Elektroporation er en almindeligt anvendt fremgangsmåde til indføring af DNA i bakterier i en proces kendt som transformation. Traditionelle protokoller til fremstilling af elektrokompetente celler er tidskrævende og arbejdskrævende. Denne artikel beskriver en alternativ, hurtig og effektiv metode til fremstilling af elektrokompetente celler i øjeblikket ansat af nogle laboratorier.
Elektroporation er blevet en meget anvendt fremgangsmåde til hurtigt og effektivt at indføre fremmed DNA i en lang række celler. Elektrotransformation er blevet den foretrukne metode til indføring af DNA i prokaryoter, der ikke er naturligt kompetent. Elektroporation er en hurtig, effektiv og strømlinet transformation metode, som foruden oprenset DNA og kompetente bakterier kræver kommercielt tilgængelige gen puls controller og kuvetter. I modsætning til det pulserende trin, udarbejdelse af elektrokompetente celler er tidskrævende og arbejdskrævende involverer gentagne runder af centrifugering og vasker i faldende mængder af sterile, koldt vand, eller ikke-ioniske buffere af store mængder af dyrket til midt-logaritmisk fase af vækst. Tid og kræfter kan spares ved at købe elektrokompetente celler fra kommercielle kilder, men valget er begrænset til almindeligt anvendte E. coli laboratoriestammer. Vi er hermed formidle en hurtig ogeffektiv metode til fremstilling af elektrokompetente E. coli, som har været i brug af bakteriologiske laboratorier i nogen tid, kan tilpasses til V. cholerae og andre prokaryoter. Selvom vi ikke kan konstatere, hvem til kredit for at udvikle den oprindelige teknik, er vi hermed gøre den tilgængelig for det videnskabelige samfund.
Siden sin "starten i begyndelsen af 1980'erne 1 er elektroporation blevet en integreret molekylær biologi teknik, sandsynligvis den mest almindelige metode, der anvendes til at omdanne / transfektion levende celler med cirkulære eller lineære nukleinsyrer. Oprindeligt udviklet til transfektion af eukaryote celler 1 blev elektroporation derefter tilpasset til transformation af E. coli 2, 3. I bakteriologi er elektroporation blive et laboratorium standard og er blevet modificeret til at transformere en lang række bakterier, herunder gramnegative Pseudomonas 4, Salmonella 5, vibrioner 6 Serratiae og shigellae 7; grampositive Clostridia 8 Bacilli 9 Lactobacilli 10 og enterokokker 11. Selv nogle Archaebacteria har vist sig egnede til transformation ved elektroporering, herunder Methanococci </em> 12 og Sulfolobus arter 13. For en omfattende gennemgang henvises til Aune og Aachmann 14.. Effektivitet af transformation ved elektroporation er efter sigende 10-20 gange højere end kemisk kompetence eller varmechok 2. Men meget gerne forberede bakterier til kemisk kompetence som optimeres af Douglas Hanahan i 1980'erne 15 celler skal også være parat til at blive elektrokompetente.
Elektroporation er en hurtig og effektiv metode til bakteriel transformation, der kræver elektrokompetente bakterier, oprenset DNA, en puls styremodul, der leverer elektriske impulser, og et kammer, der kan rumme små engangs kuvetter, der fungerer som en elektrode. Kort fortalt er kolde, kompetente bakterier blandes med plasmid-DNA, underkastes en høj spændingsimpuls i en kuvette, resuspenderet i vækstmedier, inkuberet ved 30-37 ° C i 30-45 min og derefter udpladet på halvfast medium (næringsagar plader) med caopriate selektive antibiotikum.
I modsætning til den pulserende trin fremstillingen af elektrokompetente E. coli er fortsat en multipart procedure, der traditionelt udføres i store mængder. Kort fortalt er en overnatskultur af bakterier inokuleret i en Erlenmeyer-kolbe med 100 ml til 1 liter Luria Broth (LB), dyrket til midt-logaritmisk vækstfase (OD600 på <1,0) og udsat for seriel vask med steril ikke -ionisk buffer eller dobbelt-destilleret vand (Hedeselskabet 2 O) i faldende volumener ved 4 ° C. Der skal udvises stor omhu for at holde cellerne kold under hele proceduren og forebygge forurening. Dette kræver brug af autoklaveret centrifugeringstrin spande og ikke-ioniske buffere eller ddH2O, en orbital rysteinkubator, et stort volumen højhastighedstog koelecentrifuge og et sæt af rotorer. Bakterier til slut resuspenderet i et lille volumen buffer suppleret med 10% glycerol og alikvoteres i ~ volumener 40 ul, which opbevares ved -80 ° C indtil brug. Opbevaring ved lav temperatur resulterer ofte i reducerede transformationseffektiviteter grund af tab af levedygtighed over tid.
Elektrokompetente bakterieceller er også tilgængelige fra en række kommercielle kilder, men kun for et begrænset antal (ofte rekombination-mangel) E. coli-stammer, der almindeligvis anvendes som værter til at udbrede en bred vifte af plasmider. Som et resultat forskere stole på in-house metoder til at forberede deres egne stammer / mutanter til transformation.
En alternativ, hurtig og effektiv protokol til udarbejdelse af elektrokompetente E. coli har været i brug ved et par molekylær bakteriologiske laboratorier i nogen tid nu, og er blevet udvidet til flere Gram-negative bakterier, i vores tilfælde V. cholerae. Ophavsmanden til protokollen ikke kan identificeres som det er blevet optimeret af andre forskere over tid. Metoden præsenteres her er blevet brugt i vores laboratorerne for næsten to årtier, og det er vores mål at dele denne nyttige protokol med vores kammerater.
Transformationseffektivitet er omfattet af en række faktorer, uanset den anvendes til fremstilling af kompetente celler metode. Analoge variabler gælder for denne metode, skal der udvises stor omhu, at når cellerne høstes fra agarpladen sådan, at de fastholdes ved konstant kold temperatur (ikke højere end 4 ° C). Den bakterielle plæne skal aktivt voksende på tidspunktet for indsamlingen; celler skal være i midten af logaritmisk vækstfase. Kvaliteten af DNA (dvs. kontaminering af salte) påvirker transformationseffektivitet. Specielt, når der anvendes denne fremgangsmåde agar bør ikke brydes som agar fragmenter i kuvetten vil forårsage gnistdannelse af pulsen.
De fleste problemer med denne teknik er forbundet med to spørgsmål, indsamle bakterier i løbet af ordentlig vindue af tid fra agarpladen når de er aktivt voksende. Indsamle dem for hurtigt vil give tilstrækkelige celletal og vil gøreskrabe LB agarplade frustrerende, fordi den "pellicule", de danner er svært at løfte overfladen af pladen. Indsamling bakterier for sent vil reducere deres kompetence dramatisk. Vinduet tid vil naturligvis variere afhængigt af tætheden af inoculum udpladet på LB-agarplader. Det andet kritiske trin er at holde bakterierne kold (4 ° C) fra det øjeblik, de løftes agarpladen og resuspenderes i CaCl2 eller ddH2O indtil de udplades på LB-agar efter transformation. De mikrocentrifugerør indeholdende bakterier, kuvetter og buffer skal være præ-kølet og holdes på is på alle tidspunkter indtil bakterierne belagt. Dog kan yderligere problemer opstår, når den sterile ddH2O eller CaCl2 indeholder bundfald eller forurenet. Derfor anbefaler vi at forberede denne reagens frisk.
Fejlfinding transformation lettes ved herunder kontrol når omdanne bacteria gjort kompetent ved enhver metode. En negativ kontrol, der består af en batch af ikke-transformerede kompetente bakterier udpladet på en LB-agarplade indeholdende selektionsmarkøren vil hurtigt hjælpe med at bestemme, hvorvidt antibiotikummet på pladen er effektiv. En positiv kontrol transformation med en kendt tilberedning af god kvalitet og kvantitet huser samme selektive markør som den eksperimentelle prøve plasmid vil være nyttige i at afgøre, om bakterierne er kompetent, men også om den eksperimentelle DNA transformeres var tilstrækkelig mængde eller kvalitet.
Fordelene ved denne teknik er multiple, metoden kan udføres inden for samme dag, at en forandring er planlagt til. Vi har fundet, at frosne bakteriel glycerol materiel kan være belagt direkte på LB-agar uden tab i electrocompetence, vi har gjort dette i "nødsituationer" situationer (efter glemmer at starte natten over kultur dagen før). Selvom vi ikke kunne teste emeget stamme kendt, E. coli eller V. cholerae stamme, der kan transformeres ved elektroporation har været modtagelig for denne protokol i vores hænder. Teknikken er hurtig, effektiv og udbytter transformationseffektiviteter sammenlignelige med dem, der opnås fra forberedelse elektrokompetente bakterier anvender traditionelle metoder. Metoden fjerner kravet om høj hastighed centrifuge og tilhørende rotorer, en orbital inkubatorryster og sterile centrifugekurve (containere), og store mængder af autoklaveret buffer. Selvom Tabel over specifikke reagenser og udstyr er ganske omfattende, vil de fleste laboratorier, der udfører elektroporation har de fleste, hvis ikke alle, af disse materialer allerede er tilgængelige. Måske vigtigst af alt, kan teknikken let anvendes til at generere elektrokompetente laboratorie-specifikke stammer med mutant baggrunde hurtigt. Vi er uvidende om eventuelle begrænsninger af denne teknik som den har erstattet den traditionelle metode til fremstilling af elektrocompetent bakterier i vores laboratorier.
Resultaterne af vores eksperimenter vist her blev udført med friske elektrokompetente celler produceret med den traditionelle metode, der havde været opbevaret ved -80 ° C i længere tid end 1 uge. Men frosne elektrokompetente celle lagre mister kompetence og eller levedygtighed over længere opbevaring. Vores forkortet protokol tillader fremstilling af friske elektrokompetente celler samme dag transformationen er planlagt uden bekymringer om alder af bestanden, som kan resultere i nedsat transformant udbytte. Vi har ikke forsøgt at gemme elektrokompetente celler produceret ved hjælp af den hurtige metode til brug på en anden dag, da det ikke har været nødvendigt.
Selv om det ikke er vist her, effektiviteten af de elektrokompetente celler fremstillet ved hjælp af vores hurtige metode er tilstrækkelig til ligeringsblandinger. De transformationer rapporteret for non-O1 V. cholerae i en nylig artikel af Unterweger et al.17 blev udført ved hjælp elektrokompetente bakterier udarbejdet af det her beskrevne (undtagen dem, der udføres ved konjugation) metode. Denne teknik giver forskerne at omdanne stammer med mutant baggrunde hurtigt og effektivt uden at skulle forberede store partier af celler. Denne hurtige udarbejdelse af elektrokompetente bakterier metode kunne tilpasses andre prokaryoter, der har vist sig at være modtagelig for elektroporation som princippet om forberedelse og elektroporation indstillinger vil være det samme som for traditionelle protokoller.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne er taknemmelige for deres kolleger og personale i nuværende og tidligere laboratorier, der har støttet udviklingen af denne teknik. SP laboratorium er støttet af den canadiske Institute for Health Research driftstilskud MOP-84.473 og Alberta innoverer-Health Solutions (finansieret af Alberta Heritage Foundation for Medical Research Endowment Fund). DP'er blev støttet af National Institutes of Health tilskud MD001091-01 og GM068855-02.
Name of the Equipment | Company | Catalogue number |
Gene Pulser Module | Bio-Rad | 165-2668 |
Gene Pulser Cuvette Chamber | Bio-Rad | 165-2669 |
Electrocuvettes (0.2 cm gap) | Bio-Rad | 165-2082 |
13 x 100 mm Pyrex Rimless Culture Tubes | Corning | 70820-13 |
13 mm Culture Tube Closures | Cole Parmer | EW-04500-00 |
6 x 250 mm Glass Rod | Lab Source | 11381D |
Disposable Petri Dishes | Fisher Scientific | 08-757-12 |
Roller Drum Motor Assembly | New Brunswick Scientific | M1053-4004 |
Roller Drum for 13 x 100 mm Culture Tubes | New Brunswick Scientific | M1053-0306 |
Calcium chloride | Sigma Chemicals | C5670 |
Ethanol, anhydrous/denatured | Sigma Chemicals | 227649 |
Inoculating Loop | Decon Labs | MP182-5 |
Refrigerated Microcentrifuge 5451 R | Eppendorf | 22621425 |
Bunsen Burner | Fisher Scientific | 03-917Q |
LB Broth MILLER | EMD | 1.10285.0500 |
Bacteriological Agar | Fisher Scientific | S25127 |