسفر عن أعداد الخلايا غير كافية وسوف تجعلكشط قبالة لوحة LB أجار محبطة لأن "pellicule" أنها تشكل من الصعب أن يقلع سطح اللوحة. البكتيريا جمع فوات الأوان ستنخفض بشكل كبير اختصاصها. سوف نافذة الوقت تختلف بطبيعة الحال اعتمادا على كثافة اللقاح مطلية على لوحات أجار LB. الخطوة الحاسمة الثانية هي للحفاظ على البكتيريا الباردة (4 ° C) من لحظة يتم رفعها من لوحة آغار ومعلق في 2 و CaCl أو [ده 2 O حتى ومطلي انهم على أجار LB التالية التحول. ينبغي للأنابيب microfuge التي تحتوي على البكتيريا، وcuvettes عازلة تكون قبل المبردة وأبقى على الجليد في جميع الأوقات حتى يتم مطلي البكتيريا. ومع ذلك، يمكن أن تنشأ مشاكل إضافية عندما ده العقيمة 2 O 2 و CaCl أو تحتوي على راسب أو ملوثة. لهذا السبب نحن نوصي لإعداد هذا كاشف الطازجة.
ومما يسهل استكشاف الأخطاء وإصلاحها عن طريق التحول بما في ذلك الضوابط عند تحويل باcteria المقدمة المختصة بأي طريقة. وهناك سيطرة سلبية تتكون من مجموعة من البكتيريا غير المختصة حولت مطلي على صفيحة أجار LB التي تحتوي على علامة انتقائية مساعدة بسرعة تحديد ما إذا كانت المضادات الحيوية على لوحة فعالة. وسوف تحول السيطرة الإيجابية مع إعداد البلازميد معروفة من نوعية جيدة وكمية إيواء نفس علامة انتقائية كما العينة التجريبية تكون مفيدة في تحديد ما إذا كانت البكتيريا هي المختصة ولكن أيضا ما إذا كان الحمض النووي التجريبية حولت كافية في كمية أو نوعية.
مزايا هذه التقنية هي متعددة؛ طريقة يمكن القيام بها خلال اليوم نفسه الذي يتم التخطيط لهذا التحول. لقد وجدنا أن الأسهم الجلسرين البكتيرية المجمدة قد تكون مطلية مباشرة على أجار LB دون أي خسارة في electrocompetence، ونحن قد فعلت ذلك في حالات "الطوارئ" (بعد نسيان لبدء الثقافة بين عشية وضحاها قبل يوم واحد). على الرغم من أننا لا يمكن أن اختبار البريدسلالة جدا معروفة، أي E. كولاي أو V. وكانت سلالة الكوليرا التي يمكن تحويلها من قبل التثقيب الكهربائي قابلة للهذا البروتوكول في أيدينا. تقنية سريع وفعال، وعوائد الكفاءة التحول مماثلة لتلك التي تم الحصول عليها من إعداد البكتيريا electrocompetent توظيف الطرق التقليدية. الأسلوب يلغي شرط للسرعة العالية الطرد المركزي والدوارات المرتبطة بها، شاكر حاضنة المدارية والدلاء الطرد المركزي معقمة (حاويات)، وكميات كبيرة من العازلة تعقيمها. على الرغم من أن جدول الكواشف محددة والمعدات شاملة تماما، فإن معظم المختبرات التي تنفذ التثقيب الكهربائي يكون معظم، إن لم يكن كل، هذه المواد متاحة بالفعل. ربما الأهم من ذلك، هذه التقنية يمكن تطبيقها بسهولة لتوليد سلالات مختبر محددة electrocompetent مع الخلفيات متحولة بسرعة. نحن لا علم له بأي قيود هذه التقنية لأنها حلت محل الطريقة التقليدية في إعداد كهربائيtrocompetent البكتيريا في مختبراتنا.
نفذت نتائج تجاربنا هو موضح هنا خارجا مع خلايا electrocompetent الطازجة المنتجة مع الطريقة التقليدية التي تم تخزينها في -80 درجة مئوية لمدة لا تزيد عن 1 في الاسبوع. ومع ذلك، والأسهم المجمدة خلية electrocompetent تفقد الكفاءة والجدوى أو على مدى فترات طويلة من التخزين. لدينا بروتوكول يسمح مختصرة إعداد الخلايا electrocompetent الطازجة في اليوم نفسه ومن المخطط التحول دون القلق بشأن عمر الأوراق المالية والتي قد تؤدي إلى انخفاض العائد المحولة. نحن لم حاولت تخزين الخلايا electrocompetent أنتجت باستخدام طريقة سريعة للاستخدام في يوم آخر لأن ذلك لم يكن ضروريا.
في حين لم تظهر هنا، وكفاءة الخلايا electrocompetent إعدادها باستخدام طريقتنا السريع كافية لمخاليط ربط. التحولات ذكرت لغير O1 V. الكوليرا في مقال نشر مؤخرا من قبل Unterweger وآخرون.وأجريت 17 من أصل باستخدام البكتيريا electrocompetent من خلال طريقة وصفها هنا (باستثناء تلك التي قامت بها الاقتران) أعدت. هذه التقنية تتيح للباحثين بتحويل سلالات متحولة مع الخلفيات بسرعة وفعالية دون الحاجة إلى إعداد دفعات كبيرة من الخلايا. يمكن تكييفها هذا التحضير السريع للبكتيريا طريقة electrocompetent إلى بدائيات النوى الأخرى التي ثبت أن تكون قابلة للالتثقيب الكهربائي من حيث المبدأ من إعداد والإعدادات التثقيب الكهربائي ستكون نفس تلك البروتوكولات التقليدية.
Disclosures
لا الإفصاحات قابلة للتطبيق.
Acknowledgments
المؤلفون ممتنون لزملائهم وموظفي المختبرات في الحاضر والماضي التي دعمت تطوير هذه التقنية. يتم اعتماد مختبر SP من قبل المعهد الكندي للبحوث الصحية غرانت التشغيل MOP-84473 وألبرتا حلول يبتدع الصحة (بتمويل من مؤسسة التراث ألبرتا للصندوق الهبات للبحوث الطبية). وأيد موانئ دبي من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح MD001091-01-02 وGM068855.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gene Pulser Module | Bio-Rad | 165-2668 | |
| Gene Pulser Cuvette Chamber | Bio-Rad | 165-2669 | |
| Electrocuvettes (0.2 cm gap) | Bio-Rad | 165-2082 | |
| 13 x 100 mm Pyrex Rimless Culture Tubes | Corning | 70820-13 | |
| 13 mm Culture Tube Closures | Cole Parmer | EW-04500-00 | |
| 6 x 250 mm Glass Rod | Lab Source | 11381D | |
| Disposable Petri Dishes | Fisher Scientific | 08-757-12 | |
| Roller Drum Motor Assembly | New Brunswick Scientific | M1053-4004 | |
| Roller Drum for 13 x 100 mm Culture Tubes | New Brunswick Scientific | M1053-0306 | |
| Calcium chloride | Sigma Chemicals | C5670 | |
| Ethanol, anhydrous/denatured | Sigma Chemicals | 227649 | |
| Inoculating Loop | Decon Labs | MP182-5 | |
| Refrigerated Microcentrifuge 5451 R | Eppendorf | 22621425 | |
| Bunsen Burner | Fisher Scientific | 03-917Q | |
| LB Broth MILLER | EMD | 1.10285.0500 | |
| Bacteriological Agar | Fisher Scientific | S25127 |
References
- Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. EMBO J. 1 (7), 841-845 (1982).
- Dower, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation. Nucleic Acids Res. 16 (13), 6127-6145 (1988).
- Taketo, A. DNA transfection of Escherichia coli by electroporation. Biochim. Biophys. Acta. 949 (3), 318-324 (1988).
- Fiedler, S., Wirth, R. Transformation of bacteria with plasmid DNA by electroporation. Anal. Biochem. 170 (1), 38-44 (1988).
- O'Callaghan, D., Charbit, A. High efficiency transformation of Salmonella typhimurium and Salmonella typhi by electroporation. Mol. Gen. Genet. 223 (1), 156-158 (1990).
- Hamashima, H., Nakano, T., Tamura, S., Arai, T. Genetic transformation of Vibrio parahaemolyticus, Vibrio alginolyticus, and Vibrio cholerae non O-1 with plasmid DNA by electroporation. Microbiol. Immunol. 34 (8), 703-708 (1990).
- Grones, J., Turna, J. Transformation of microorganisms with the plasmid vector with the replicon from pAC1 from Acetobacter pasteurianus. Biochem. Biophys. Res. Commun. 206 (3), 942-947 (1995).
- Allen, S. P., Blaschek, H. P. Electroporation-induced transformation of intact cells of Clostridium perfringens. Appl. Environ. Microbiol. 54, 2322-2324 (1988).
- Belliveau, B. H., Trevors, J. T. Transformation of Bacillus cereus vegetative cells by electroporation. Appl. Environ. Microbiol. 55, 1649-1652 (1989).
- Chassy, B. M., Flickinger, J. L. Transformation of Lactobacillus casei by electroporation. FEMS Microbiol. Lett. 44, 173-177 (1987).
- Dunny, G. M., Lee, L. N., LeBlanc, D. J. Improved electroporation and cloning vector system for gram-positive bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 57 (4), 1194-1201 (1991).
- Micheletti, P. A., Sment, K. A., Konisky, J. Isolation of a coenzyme M-auxotrophic mutant and transformation by electroporation in Methanococcus voltae. J. Bacteriol. 173 (11), 3414-3418 (1991).
- Schleper, C., Kubo, K., Zillig, W. The particle SSV1 from the extremely thermophilic archaeon Sulfolobus is a virus: demonstration of infectivity and of transfection with viral DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (16), 7645-7649 (1992).
- Aune, T. E., Aachmann, F. L. Methodologies to increase the transformation efficiencies and the range of bacteria that can be transformed. Appl. Microbiol. Biotechnol. 85 (5), 1301-1313 (2010).
- Hanahan, D. Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids. J. Mol. Biol. 166, 557 (1983).
- Unterweger, D., Kitaoka, M., et al. Constitutive Type VI Secretion System Expression Gives Vibrio cholerae Intra- and Interspecific Competitive Advantages. PLoS One. 7 (10), e48320 (2012).
