Elektroporation är en vanligt använd metod för att införa DNA i bakterier i en process som kallas transformation. Traditionella protokoll för beredning av elektrokompetenta celler är tidsödande och arbetsintensivt. I artikeln beskrivs en alternativ, en snabb och effektiv metod för framställning av elektrokompetenta celler närvarande är anställda av vissa laboratorier.
Elektroporering har blivit en allmänt använd metod för att snabbt och effektivt införande av främmande DNA i ett brett spektrum av celler. Electrotransformation har blivit den föredragna metoden för att införa DNA i prokaryoter som inte naturligt kompetenta. Elektroporation är en snabb, effektiv och strömlinjeformad transformationsmetod som, förutom renat DNA och kompetenta bakterier, kräver kommersiellt tillgänglig gen puls controller och kyvetter. I motsats till pulsningssteget, är framställningen av elektrokompetenta celler tidskrävande och arbetsintensiv involverar upprepade omgångar av centrifugering och tvättningar i minskande volymer sterilt, kallt vatten eller icke-joniska buffertar med stora volymer av kulturer som odlats till mitten av logaritmisk fas i tillväxt. Tid och kraft kan sparas genom att köpa elektro celler från kommersiella källor, men urvalet är begränsat till vanligen använda E. coli laboratoriestammar. Vi skall sprida en snabb ocheffektiv metod för framställning av elektrokompetent E. coli, som har används av bakteriologi laboratorier under en tid, kan anpassas till V. cholerae och andra prokaryoter. Även om vi inte kan fastställa vem till krediter för att utveckla den ursprungliga tekniken, vi härmed göra den tillgänglig för den vetenskapliga gemenskapen.
Sedan "starten i början av 1980-talet 1, har elektroporation blivit en integrerad molekylärbiologi teknik, sannolikt den enskilt vanligaste metod som används för att transformera / transfektera levande celler med cirkulära eller linjära nukleinsyror. Ursprungligen utvecklad för transfektion av eukaryota celler 1, var elektroporation därefter anpassats för transformation av E. coli 2, 3. I bakteriologi har elektroporation blivit laboratoriestandard och har modifierats för att omvandla ett brett spektrum av bakterier, inklusive gramnegativa Pseudo 4, Salmonellae 5, Vibrioner 6, Serratiae och shigella 7, Gram-positiva Clostridia 8, baciller 9, laktobaciller 10 och Enterococci 11. Även vissa Archaebacteria har visat sig mottaglig för transformation genom elektroporation, inklusive Methanococci </em> 12 och Sulfolobus arter 13. För en omfattande översyn, se Aune och Aachmann 14. Effektiviteten av transformation genom elektroporation är enligt uppgift 10-20 gånger högre än kemisk kompetens eller värmechock 2. Men, ungefär som att förbereda bakterier för kemisk kompetens som optimerats av Douglas Hanahan på 1980-talet 15, celler måste också vara beredd att bli elektro.
Elektroporation är ett snabbt och effektivt sätt att bakteriell omvandling, som kräver elektro bakterier, renat DNA, en pulsstyrmodul som levererar elektrisk impuls, och en kammare som rymmer små engångskuvetter som fungerar som en elektrod. I korthet är kalla, kompetenta bakterier blandades med plasmid-DNA, utsattes för en högspänningspuls i en kyvett, återsuspenderades i tillväxtmedium, inkuberades vid 30-37 ° C under 30-45 min, och sedan ströks ut på halvfast medium (näringsagar plattor) med caopriate selektiv antibiotikum.
I motsats till den pulserande steg, framställning av elektrokompetent E. coli förblir en multi procedur som traditionellt utförs i stora volymer. Kortfattat är en nattgammal kultur av bakterier ympades i en Erlenmeyer-kolv med 100 ml till en L Luria Broth (LB), som odlats till mitten av logaritmisk tillväxtfas (OD 600 av <1,0), och utsattes för serietvättningar med en steril icke -jonisk buffert eller dubbeldestillerat vatten (DDH 2 O) i fallande volymer vid 4 ° C. Stor försiktighet måste vidtas för att hålla cellerna kallt under hela proceduren och förhindra kontaminering. Detta kräver användning av autoklaverad centrifugeringsskopor och nonjoniska buffertar eller DDH 2 O, en orbital skakinkubator, en stor volym höghastighets kyld centrifug och en uppsättning av rotorer. Bakterier återuppslammades slutligen i en liten volym buffert kompletterad med 10% glycerol och alikvoterades i ~ 40 | il volymer, WHich lagras vid -80 ° C fram till användning. Lagring låg temperatur resulterar ofta i minskade omvandlingseffektivitet på grund av förlust av livskraft över tiden.
Elektrobakterieceller finns också tillgängliga från olika kommersiella källor men bara för ett begränsat antal (ofta rekombination-brist) E. coli-stammar som vanligen användes som värdar för att fortplanta ett brett spektrum av plasmider. Som ett resultat av forskare förlitar sig på interna metoder för att laga sin egen stammar / mutanter för transformation.
En alternativ, snabbt och effektivt protokoll för beredning av elektrokompetent E. coli har använts av några molekylär bakteriologi laboratorier under en tid nu och har utvidgats till ytterligare gramnegativa bakterier, i vårt fall V. cholerae. Upphovsmannen till protokollet kan inte identifieras som den har optimerats av andra forskare över tiden. Den metod som presenteras här har använts i vår laboratortalet för nästan två decennier, och det är vårt mål att dela denna användbara protokoll med våra kamrater.
Transformationseffektivitet är föremål för en mängd olika faktorer, oavsett den metod som användes för att framställa kompetenta celler. Analoga variabler gäller för denna metod, stor försiktighet måste iakttas så att när cellerna skördas från agarplatta så att de hålls vid konstant låg temperatur (högst 4 ° C). Bakterie gräsmatta måste aktivt växande vid tiden för insamlingen, celler måste vara i mitten av logaritmisk tillväxtfas. Kvalitet på DNA (dvs förorening av salter) påverkar omvandlingseffektiviteten. Specifikt, när man använder denna metod, agar bör inte brytas såsom agar-fragment i kyvetten orsakar Ijusbågsbildning av pulsen.
De flesta problem med denna teknik är förknippade med två frågor, samla in bakterierna under rätt tidsfönster från agarplatta när de aktivt växer. Samla dem för tidigt kommer att ge tillräckligt cell nummer och kommer att göra detskrapa bort LB-agarplatta frustrerande eftersom "pellicule" bildar de är svåra att lyfta bort från ytan av plattan. Samla bakterier för sent kommer att minska sin kompetens dramatiskt. Den tidsfönster kommer naturligtvis att variera beroende på densiteten hos ympen pläterades på LB-agarplattor. Det andra viktiga steget är att hålla bakterierna kallt (4 ° C) från det ögonblick de lyfts bort agarplattan och suspenderades i CaCl2 eller DDH 2 O tills de är pläterade på LB-agar efter transformation. De mikrofugrör innehåller bakterierna, kyvetter och buffert bör vara pre-kylda och hålls på is hela tiden tills bakterierna stryks. Däremot kan ytterligare problem uppstå när det sterila DDH 2 O eller CaCl2 innehåller fällning eller är förorenade. Därför rekommenderar vi att förbereda detta reagens fräsch.
Felsökning omvandlingen underlättas genom att inkludera kontroller när omvandla bacteria återges kompetent med en metod. En negativ kontroll som består av en sats av icke-transformerade kompetenta bakterier ströks ut på en LB-agarplatta innehållande den selektiva markören kommer snabbt att hjälpa till att avgöra huruvida den antibiotiska på plattan är effektiv. En positiv kontroll transformation med en känd plasmid beredning av god kvalitet och kvantitet hyser samma selektiva markören som det experimentella provet kommer att vara till hjälp för att avgöra om bakterierna är kompetent, men också om den experimentella DNA omvandlas var tillräckligt i kvantitet eller kvalitet.
Fördelarna med denna teknik är många; metoden kan utföras inom samma dag som en transformation är planerad. Vi har funnit att fryst bakterie glycerol lager kan vara pläterade direkt på LB-agar utan någon förlust i electrocompetence, vi har gjort detta i "akuta" situationer (efter att glömma att starta natten kultur dagen innan). Även om vi inte kunde testa emycket påfrestning känt, någon E. coli eller V. cholerae stam som kan transformeras genom elektroporation har varit mottaglig för detta protokoll i våra händer. Tekniken är snabb, effektiv, och avkastning omvandlingseffektivitet jämförbara med de som erhållits från att förbereda elektro bakterier som använder traditionella metoder. Metoden eliminerar kravet på höghastighetscentrifug och tillhörande rotorer, en orbital inkubator shaker och sterila centrifughinkar (containrar), och stora volymer av autoklaverad buffert. Även om tabellen av särskilda reagenser och utrustning är ganska omfattande, kommer de flesta laboratorier som utför elektroporation har de flesta, om inte alla, av dessa material som redan finns tillgängliga. Kanske viktigast av allt, kan tekniken appliceras lätt att generera elektrolaboratoriespecifika stammar med muterade bakgrunder snabbt. Vi är omedvetna om eventuella begränsningar av denna teknik som det har ersatt den traditionella metoden för framställning av eltrocompetent bakterier i våra laboratorier.
Resultatet av våra experiment som visas här utfördes med färska elektroceller produceras med den traditionella metoden som hade lagrats vid -80 ° C i högst 1 vecka. Men frusna elektrocelllager förlorar kompetens och eller livsduglighet under lång lagring. Vår förkortad protokoll möjliggör beredning av färska elektrokompetenta celler samma dag omvandlingen planeras utan oro ålder av beståndet som kan resultera i minskad trans avkastning. Vi har inte försökt lagra elektro celler som produceras med hjälp av en snabb metod för användning på en annan dag eftersom det inte har varit nödvändigt.
Även om det inte visas här, effektiviteten i elektrokompetenta celler framställas med användning av vår snabba metod är tillräcklig för ligeringsblandningarna. De transformationer som rapporterats för icke-O1 V. cholerae i en nyligen publicerad artikel av Unterweger et al.17 genomfördes med hjälp av elektro bakterier som utarbetats av den metod som beskrivs här (utom de som utförs av konjugation). Denna teknik ger forskarna att omvandla stammar med muterade bakgrunder snabbt och effektivt utan att behöva förbereda stora partier av celler. Denna snabba beredningen av elektrokompetent bakterie metod kan anpassas till andra prokaryoter som har visat sig vara mottaglig för elektroporation som principen om förberedelser och elektroporation inställningarna kommer att vara desamma som för traditionella protokoll.
The authors have nothing to disclose.
Författarna är tacksamma till sina kollegor och personal av nuvarande och tidigare laboratorier som har stött utvecklingen av denna teknik. SP: s laboratorium stöds av det kanadensiska institutet för hälsoforskning Drift Grant MOP-84.473 och Alberta Innovates-Health Solutions (som finansieras av Alberta Heritage Foundation för medicinsk forskning Endowment Fund). UP stöddes av National Institutes of Health bidrag MD001091-01 och GM068855-02.
Name of the Equipment | Company | Catalogue number |
Gene Pulser Module | Bio-Rad | 165-2668 |
Gene Pulser Cuvette Chamber | Bio-Rad | 165-2669 |
Electrocuvettes (0.2 cm gap) | Bio-Rad | 165-2082 |
13 x 100 mm Pyrex Rimless Culture Tubes | Corning | 70820-13 |
13 mm Culture Tube Closures | Cole Parmer | EW-04500-00 |
6 x 250 mm Glass Rod | Lab Source | 11381D |
Disposable Petri Dishes | Fisher Scientific | 08-757-12 |
Roller Drum Motor Assembly | New Brunswick Scientific | M1053-4004 |
Roller Drum for 13 x 100 mm Culture Tubes | New Brunswick Scientific | M1053-0306 |
Calcium chloride | Sigma Chemicals | C5670 |
Ethanol, anhydrous/denatured | Sigma Chemicals | 227649 |
Inoculating Loop | Decon Labs | MP182-5 |
Refrigerated Microcentrifuge 5451 R | Eppendorf | 22621425 |
Bunsen Burner | Fisher Scientific | 03-917Q |
LB Broth MILLER | EMD | 1.10285.0500 |
Bacteriological Agar | Fisher Scientific | S25127 |