ووصف نهج فحص المواد الموجهة لتطوير سول جل المستمدة من البروتين ميكروأرس مخدر باستخدام طريقة الناشئة دبوس الطباعة من تلفيق. ويتجلى هذا من خلال منهجية تطوير أستيل وmultikinase ميكروأرس، والتي تستخدم لفحص جزيء صغير فعالة من حيث التكلفة.
وقد وجدت ميكروأرس استخدامها في تطوير فحوصات عالية الإنتاجية لمواد جديدة واكتشاف جزيء صغير يؤدي المخدرات. نحن هنا وصف نهج فحص المواد الإرشادية لتحديد المواد مقرها سول جل التي هي مناسبة لإنتاج ميكروأرس بروتين ثلاثي الأبعاد. النهج أولا بتحديد المواد التي يمكن طباعتها كما ميكروأرس، يضيق على عدد من المواد عن طريق تحديد تلك التي تتوافق مع فحص انزيم معين، ومن ثم يشحذ في على مواد الأمثل على أساس الإبقاء على نشاط انزيم أقصى. يتم تطبيق هذا النهج لتطوير ميكروأرس مناسبة لاثنين من المقايسات انزيم مختلفة، واحد باستخدام أستيل والآخر باستخدام مجموعة من أربعة تحركات الرئيسيين المشاركين في السرطان. في كل حالة، كان من الممكن أن ينتج ميكروأرس التي يمكن استخدامها لكمي المقايسات فحص جزيء صغير وإنتاج تعتمد على الجرعة منحنيات استجابة المانع. الأهم من ذلك، هو القدرة على فرز العديد من زميلهأنتجت ريال معلومات عن أنواع من المواد التي تناسب أفضل كل من الانتاج ميكروأري والاحتفاظ نشاط انزيم. توفير البيانات مواد ثاقبة الاحتياجات من المواد الأساسية اللازمة لتفصيل الأمثل، ذات الكثافة العالية سول جل ميكروأرس مشتقة.
اكتسبت ميكروأرس شعبية داخل المجتمع العلمي كوسيلة لزيادة الإنتاجية مقايسة. منذ تطوير تكنولوجيا متطورة لتقييم التعبير الجيني 1 في منتصف 1990s، وقد وجدت ميكروأرس استخدامها في تطوير فحوصات عالية الإنتاجية لتحديد البروتين البروتين والبروتين التفاعلات جزيء صغير، والعثور على مواد جديدة ذات خصائص فريدة من نوعها. 2-5 وفي الآونة الأخيرة، تم تطوير ميكروأرس حيث يتم استخدام مواد معينة لشل حركة بروتينات وظيفية، وتنتج عنصرا ميكروأري ثلاثي الأبعاد الذي يتم فيه شرك البروتينات، والسماح لقياس السطحية من النشاط الأنزيمي وتثبيط على ميكروأري نفسها باستخدام مضان مناسبة مقايسة أن يقترن إلى دوران الركيزة. 5-10 الأهم من ذلك، مثل ميكروأرس يمكن أن تكون مصممة لتشمل جميع المكونات اللازمة لعينات الشاشة والضوابط معا بطريقة يتوازى للغاية. 5،8 </ P>
الأمثلة في وقت مبكر من ميكروأرس البروتين عادة أعدت باستخدام الطرق القياسية لتجميد البروتين على دعامات صلبة، مثل التعلق التساهمية، 11 تقارب التقاط 3 والامتزاز المادية. 12 في حين أن هذه الأساليب من الشلل الحيوية تسمح لزيادة تركيز العينة وحركية التفاعل المعجل المطلوبة لل التصغير فحص، فإنها تعاني كل السلبيات. بشكل عام، كل يسبب انخفاضا في وظيفة جزيء حيوي الأصلي بسبب التعديل الكيميائي للسطح، أعاقت الوصول إلى مواقع نشطة، أو التوجه غير لائق بسبب الشلل غير محددة. وهكذا، كل أساليب نتيجة في أقل حساسية الفحص على الرغم من الزيادة في ترسب جزيء حيوي، استجابة المرجح أن ينشأ بسبب الحاجة إلى ربط مصطنع الجزيئات الحيوية إلى السطح.
نهج الناشئة لإنتاج ميكروأرس جزيء حيوي وظيفية من خلال دبوس الطباعة من البروتين مخدرSOLS السيليكا على دعامات صلبة، والتي عادة ما تكون الشرائح الزجاجية إما functionalized أو الآبار الفردية من لوحات microwell. عملية سول جل نفسه يحدث في بيئة مائي في درجة حرارة الغرفة، وأنه هو مقدمة السائلة التي يتم طباعتها ثم المواد الهلامية إلى الجزيئات الحيوية إيقاع داخل المصفوفة 3D، والسماح لنسبة عالية من البروتين التحميل 13 وكذلك انحباس مكونات متعددة داخل العنصر ميكروأري نفسه. ويمكن أن يتم 13،14 خياطة من المواد سول جل المستمدة من خلال الاختيار الدقيق السلائف السيليكا مختلفة، وكذلك عن طريق تغيير عنصر مائي من خلال استخدام مخازن مختلفة (درجة الحموضة، والقوة الأيونية)، وإدراج المضافات المختلفة (البوليمرات، الجزيئات الصغيرة) لتحقيق مادة الأمثل، وطبيعة محددة من الذي يعتمد على جزيء حيوي أن يتم شرك. 10
وجود قيود المحتملة المرتبطة النامية سول جل ميكروأرس بروتين مشتق عبر دبوس الطباعةالحاجة إلى تحديد المواد المركبة القائمة على سول جل التي يمكن طباعتها دون التبلور في دبوس أو إظهار خصائص غير مرغوب فيه (أحجام irreproducible بقعة، وتكسير، وضعف التصاق، مع عدم توافق مكونات مقايسة، وضعف نشاط بروتين) مرة واحدة مطبوعة على السطح. 5 في وقت واحد الاستفادة المثلى من كل من هذه المعلمات يمنع والمواد حيث النهج ويمكن تصميم دي نوفو، أو فحص ببطء بطريقة تسلسلية. من ناحية أخرى، وفحص عشوائي من عدة آلاف أو عشرات الآلاف من المواد ليس الوقت ولا فعالة من حيث التكلفة.
في هذه المقالة، ونحن تصف نهج الفرز الموجهة التي تتيح التعرف السريع على المواد المناسبة لإنتاج ميكروأرس البروتين دون الحاجة لفحص عشوائي أعداد كبيرة من مواد. باستخدام نهج الموجهة، ويتم تحديد المواد المناسبة للطباعة ميكروأري الأولى، تليها سلسلة من الشاشات الصغيرة لتحديد الأمثل سول جل المستمدة العتادمجموعات القاعدة، والتي يمكن طباعتها بتكاثر، دون تكسير ومتوافقة مع فحص معين. وأخيرا، يتم تحديد المواد الأمثل على أساس الإبقاء على نشاط انزيم والأداء في جزيء صغير الفحص الفحص النهائي. في هذه الطريقة، ويمكن تحديد المواد الأمثل من عدة آلاف من المرشحين باستخدام سوى بضع مئات من الخطوات مقايسة. ونحن لشرح هذا النهج لتصنيع كلا أستيل عالية الكثافة وميكروأرس multikinase واستخدام مثل هذه ميكروأرس لفحص جزيء صغير.
وقد تم اختيار المنهجية الموصوفة هنا باعتباره الأنسب لتحديد طباعة سول جل المواد المشتقة مع طابعة الاتصال، مما ينتج عنه وقت وإجراء فعال من حيث التكلفة لتحديد بسرعة المواد الأمثل دون الحاجة لفحص أعداد كبيرة من مواد. من إجمالي 20،000 ~ المواد المحتملة، وكان من الممكن تحديد ~ 200 المواد التي كانت مناسبة للطباعة على أساس الوقت دبق وحدها. هذا إلى خفض كبير في عدد من المواد اللازمة لتكون على استعداد للمحاكمات الطباعة اللاحقة. ثم تم طبع هذه المواد قابلة للطباعة على السطوح الشريحة 4 ليصبح المجموع 768 تركيبات المواد الشريحة. في المتوسط، 50 اماكن ل/ مكرر من مادة واحدة يمكن أن تكون مطبوعة في ~ 3 دقائق، بما في ذلك تحميل عينة، ترسب بقعة والتنظيف دبوس. من هؤلاء، 155 مواد، أو ما يقرب من 20٪، سمح لطباعة أكبر عدد ممكن من النقاط في امتصاص حل وتنتج أحجام بقعة استنساخه. وتجدر الإشارة إلى أن من ال 4 SLالسطوح IDE اختبارها، وطبع مواد أفضل في الترتيب: أمين> الايبوكسي> ألدهيد> PMMA؛ لم الشرائح PMMA لا تنتج صفائف مفيدة لأي مواد. وكان من المحتمل يعزى ذلك إلى قطبية طلاء السطح. مقارنة أسطح الشرائح المذكورة آنفا، وأمين أكثر القطبية والايبوكسي وأكثر ملاءمة للSOLS مائي مقارنة مع الشرائح PMMA. وعلاوة على ذلك، من السطوح اختبارها، والشرائح المغلفة أمين توفير إمكانات سطح موجبة لتودع أنيوني سول إلى السندات. نشك، والسيليكا النانوية في مجال التفاعل بين الشريحة وسول التفاعل على طول السطح. كل من الايبوكسي والسطوح الشريحة ألدهيد تفتقر إلى نفس التفاعل الأولي على أساس تهمة. لضمان الأمثل ترسب بقعة ينصح بشدة لاستخدام الشرائح قبل المغلفة من مورد مثل Arrayit. طلاء في المنزل تنتج أسطح غير متناسقة التي تؤدي إلى سوء بقعة استنساخ 13 و، في بعض الحالات، قد يؤدي إلى مشكله الكميLEMS 18 من نفس القدر من الأهمية، ودرجة الحرارة والرطوبة تؤثر على "القابلية" من المواد. بينما لم تجر أي دراسات تفصيلية عن الآثار الناجمة عن درجة الحرارة خارج، ونفذت الطباعة دائما في درجة حرارة الغرفة (23 ± 3 درجة مئوية). وتمت السيطرة الرطوبة (أكبر من 80٪) أيضا داخل غرفة الطباعة لمنع عدم انتظام ترسب شكل بسبب ترسب كميات صغيرة (0،7-2،3 NL) والتبخر.
في حين استرشدت شاشة المواد نحو تحديد المواد المشتقة سول جل الأمثل خصيصا لطباعة أستيلكولينستراز وتحركات، مجموعة صغيرة من مواد تم تحديد أن عملت لكلا النوعين من البروتينات. والحقيقة أن كلا من المواد التي تم تحديدها لكيناز ميكروأري تلفيق استندت SS + + PVA الجلسرين، وحددت أيضا كل من المواد في المواد 26 التي اختيرت لميكروأرس الألم. هذه المواد "الأمثل" قد تقدم نقطة انطلاق عام لتطوير مزيد المتواجدفي مخدر سول جل ميكروأرس مقرها، والشاشات الصغيرة تتمحور حول هذه المؤلفات قد تحدد المواد حتى أفضل لميكروأري تلفيق. والنقطة الثانية هو أن نلاحظ أهمية انزيم المستخدمة. في حالة أستيلكولينستراز (انزيم قوية نوعا ما)، 26 (أو ما يقرب من 40٪) من الاصل و66 مواد على النحو المحدد مقايسة المتوافقة مع الإبقاء على النشاط من أستيلكولينستراز شرك. ومع ذلك، لتحركات أكثر حساسية، وكانت قادرة على الإبقاء على نشاط كل تحركات 2 فقط من التراكيب مقايسة متوافق مع 69، أو ما يقرب من 3٪ من المواد،. في حين لم تدرس أعداد كافية من الإنزيمات المختلفة في الإدلاء ببيانات قاطعة، يبدو أن تلفيق مجموعة الأمثل مع الانزيمات مستقرة نسبيا قد تؤدي إلى كشف هوية المواد التي يمكن أن اصطاد مجموعة واسعة من البروتينات للسماح mutliplexed ميكروأري تلفيق.
مستقلة من البروتين المختار، كان العامل قطع رئيسية لتحديد المواد القابلة للطباعة الحاجة لفترة طويلةمرات دبق المادة (> 2.5 ساعة). عند وضع SS القائمة على المواد سول جل، فمن المهم جدا أن يكفل، بعد التبادل الأيوني والترشيح، وسول هو في حوالي درجة الحموضة 4. SOLS مع الرقم الهيدروجيني أقل الأولية قد يؤدي إلى المواد مع الرقم الهيدروجيني أقل مما كان محايدا، والتي يمكن أن تؤثر على نشاط الإنزيم. 19 ضبط كمية من Dowex (راتنج التبادل الأيوني) إلى SS يمكن أن تغير درجة الحموضة النهائية لسول. عندما يتم إعداد دفعة جديدة من الراتنج نسبة الراتنج لSS يحتاج إلى تعديل وذلك لإنتاج حوالي SOLS في درجة الحموضة 4 بعد الإجراء الموجود في المقطع 2 من البروتوكول.
وبالمثل، فإن إعداد DGS البلورية وغالبا ما يكون مصدر الخطأ المرتبط فشل المواد عند استخدام DGS SOLS مقرها لانحباس جزيء حيوي. على الرغم من عدم ذكر هنا بالتفصيل، يحتاج إلى رعاية كبيرة الواجب اتخاذها أثناء تركيب بلوري أسهم دبي للذهب، ولا سيما ضرورة تجنب وجود الماء خلال التوليف، والتي يمكن أن تنتج السيليكا polyglyceratedقسم التدريب والامتحانات بدلا من DGS أحادى. أيضا، نظرا لطبيعة استرطابي من أسهم دبي للذهب، يحتاج العينة البلورية ليتم تخزينها المجفف واستخدامها في غضون 6 أشهر بعد التوليف. أسهم دبي للذهب بلوري تزيد أعمارهم عن 6 أشهر قد لا تذوب تماما (بسبب المختصرة جزئيا مادة سيليكات polyglyceryl) حتى مع صوتنة في بيئة حمضية. أسهم دبي للذهب غير مكتملة حل تنتج SOLS مع محتوى السيليكا غير معروف ويمكن السيطرة عليها، وبالتالي، مواد أقل قوة.
نقطة مهمة أن نلاحظ مع الطباعة الاتصال هي نوعية المسامير. سوف دبابيس تلف أو أسيء التعامل معها (الشكل 9) أبدا إنتاج صفائف استنساخه مستقلة عن المواد التي يجري طباعتها. فمن المستحسن للتحقق من جودة دبوس باستخدام مجهر تشريح لضمان عدم استخدام دبابيس كسر أو انسداد. معالجة متأنية يضمن حياة طويلة للدبابيس. الحركة الحرة للدبوس مهم أيضا. في الحالات التي يتم فيها محاصرة الرطوبة في رأس الطباعة بين الرأس ودبوس، دبوسولن مقعد بشكل صحيح، وبالتالي لا تجعل الاتصال السليم مع السطح، مما أدى إلى عدم وجود ترسب المواد.
في الختام، لقد قدمنا، نهج مفصل الفرز متعددة الخطوات لتطوير عالي الكثافة البروتين مخدر ميكروأرس دبوس المطبوعة. الفحص ينطوي على تعظيم الاستفادة من خصائص المواد (الوقت دبق والقابلية) للسماح للطباعة مواد، تليها فحص أكثر تركيزا على تحديد المواد التي تتوافق مع فحص معين وقادرة على الاحتفاظ نشاط انزيم. ويمكن تطبيق هذا النهج فحص المواد الموجهة إلى صيغ ميكروأري إضافية لخفض الوقت والتكلفة المرتبطة بإنتاج ميكروأرس الكثافة كفاءة عالية.
The authors have nothing to disclose.
المؤلفان بالشكر ماريا فندق Monton، جولي Lebert، Jessamyn ليتل، شين قه ولورا Lautens للمساعدة في تطوير ميكروأرس البروتين. كما نشكر واضعي العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا (NSERC) لتمويل هذا العمل. كما نشكر واضعي مؤسسة كندا للإبداع والابتكار أونتاريو الاستئماني لدعم هذا العمل. مجلس الدفاع المشترك يحمل كرسي أبحاث كندا في الكيمياء Bioanalytical ونظام BioInterfaces.
Reagent/Material | |||
Poly(vinyl alcohol) (PVA) | Sigma-Alderich | 360627 | 80% hydrolozyed, Mw 600 |
Polyethylene glycol 600 (PEG) | Sigma-Alderich | 87333 | |
Polyethylenimine (PEI) | Sigma-Alderich | 482595 | 50% (w/w) solution in water |
Carboxyethylsilanetriol (Si-COOH) | Gelest, Inc. | SIC2263.0 | 25% in water |
N-(3-triethoxysilylpropyl) gluconamide(GLS) | Gelest, Inc. | SIT8189.0 | 50% in ethanol |
bis[(3-methyldimethoxysilyl)propyl]polypropylene oxide (MDSPPO) | Gelest, Inc. | SIB1660.0 | |
Methyltrimethoxysilane (MTMS) | Gelest, Inc. | SIM6560.1 | |
Bis(triethoxysiyly)ethane (Bis-TEOS) | Gelest, Inc. | SIB1817.0 | |
3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES) | Gelest, Inc. | SIA0610.0 | |
Glycerol | Sigma-Alderich | 49767 | |
D-Sorbitol | Sigma-Alderich | 240850 | |
D-(+)-Trehalose dihydrate | Sigma-Alderich | T9531 | |
Triton X-100 | Sigma-Alderich | X-100 | |
Nε-Acetyl-L-lysine | Sigma-Alderich | A4021 | |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Alderich | 154563 | |
HEPES | Sigma-Alderich | H3375 | |
Sodium hydroxide, 1.0 N | LabChem Inc. | LC24350-2 | |
Hydrochloric Acid, 1.0 N/0.1 N | LabChem Inc. | LC15300-2/LC152220-2 | |
Magnesium chloride | Sigma-Alderich | M8266 | |
Diglycerolsilane (DGS) | Prepared in laboratory | ||
Sodium silicate solution | Fisher Scientific | SS338-1 | |
Dowex 50WX8-100 ion exchance resin | Sigma-Alderich | 217492 | |
Acetylthiocholine iodide | Sigma-Alderich | 1480 | |
Acetylcholinesterase from Electrophorus electricus (electric eel) | Sigma-Alderich | C2888 | |
BODIPY FL L-Cystine | Invitrogen | B-20340 | |
Pro-Q Diamond Phosphoprotein/Phosphopeptide Microarray Stain Kit | Invitrogen | P33706 | |
Adenosine 5'triphosphate disodium salt (ATP) solution | Sigma-Alderich | A6559 | |
MAP Kinase 2 (MAPK2) | EMD Millipore | 454850 | |
p38α/SAPK2a (T106M), active | EMD Millipore | 14-687M | |
Epidermal growth factor (EGFR) | EMD Millipore | Donated by Millipore | |
Glycogen synthase kinase 3β (GSK-3β) | EMD Millipore | 14-306 | |
Myelin basic protein (MBP) | EMD Millipore | Substrate for MAPK2 and p38α, Donated by Millipore | |
GSM | EMD Millipore | 12-533 | Substrate for GSK-3β |
Poly-glu-tyr polypeptide p(E4Y) | EMD Millipore | 12-440 | Substrate for EGFR |
Stealth pin | ArrayIt | SMP3 | |
Stealth pin | ArrayIt | SMP7 | |
Amine coated slides | ArrayIt | SMM2 | |
Aldehyde coated slides | ArrayIt | SMA2 | |
Exposy coated slides | ArrayIt | SME2 | |
Poly(methylmethacrylate) (PMMA) coated slides | Exakt Technologies Inc. | 41500 | |
0.2-μm syringe filter | PALL Life Sciences | 4612 | |
Equipment | |||
Virtek Contact Printer | BioRad | ||
Novaray Fluorescence Slide Imager | Alpha Innotech Corporation | ||
Desktop microarray centrifuge | ArrayIt | MHC110V | |
MilliQ Synthesis A10 | Millipore | Used to filter all water required for experiments |