Electroporation er en vanlig anvendt metode for å innføre DNA inn i bakterier i en prosess kjent som transformasjon. Tradisjonelle protokoller for fremstilling av electrocompetent celler er tidkrevende og arbeidskrevende. Denne artikkelen beskriver en alternativ, rask og effektiv metode for fremstilling av electrocompetent celler som for tiden anvendes av noen laboratorier.
Electroporation er blitt en utbredt metode for hurtig og effektivt å introdusere fremmed DNA inn i et bredt spekter av celler. Electrotransformation har blitt den foretrukne metode for å innføre DNA inn i prokaryoter som ikke er naturlig kompetente. Electroporation er en hurtig, effektiv og strømlinjeformet transformasjonsmetoden som, i tillegg til renset DNA og kompetente bakterier, krever kommersielt tilgjengelig genet puls kontrolleren og kyvetter. I motsetning til den pulserende trinn er fremstilling av electrocompetent celler tidkrevende og arbeidskrevende omfatter gjentatte runder med sentrifugering og vasker i avtagende mengder av sterile, kaldt vann, eller ikke-ioniske buffere av store volumer av kulturer dyrket til middels logaritmisk fase i vekst. Tid og krefter kan bli frelst ved å kjøpe electrocompetent celler fra kommersielle kilder, men utvalget er begrenset til vanlig ansatt E. coli laboratoriestammer. Vi er herved å spre en hurtig ogeffektiv metode for fremstilling av electrocompetent E. coli, som har vært i bruk av bakteriologi laboratorier i noen tid, kan tilpasses V. cholerae og andre prokaryote celler. Mens vi ikke kan fastslå hvem du kreditt for å utvikle den opprinnelige teknikken, er vi herved gjøre den tilgjengelig for det vitenskapelige miljøet.
Siden 'starten tidlig på 1980-tallet en, har elektroporering blitt en integrert molekylærbiologi teknikk, sannsynligvis den mest vanlige metoden benyttes for å transformere / transfektere levende celler med sirkulær eller lineær nukleinsyrer. Den ble først utviklet for transfeksjon av eukaryote celler 1, ble elektroporering senere tilpasset for transformasjon av E. coli-2, 3. I bakteriologi har elektroporering blitt laboratoriestandard, og er blitt modifisert til å omdanne en lang rekke bakterier, inkludert Gram-negative Pseudo 4, 5 Salmonella, Vibrio-arter 6, Serratiae og shigellae 7, Gram-positive Clostridia 8, Bacilli 9, 10 Lactobacilli og Enterokokker 11. Selv noen archaebacteria har vist seg mottagelig for transformasjon av elektroporering, inkludert Methanococci </em> 12 og Sulfolobus arter 13. For en omfattende gjennomgang henvises til Aune og Aachmann 14. Effektivitet av transformasjon av elektroporering er angivelig 10-20 ganger høyere enn kjemisk kompetanse eller heat shock to. Men mye som forbereder bakterier for kjemisk kompetanse som optimaliseres ved Douglas Hanahan i 1980 15, cellene må også være forberedt på å bli electrocompetent.
Electroporation er en rask og effektiv måte bakteriell transformasjon, krever electrocompetent bakterier, renset DNA, en puls kontroll modul som leverer den elektriske impulsen, og et kammer som rommer små engangs kyvetter som fungerer som en elektrode. Kort fortalt blir kalde, kompetente bakterier blandet med plasmid DNA, utsettes for en høy-spenningspuls i en kyvette, resuspendert i vekstmedier, inkubert ved 30-37 ° C i 30-45 min, og deretter sådd ut på halvfast medium (næringsagar plater) med caopriate selektiv antibiotika.
I motsetning til den pulserende trinn, fremstillingen av electrocompetent E. coli forblir en flerdelt prosedyre som er tradisjonelt utført i store volumer. I korthet blir en over natten kultur av bakterier inokulert i en Erlenmeyerkolbe med 100 ml til 1 L Luria Broth (LB), dyrket til midt-logaritmisk fase av vekst (OD 600 på <1,0), og som er utsatt for serievaskinger med en steril non -ionisk buffer-eller dobbelt-destillert vann (DDH 2 O) i avtagende volumer ved 4 ° C. Stor forsiktighet må tas for å holde cellene kaldt gjennom hele prosedyren og hindre forurensning. Dette krever bruk av autoklaveres sentrifuge bøtter og ikke-ioniske buffere eller DDH 2 O, en orbital risteinkubator, et stort volum med høy hastighet nedkjølt sentrifuge og et sett med rotorer. Bakterier blir til slutt resuspendert i et lite volum av buffer supplert med 10% glycerol, og alikvotert inn ~ 40 ul volumer, which lagres ved -80 ° C inntil bruk. Lav-temperaturlagring ofte resulterer i redusert transformasjonseffektivitet på grunn av tap av levedyktighet over tid.
Electrocompetent bakterielle celler er også tilgjengelige fra en rekke kommersielle kilder, men bare i et begrenset antall (ofte rekombinasjon-manglende) E. coli-stammer som vanligvis blir anvendt som verter for å forplante en rekke plasmider. Som et resultat forskere avhengige av in-house metoder for å forberede sine egne stammer / mutanter for transformasjon.
En alternativ, rask og effektiv protokoll for utarbeidelse av electrocompetent E. coli har vært i bruk av noen få molekylære bakteriologi laboratorier for noen tid nå, og har blitt utvidet til flere Gram-negative bakterier, i vårt tilfelle V. cholerae. Ikke kan identifiseres opphavs protokollen som det har blitt optimalisert av andre forskere over tid. Metoden som er presentert her er benyttet i vår laboratorkaper for nesten to tiår, og det er vårt mål å dele dette nyttig protokollen med våre kolleger.
Transformasjon effektivitet er avhengig av en rekke faktorer, uavhengig av den anvendes til å frem kompetente celler metode. Analoge verdier gjelder for denne metoden, stor forsiktighet må utvises at når cellene er høstet fra agar-plate slik at de blir opprettholdt ved konstant kald temperatur (ikke høyere enn 4 ° C). Den bakteriematten skal være aktivt voksende på tidspunktet for innsamling; cellene må være i midten av logaritmisk vekstfase. Kvalitet på DNA (dvs. forurensning av salter) påvirker transformasjon effektivitet. Nærmere bestemt, ved å benytte denne metoden, agar bør ikke bli brutt som agar-fragmenter i kuvetten vil føre til overslag på pulsen.
De fleste problemene med denne teknikken er forbundet med to problemer, samle bakterier om den riktige tidsvindu fra agar-plate når de aktivt voksende. Samle dem også snart vil gi utilstrekkelige celle tall og vil gjengiskraping av LB agarplate frustrerende fordi "pellicule" de danner er vanskelig å løfte opp fra overflaten av platen. Samle bakterier for sent vil redusere sin kompetanse dramatisk. Vinduet tid vil naturligvis variere avhengig av tettheten av podestoff belagt på LB agarplater. Den andre kritiske trinnet er å holde bakteriene kald (4 ° C) fra det øyeblikk de blir løftet av agar-plate og resuspendert i CaCl 2 eller DDH 2 O inntil de blir sådd ut på LB-agar etter transformasjon. De mikrofuge-rør inneholdende bakterier, kyvetter og buffer bør være pre-kjølt og holdt på is hele tiden inntil bakteriene blir belagt. Imidlertid kan flere problemer oppstå når det sterile DDH 2 O eller CaCl 2 inneholder bunnfall eller er forurenset. Av denne grunn anbefaler vi å forberede denne reagensen frisk.
Feilsøking transformasjon er tilrettelagt av blant annet kontroller når du transformerer BActeria gjengis kompetent av noen metode. En negativ kontroll bestående av en gruppe av ikke-transformerte kompetente bakterier belagt på en LB-agarplate inneholdende det selektive markør hurtig vil bidra til å bestemme hvorvidt antibiotikum på plate er effektiv. En positiv kontroll transformasjon med et plasmid kjent fremstilling av god kvalitet og kvantitet harbo samme selektiv markør som den eksperimentelle prøve vil være nyttig for å bestemme hvorvidt bakteriene er kompetente, men også om den eksperimentelle DNA transformert var tilstrekkelig mengde eller kvalitet.
Fordelene ved denne teknikk er flere, kan metoden bli utført innenfor samme dag som en transformasjon er planlagt. Vi har funnet at frossen bakteriell glyserol lager kan være belagt direkte på LB agar uten tap i electrocompetence, vi har gjort dette i "krise" situasjoner (etter glemme å starte natten kultur dagen før). Selv om vi ikke kunne teste eveldig belastning kjent, noe E. coli eller V. cholerae stamme som kan bli forvandlet ved elektroporering har vært mottagelig for denne protokollen i våre hender. Teknikken er rask, effektiv, og avlingene transformasjon effektivitet sammenlignes med de man får fra å forberede electrocompetent bakterier ansette tradisjonelle metoder. Fremgangsmåten eliminerer behovet for høyhastighetssentrifuge og tilhørende rotorer, en orbital risteinkubator, og sterile sentrifugerør bøtter (beholdere), og store volumer av autoklavert buffer. Selv om Tabell over spesifikke reagenser og utstyr er ganske omfattende, vil de fleste laboratorier som utfører elektroporering har de fleste, om ikke alle, av disse materialene som allerede er tilgjengelig. Kanskje viktigst, kan teknikken bli lett brukes til å generere electrocompetent laboratoriespesifikke stammer med muterte bakgrunn raskt. Vi er uvitende om eventuelle begrensninger i denne teknikken som det har erstattet den tradisjonelle metoden for utarbeidelse av elektrocompetent bakterier i våre laboratorier.
Resultatene av eksperimentene er vist her ble utført med friske electrocompetent celler fremstilt med den tradisjonelle metode som var blitt lagret ved -80 ° C i ikke lenger enn en uke. Men frosne electrocompetent celle bestandene mister kompetanse og eller levedyktighet over lengre lagring. Vår forkortet protokollen tillater utarbeidelse av friske electrocompetent celler samme dag transformasjonen er planlagt uten bekymringer om alder av bestanden som kan resultere i redusert transform yield. Vi har ikke forsøkt å lagre electrocompetent celler produseres ved hjelp av den raske metode for bruk på en annen dag, da dette ikke har vært nødvendig.
Selv om det ikke er vist her, effektiviteten av de electrocompetent celler utarbeidet ved hjelp av vår raske metoden er tilstrekkelig for ligation blandinger. De transformasjoner som er rapportert for ikke-O1 V. cholerae i en fersk artikkel av Unterweger et al.17 ble utført ved hjelp electrocompetent bakterier fremstilt ved fremgangsmåten som beskrives her (med unntak av de som utføres av konjugasjon). Denne teknikken gir forskere å forvandle stammer med mutant bakgrunn raskt og effektivt uten å måtte forberede store grupper av celler. Denne raske fremstilling av electrocompetent bakterier metoden kan tilpasses andre prokaryote celler som har blitt vist å være mottagelig for elektroporering som prinsippet for fremstilling og electroporation innstillinger kommer til å være den samme som for tradisjonelle protokoller.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne er takknemlig til sine kolleger og ansatte med nåværende og tidligere laboratorier som har støttet utviklingen av denne teknikken. SP laboratorium støttes av Canadian Institute for Health Research Drifts Grant MOP-84473 og Alberta fornyer-Health Solutions (finansiert av Alberta Heritage Foundation for Medical Research Endowment Fund). DP ble støttet av National Institutes of Health gir MD001091-01 og GM068855-02.
Name of the Equipment | Company | Catalogue number |
Gene Pulser Module | Bio-Rad | 165-2668 |
Gene Pulser Cuvette Chamber | Bio-Rad | 165-2669 |
Electrocuvettes (0.2 cm gap) | Bio-Rad | 165-2082 |
13 x 100 mm Pyrex Rimless Culture Tubes | Corning | 70820-13 |
13 mm Culture Tube Closures | Cole Parmer | EW-04500-00 |
6 x 250 mm Glass Rod | Lab Source | 11381D |
Disposable Petri Dishes | Fisher Scientific | 08-757-12 |
Roller Drum Motor Assembly | New Brunswick Scientific | M1053-4004 |
Roller Drum for 13 x 100 mm Culture Tubes | New Brunswick Scientific | M1053-0306 |
Calcium chloride | Sigma Chemicals | C5670 |
Ethanol, anhydrous/denatured | Sigma Chemicals | 227649 |
Inoculating Loop | Decon Labs | MP182-5 |
Refrigerated Microcentrifuge 5451 R | Eppendorf | 22621425 |
Bunsen Burner | Fisher Scientific | 03-917Q |
LB Broth MILLER | EMD | 1.10285.0500 |
Bacteriological Agar | Fisher Scientific | S25127 |