Une approche de dépistage des matériaux guidée pour le développement quantitatives des puces à protéines dérivées Sol-gel

Summary

Une approche de dépistage du matériau guidée de développer des puces dopés protéines dérivées sol-gel en utilisant une méthode pin-impression émergent de fabrication est décrit. Cette méthodologie est illustrée par le développement de l'acétylcholinestérase et multikinase puces, qui sont utilisés pour le criblage de petites molécules rentable.

Abstract

Microarrays ont trouvé une utilisation dans le développement de tests à haut débit pour les nouveaux matériaux et la découverte de pistes de médicaments à petites molécules. Ici, nous décrivons une approche de dépistage du matériau guidée pour identifier les matériaux à base de sol-gel qui sont aptes à produire des puces à protéines en trois dimensions. L'approche identifie d'abord les matériaux qui peuvent être imprimés comme des puces, se réduit le nombre de matériaux en identifiant ceux qui sont compatibles avec un dosage de l'enzyme donnée, puis en pierre sur les matériaux optimaux sur la base rétention de l'activité enzymatique maximale. Cette approche est appliquée pour développer des puces pouvant accueillir deux dosages enzymatiques différentes, l'une utilisant l'acétylcholinestérase et l'autre à l'aide d'un ensemble de quatre kinases clés impliquées dans le cancer. Dans chaque cas, il a été possible de produire des puces qui pourraient être utilisés pour des essais de criblage de petites molécules quantitatifs et la production de courbes de réponse inhibiteur dose-dépendants. Surtout, la capacité de dépister beaucoup compagnonrials produites informations sur les types de matériaux qui conviennent le mieux à la fois la production de puces à ADN et la rétention de l'activité enzymatique. Les données sur les matériaux donnent un aperçu des besoins en matériaux de base nécessaires à l'adaptation optimales, puces dérivées sol-gel à haute densité.

Introduction

Microarrays ont gagné en popularité au sein de la communauté scientifique comme une méthode pour augmenter le débit de dosage. Depuis le développement de la technologie des microréseaux d'évaluer l'expression des gènes ¹ au milieu des années 1990, les puces ont trouvé une utilisation dans le développement de tests à haut débit pour identifier les interactions des molécules protéine-protéine et protéine-petits, et de trouver de nouveaux matériaux aux propriétés uniques. ^2-5 Plus récemment, les puces ont été développées dans lequel des matériaux spécifiques sont utilisés pour immobiliser des protéines fonctionnelles, fabrication d'un élément de puces à ADN en trois dimensions à l'intérieur de laquelle les protéines sont piégées, ce qui permet de mesure aisée de l'activité enzymatique et à l'inhibition de la puce elle-même en utilisant une fluorescence approprié analyse qui est couplé au chiffre d'affaires du substrat. ^5-10 Surtout, ces puces peuvent être conçus pour inclure tous les éléments nécessaires pour analyser des échantillons et des contrôles ainsi que d'une manière très parallèle. ^5,8 </ P>

Les premiers exemples de biopuces de protéines sont généralement préparés en utilisant des procédés standard pour l'immobilisation des protéines sur des supports solides tels que la fixation covalente, ¹¹ affinité capture ³ et l'adsorption physique. ¹² Bien que ces procédés de bio-immobilisation permettent une augmentation de la concentration de l'échantillon et de la cinétique de réaction accélérée requis pour miniaturisation d'essai, chacune d'elles présentent des inconvénients. En général, toutes entraîner une diminution de la fonctionnalité native de biomolécules en raison de la modification chimique de la surface, entravé l'accès à des sites actifs, ou l'orientation inadéquate due à l'immobilisation non spécifique. Ainsi, toutes les méthodes conduisent à la sensibilité du dosage inférieur en dépit d'une augmentation des dépôts de biomolécules, une réponse qui se pose probablement en raison de la nécessité de lier artificiellement biomolécules sur une surface.

Une nouvelle approche pour la production de puces à biomolécules fonctionnelles à travers pin-impression de protéines dopésols de silice sur des supports solides, qui sont généralement des lames de verre soit fonctionnalisés ou des puits individuels de microplaques. Le procédé sol-gel lui-même a lieu dans un milieu aqueux à la température ambiante, et il est le précurseur liquide qui est imprimée et ensuite les gels de biomolécules de piéger à l'intérieur de la matrice 3D, permettant une haute teneur en protéines de chargement ^13, ainsi que le piégeage de composants multiples à l'intérieur de le même élément de microréseau. ^13,14 couture du matériau dérivé sol-gel peut être fait par une sélection soigneuse de différents précurseurs de silice, ainsi que par modification de la composante aqueuse grâce à l'utilisation de différents tampons (pH, force ionique), et l'inclusion d' divers additifs (polymères, de petites molécules) afin de réaliser un matériau optimal, la spécificité dépend de la biomolécule qui est piégé. ¹⁰

Une limitation potentielle associée à l'élaboration des puces à protéines dérivées sol-gel par pin-impressionla nécessité d'identifier les matériaux composites à base de sol-gel qui peuvent être imprimés sans gélifiant dans l'axe ou présentant des propriétés indésirables (tailles reproductibles sur place, la fissuration, mauvaise adhérence, incompatibilité avec les composants d'analyse, l'activité de protéines pauvres), une fois imprimées sur une surface. ⁵ simultanée l'optimisation de l'ensemble de ces paramètres exclut une approche dans laquelle les matériaux peuvent être conçus de novo, ou examiné lentement d'une manière sérielle. D'autre part, le dépistage aléatoire de plusieurs milliers ou dizaines de milliers de documents n'est ni le temps, ni rentable.

Dans cet article, nous décrivons une approche de dépistage réalisé qui permet l'identification rapide des matériaux appropriés pour la production de puces à protéines, sans la nécessité de dépister de façon aléatoire un grand nombre de matériaux. En utilisant une approche guidée, matériaux appropriés pour l'impression microarray sont d'abord identifiés, suivie par une série d'écrans de petite échelle afin d'identifier optimal sol-gel dérivé matériauxcombinaisons al qui peuvent être imprimées de manière reproductible, sans se fissurer et sont compatibles avec un dosage donné. Enfin, les matériaux optimaux sont identifiés en fonction de la rétention de l'activité enzymatique et la performance dans une épreuve finale de dépistage à petite molécule. De cette façon, les matériaux optimaux peuvent être identifiés à partir de plusieurs milliers de candidats à l'aide de seulement quelques centaines de marches d'essai. Nous démontrons cette approche pour la fabrication de deux acétylcholinestérase haute densité et puces de kinases multiples et l'utilisation de ces puces pour le dépistage à petite molécule.

Protocol

1. Préparation des solutions additives

1. Préparer mM de Tris (hydroxyméthyl)-aminométhane 25 et 50 (base _Tris, M 121,14 g / mol) et HEPES (M _r 238,3 g / mol) à un pH de 7,0, 7,2, 7,4, 7,6, 7,8, 8,0 et 8,2 dans 50 ml centrifugeuse des tubes. Ajuster le pH en utilisant 1 N HCl et NaOH, respectivement. Stocker à température ambiante et remplacer au bout de 3 mois.
2. Préparer 24% (p / v) poly (alcool vinylique) (PVA): peser 2,4 g de PVA _(Mw 9.000 - 10.000, 80% hydrolysé) et ajouter 10 ml d'eau déminéralisée distillée (trou DDH ₂ O), dissoudre les granulés de polymère au vortex. Utilisation de la solution à 24% (p / v) pour préparer des volumes égaux de 16% (p / v), 12% (p / v) et 8% (p / v) des solutions de PVA. Solutions Degas par ultrasons avant utilisation. Conserver à 4 ° C pendant 1 mois.
3. Préparer 24% (p / v) de polyéthylène imine (PEI): ajouter 4,8 ml de PEI _(Mw 1300, 50% (p / p) dans H ₂ O) à 5,2 ml de trou DDH ₂ O. Utilisation de la solution à 24% (p / v) pour préparer des volumes égauxde 16% (p / v), 12% (p / v) et 8% (p / v) des solutions PEI. Solutions Degas par ultrasons avant utilisation. Conserver à 4 ° C pendant 1 mois.
4. Préparer 60% (p / v) de polyéthylène glycol (PEG): peser 6 g de PEG _(Mw 600) et ajouter 10 ml de trou DDH ₂ O, dissoudre les pastilles de polymère par vortex. Utilisez dilution en série pour préparer un volume égal de 30% (p / v) la solution de PEG. Solutions Degas par ultrasons avant utilisation. Conserver à 4 ° C pendant 1 mois.
5. Préparer 24% (v / v) de N-(3-triéthoxysilylpropyl) gluconamide (GLS): ajouter 480 l de GLS (50% dans l'éthanol - Photo GLS peuvent nécessiter l'utilisation d'un bain d'eau à chauffer et dissoudre solution si cristalline) à 520 ul de 95% (v / v) d'éthanol et on mélange pendant 20 min par sonication. Utilisez la solution à 24% (v / v) pour faire un volume égal de 16% (v / v) solution GLS. Faire de nouvelles solutions pour une utilisation par jour.
6. Préparer 24% (v / v) méthyltriméthoxysilane (MTMS): ajouter 240 l de MTMS à 760 ul d'exister acidifiée trou DDH ₂ O (pH 2,0, 1 N HCl) et mélanger pendant 20 min par sonification. Utilisez la solution à 24% (v / v) pour faire un volume égal de 16% (v / v) solution MTMS. Faire de nouvelles solutions pour une utilisation par jour.
7. Préparer 24% (v / v) bis [(3-methyldimethoxylsilyl) propyl] oxyde de polypropylène (MDSPPO): ajouter 240 ul de MDSPPO à 760 pl d'exister acidifié trou DDH ₂ O (pH 2,0, HCl 1 N) et on mélange pendant 20 min par sonification. Utilisez la solution à 24% (v / v) pour faire un volume égal de 16% (v / v) solution MDSPPO. Faire de nouvelles solutions pour une utilisation par jour.
8. Préparer 24% (v / v) 3 - (aminopropyl) triéthoxysilane (APTES): ajouter 240 ul de APTES à 760 pl d'exister acidifié trou DDH ₂ O (pH 2,0, HCl 1 N) et on mélange pendant 20 min par sonification. Utilisez la solution à 24% (v / v) pour faire un volume égal de 16% (v / v) APTES solution. Faire de nouvelles solutions pour une utilisation par jour.
9. Préparer 24% (v / v) bis (triethoxysily) éthane (bis-TEOS): ajouter 240 ul de bis-TEOS à 760 pl d'exister acidifié trou DDH ₂ O (pH 2,0, HCl 1 N) Et mélanger pendant 20 minutes par sonification. Utilisez la solution à 24% (v / v) pour faire un volume égal de 16% (v / v) bis-TEOS. Faire de nouvelles solutions pour une utilisation par jour.
10. Préparer 24% (v / v) carboxyethylsilanetriol (Si-COOH): ajouter 960 ul de Si-COOH (25% dans le trou DDH ₂ O) à 40 pl de existant acidifié trou DDH ₂ O (pH 2,0, HCl 1 N) et mélanger pour 20 min par sonification. Utilisez la solution à 24% (v / v) pour faire un volume égal de 16% (v / v) Si-COOH. Faire de nouvelles solutions pour une utilisation par jour.
11. Préparer séparément 3 mM de N _ε - acétyl-L-lysine, la D-sorbitol, α-α-tréhalose (M _r 188,22 g / mole, 182.17 g / mol, et 378,33 g / mol, respectivement) et 1,5 mM de triton X-100 (moyenne _Mw 625 g / mol) dans le trou DDH ₂ O. Les volumes peuvent varier en fonction de combien est nécessaire; faire de nouvelles solutions pour une utilisation par jour.
12. Préparer 60% (p / p) de glycérol: ajouter 2,4 g de glycérine anhydre et 1,6 g de trou DDH ₂ O, mélange par tourbillon. Solution Degaspar sonication avant utilisation. Conserver à 4 ° C pendant 1 mois.
13. Préparer 30% (p / p) de glycérol: ajouter 1,6 g de glycérine anhydre et 2,4 g de trou DDH ₂ O, mélange par tourbillon. Solution Degas par ultrasons avant utilisation. Conserver à 4 ° C pendant 1 mois.

2. Préparation des sols de silice

En suivant les procédures ci-dessous, les sols respectifs, lorsqu'ils sont conservés sur la glace, peuvent être utilisés jusqu'à 1 heure après l'addition d'eau. Sols utilisés au-delà de 1 résultat h à diminuer les temps de gélification matériels / incompatibles.

1. Préparation d'un de silicate de sodium (SS) basée sol
   1. Peser 120 g de résine échangeuse d'ions dans un bécher en plastique de 500 ml.
   2. Ajouter 150 ml de HCl 0,1 N et remuer pendant 1 heure à l'aide d'un barreau magnétique de 2 pouces.
   3. Filtrer la solution à l'aide d'un entonnoir de Büchner relié à vide.
   4. Ajouter lentement le trou DDH ₂ O pour laver la résine filtrée jusqu'à ce que le filtrat résultant est clair. Cela prend environ 100ml de trou DDH ₂ O.
   5. Collecter et stocker la résine préparée dans un récipient en plastique à température ambiante pendant 1 mois.
   6. Peser 2,59 g de silicate de sodium (SS, 27% ​​(p / p) de SiO _2, 10% (poids / poids) de NaOH) dans un bécher en plastique de 50 ml.
   7. Ajouter 10 ml de trou DDH ₂ O à la SS. Agiter doucement par la main pour mélanger la solution.
   8. Peser 5,60 g de résine préparée dans un bécher de 50 ml en plastique séparé. Ajouter à la solution de silicate de sodium et mélanger pendant 2 min à l'aide d'un barreau magnétique d'un pouce.
   9. Filtrer la solution de mélange avec un entonnoir Büchner relié à un aspirateur attaché à un robinet d'eau.
   10. Utilisation d'une seringue en plastique de 10 ml, muni d'une membrane de 0,2 um filtre pour filtrer la solution sol. On obtient ainsi un sol à 5,6% (p / p) de la silice dénommé SS en outre moins. Gardez le sol sur la glace lorsqu'il n'est pas utilisé.
   11. ½ SS: ajouter 1 ml de prêt SS sol à 1 ml de trou DDH ₂ O, mélanger par vortex. Gardez le sol sur la glace lorsqu'ils ne sont pasutiliser.
2. Préparation d'un diglycerylsilane (DGS) basée sol
   1. Synthétiser DGS comme décrit par ailleurs. ^15,16 Boutique DGS cristallines dans un dessiccateur à la température ambiante pendant 6 mois.
   2. Peser environ 1 g de DGS cristallines.
   3. Utilisez un mortier et un pilon pour écraser la DGS en une fine poudre. Terminez cette étape aussi rapidement que possible pour empêcher l'absorption de l'humidité de l'air.
   4. Soigneusement transférer la DGS finement broyées à un 20-ml flacon à scintillation vide, enregistrer la masse (un millième de gramme).
   5. Ajouter le trou DDH ₂ O pour donner un 0,5 g / ml DGS.
   6. Soniquer la DGS hydrolysées sur la glace pendant 20 min, mélanger par vortex pendant 5 secondes toutes les 5 min. Durant les journées humides, la dissolution complète de DGS peut exiger l'addition de 10 pl de HCl 1 N. Cela devrait être ajouté à la solution avant sonication.
   7. Utilisation d'une seringue en plastique de 3 ml, muni d'un filtre pour filtrer la solution sol-membrane de 0,2 um, l'élimination des particules fines. Cela donne un sol avec 5,0% (w / w) silice dénommée DGS dans un texte supplémentaire. Gardez le sol sur la glace lorsqu'il n'est pas utilisé.
   8. ½ DGS: ajouter 1 ml de prêt DGS sol à 1 ml de trou DDH ₂ O, mélanger par vortex. Gardez le sol sur la glace lorsqu'il n'est pas utilisé.

3. Pré-sélection pour identifier les matériaux imprimables

Un schéma général montrant les différentes étapes de l'analyse factorielle guidée utilisé pour identifier les matériaux imprimables est illustré à la figure 1. Un volume minimum de matière total de 100 pi est recommandé. L'utilisation de plus petits volumes rend la visualisation de gélification matérielle difficile.

1. Étape 1: tampon et silane
   1. Ajouter 50 pl de tampon (Tris 25 mM et 50 ou HEPES à pH 7,0, 7,2, 7,4, 7,6, 7,8, 8,0, 8,2) d'une fiole à scintillation en verre 2.
   2. Ajouter 50 pi du sol appropriée (DGS, ½ DGS, SS, SS ½) et le mélange de vortex dans un mode on-et off-pendant 10 secondes pardéplacer le flacon sur et hors du vortex.
   3. Ensemble matériaux se reposer à la température ambiante, la surveillance du temps de gélification du matériau. Le temps de gélification est défini comme étant le point auquel la matière cesse de s'écouler librement lors de la rotation du flacon à un angle de 45 °.
   4. Exclure les combinaisons de matériaux avec des temps de gélification inférieure à 2,5 h de stades de dépistage significatifs postérieurs.
2. Étape 2: tampon, silane et polymère
   1. Dans un flacon à scintillation en verre de 2 ml, ajouter 3,13 pi de solution à 16% (p / v) ou de 8% (p / v) de PVA / PEI ou 6,3 l de 30% (p / v) ou à 60% (p / v) une solution de PEG.
   2. Ajouter HEPES 50 mM (pH 8,0) pour porter le volume combiné de 50 pi, mélanger la solution par vortex.
   3. Ajouter 50 pi du sol appropriée (DGS, ½ DGS, SS, SS ½), mélanger de la façon décrite à l'étape 3.1.2.
   4. Exclure les combinaisons de matériaux avec des temps de gélification (tels que définis à l'étape 3.1.3) moins de 2,5 h à partir des stades de dépistage significatifs postérieurs.
3. Étape 3: tampon, silane, polymère et organosilane
   1. Dans un flacon à scintillation en verre de 2 ml, ajouter 3,13 pl de chaque solution de PVA à 16% (p / v) ou de 8% (p / v) soit 6,3 l de 30% (p / v) ou à 60% (p / v) solution PEG.
   2. Ajouter 3,13 l de 16% (p / v) d'organosilane (GLS, MTMS, MDSPPO, le bis-TEOS, Si-COOH ou APTES).
   3. Ajouter HEPES 50 mM (pH 8,0) pour porter le volume combiné de 50 pi, mélanger la solution par vortex.
   4. Ajouter 50 pi du sol appropriée (DGS, ½ DGS, SS, SS ½) et mélanger à la manière décrite à l'étape 3.1.2. Exclure les combinaisons de matériaux avec des temps de gélification (tels que définis à l'étape 3.1.3) moins de 2,5 h à partir des stades de dépistage significatifs postérieurs.
4. Étape 4: tampon, additif silane, polymère, organosilane et petites molécules
   1. Dans un flacon à scintillation en verre de 2 ml, ajouter 2,08 pl de chaque solution de PVA à 24% (p / v) ou à 12% (p / v) soit 6,3 l de 30% (p / v) ou à 60% (p / v) solution PEG.
   2. Ajouter2,08 l de 24% (p / v) d'organosilane (GLS, Si-COOH).
   3. Ajouter 2,08 ul de la solution à petite molécule de 3 mM (N _ε - acétyl-L-lysine, la D-sorbitol, α-α-tréhalose), soit 1,5 mM (Triton X-100).
   4. Ajouter HEPES 50 mM (pH 8,0) pour porter le volume combiné de 50 pi, mélanger la solution par vortex.
   5. Ajouter 50 pi du sol appropriée (DGS, ½ DGS, SS, SS ½) et mélanger à la manière décrite à l'étape 3.1.2.
   6. Exclure les combinaisons de matériaux avec des temps de gélification (tels que définis à l'étape 3.1.3) moins de 2,5 h de stades d'impression significatifs postérieurs.

4. Préparation des matériaux imprimables Protein dopés

Les matériaux identifiées à la fin de l'étape 3.4.6 sont reportées dans les études d'imprimabilité, avec l'enzyme approprié actuellement incluses dans le sol. Dans tous les cas décrits ci-dessous, une solution aqueuse contenant tous les composants à l'exception du silaneest préparé dans un micropuits, suivi par l'addition du sol juste avant l'impression. Pour permettre l'utilisation d'une plaque de 384 microplaque, un volume de solution total de 50 ul est utilisé au lieu de 100 pi.

1. L'acétylcholinestérase (AChE) microarray
   1. Préparer une solution à 2 kU / ml de l'acétylcholinestérase dans HEPES 50 mM (pH 8,0) suivant l'activité de l'enzyme spécifique du lot (unités d'activité par mg) de l'information fournie par le fabricant.
   2. solution mère d'enzyme aliquote de 2 kU / ml en 5 fractions ul utilisant des tubes à centrifuger de 500 pi et conserver à -20 ° C. 2 solutions mères AChE kU / ml restent stables jusqu'à 4 mois lorsqu'il est conservé à -20 ° C.
   3. Préparer les matériaux de base en combinant la moitié des quantités de polymères correspondants, les organosilanes et les additifs à petites molécules identifiées à l'étape 3.4.6 dans une plaque de microtitration à 384 puits.
   4. Ajouter 5 ul de 2 kU / ml AChE dans HEPES 50 mM (pH 8,0).
   5. Utiliser HEPES 50 mM (pH 8,0), porter le combinéle volume et mix à 25 pi par pipetage la solution de haut en bas plusieurs fois.
2. Multikinase microarray
   1. Préparez 100 solutions de kinases ng / pl (p38a, MAPK2, EGFR, GSK-3β) dans le trou DDH ₂ O après l'activité (U / ml ou U / mg) et de l'information de la quantité fournie par le fabricant. Stocker solutions de kinases en aliquots de 2 pi à -80 ° C.
   2. Préparez-kinase substrats (MBP, p (E ₄ Y), GSM) à 5 mg / ml, 50 uM mg / ml ou 300 dans le trou DDH ₂ O, suite à l'information sur la quantité fournie par le fabricant. Boutique substrats en aliquots de 2,5 pi à -80 ° C.
   3. Préparer les matériaux de base en combinant la moitié des quantités de polymères correspondants, les organosilanes et les additifs à petites molécules identifiées à l'étape 3.4.6 dans une plaque de microtitration à 384 puits.
   4. Pour chaque puits contenant les matériaux de base, ajouter 2,5 ul kinase et 2 pi de son substrat respectif (p38a et MBP, MAPK2 et MBP, EGFR et P (E ₄ Y), GSK-3β et GSM) tel que préparé dans les étapes 4.2.1 et 4.2.2, respectivement.
   5. Utiliser HEPES 50 mM (pH 7,4), porter le volume ainsi combinée à 25 pl. Mélanger à la pipette.

5. Formation biopuces

Cette section explique la procédure détaillée pour les matériaux d'impression sur une surface de glissement unique. Pour imprimer sur de multiples surfaces de glissement modifiés (amine, époxy, aldéhyde et PMMA), cette procédure est répétée 4 fois.

1. Former des puces en utilisant un contact robot de pin-impression équipé d'une platine XYZ. Utilisez des épingles de gaine fendue de 100 um de diamètre pour déposer les sols protéines dopés.
2. Ensemble d'humidité à l'intérieur de la chambre de l'impression de 80 à 90%. Humidité <80% peut entraîner une évaporation de l'échantillon et des incohérences dans l'impression, en raison des faibles volumes de dépôts.
3. Soniquer repères dans le trou DDH ₂ O pendant 15 min avant l'impression et le sèche sous un courant d'azote. Utilisez un tuyau cleaner pour éliminer l'humidité résiduelle dans le support d'axe et placer soigneusement la broche dans la tête d'impression. Échec pour éliminer l'humidité résiduelle peut entraver la broche de se déplacer librement avec le porteur, traduit par des taches manquées.
4. configurations de réseaux de contrôle par le biais du programme Chip Writer Pro (CWP). Pour chaque échantillon, bien dans la plaque source 384 puits, 200 places (nombre maximum de taches par absorption à l'aide de la goupille de gaine SMP3) sont imprimés sur une lame de verre à surface modifiée.
5. Commencer le processus d'impression par le biais du logiciel. Réglez voyage dans la direction XY à 10 mm / s et la vitesse d'approche échantillon (direction Z) à 2 mm / s avec un échantillon sec temps de chargement 2.5.
6. Mettre en pause la course par CWP. Abaissez la broche dans l'échantillon et ajouter 25 ul du sol respectif (DGS, ½ DGS, SS, SS ½) pour le bien de pipette. Mélanger la solution en utilisant un mouvement de va-et-vient de pipetage répété 50x. Lors du mélange par pipetage, de réduire la quantité d'air incorporée dans la solution. Air bulles préventiont chargement complet de l'échantillon à l'intérieur de la tige.
7. Commencer le processus d'impression par CWP et imprimer l'échantillon sur une surface de glissement. Interrompre le processus d'impression avant le chargement de l'échantillon à partir de la plaque de source ultérieur bien.
8. Retirer la broche de l'impression à l'aide d'un aimant et de placer un cure-pipe dans la tête d'impression pour empêcher l'accumulation d'humidité dans la tête d'impression.
9. Rincer la broche d'impression avec le trou DDH ₂ O, et soniquer en propre trou DDH ₂ O pendant 30 sec.
10. Séchez la broche d'impression sous un courant d'azote et retirer le cure-pipe, en plaçant la goupille de retour dans la tête d'impression.
11. Commencer l'impression en suivant les étapes 05.06 au 05.10, pour tous les échantillons restants au sein de la plaque source. Jusqu'à 12.000 points de 100 um de diamètre peut être déposé sur une seule diapositive.
12. Cette méthode peut également être appliquée aux matériaux d'impression sur le fond du puits dans une microplaque de 96 puits. Après le fichier de calibration CWP, recalibrer la broche d'impression pour assurer la distanciationCE a remonté entre le dépôt de la place est au-dessus de la hauteur de la microplaque. Cela permet à la broche d'imprimer systématiquement de puits en puits d'une façon linéaire, sans endommager la broche.
13. Age du tableau pour un minimum de 30 min et jusqu'à 24 heures dans la chambre de l'impression à 80-90% d'humidité après l'achèvement de toute l'expérience de l'impression.

6. Activité de l'acétylcholinestérase Assay

1. Préparation des échantillons de contrôle positif (CP)
   1. Préparez 1 mM iodure de acétylthiocholine (atch: M _r 289,18 g / mol) dans 4% de glycérol, Tris 25 mM (pH 7,0) dans un tube de 1,5 ml. Atch doit être préparé avant chaque utilisation et en utilisant un tampon à pH 7,0 comme des tampons de pH plus élevées provoquent autohydrolyse rapide, produisant des faux positifs. Le volume final peut varier en fonction du nombre d'échantillons (25 ul par échantillon).
   2. Ajouter 0,14 pi de 5 mM bodipy-FL-L-cystine à 25 pi de 1 mM atch dans le puits d'une microplaque de 384 plate.
   3. Ajoutez 24,86 pi 4% de glycérol, Tris 25 mM (pH 7,0), mélanger par pipetage avec soin pour éviter la formation de bulles dans la solution. Les inhibiteurs potentiels d'enzymes peuvent être incorporés dans la solution de PC avant de mettre le volume à 50 pi avec un tampon.
2. Préparation des échantillons témoins négatifs (NC)
   1. Ajouter 0,14 pl de 5 mM BODIPY-FL-L-cystine à 49,86 l de 4% de glycérol, 25 mM Tris (pH 6,5) dans le puits d'une plaque de microtitration à 384. Mélanger à la pipette.
3. Surimpression PC et solutions NC
   1. Surimpression les puces d'âge suivant les étapes 5.1 à 5.10 (étape 5.6 ignorant) du protocole. Utilisez des épingles de gaine fendue de 235 um de diamètre pour déposer les solutions de surimpression NC et PC. Cela garantit la solution couvre l'endroit préalablement déposé entièrement.
   2. matrices d'âge à 80-90% d'humidité pendant 1 heure à température ambiante. En raison de la autohydrolyse de atch, les temps d'incubation plus longs peuvent entraîner des faux positifs ou augmenté enZYME activité.

7. Kinase Activity Assay

1. Préparez 500 uM de solutions adénosine 5'-triphosphate (ATP) en utilisant le stock ATP (100 mm) conservés à -20 ° C. Faire une nouvelle solution pour chaque expérience et ajuster le volume à un besoin expérimental: chaque solution d'impression nécessite 5 pl.
2. Préparer un chlorure de magnésium 100 mM (MgCl _{2: r} 95,21 g / mol M) solution mère dans le trou DDH ₂ O.
3. Contrôle positif (CP)
   1. Ajouter 2,5 l de 100 mM MgCl ₂ et 5 pi 500 uM ATP pour le bien d'une plaque de 384 microplaque.
   2. Porter le volume total du puits à 50 pi avec HEPES 50 mM (pH 7,4) et mélanger par pipetage. Les inhibiteurs potentiels d'enzymes peuvent être incorporés dans la solution de PC avant de mettre le volume à 50 pi avec un tampon.
4. Contrôle négatif (NC)
   1. Ajouter 2,5 l de 100 mM MgCl ₂ et 5 pi trou DDH ₂ O pour le bien d'un 384-mPlaque de icrotiter.
   2. Porter le volume total du puits à 50 pi avec HEPES 50 mM (pH 7,4) et mélanger par pipetage.
5. Surimpression PC et cofacteurs d'essai NC
   1. Suivez l'étape 6.3.1 du protocole.
   2. matrices d'âge à 80-90% d'humidité pendant 2 h à température ambiante.
6. coloration de lames
   1. Lieu microarray imprimé glisse individuellement dans une boîte de Pétri avec suffisamment de colorant (dans le kit) pour couvrir toute la diapositive. Agiter modérément (~ 200 rpm) pendant 45 min à l'aide d'un agitateur de plaque.
   2. Retirer la lame en utilisant une pince et le placer dans une boîte de Petri propre avec un tampon de lavage (dans le kit). Agiter modérément (~ 200 rpm) pendant 45 min à l'aide d'un agitateur de plaque.
   3. Retirez la lame à l'aide des pinces et essorer l'aide d'une micro-centrifugeuse de puces de bureau classique équipé d'un support de diapositives.

8. Biopuces imagerie et d'analyse

1. Imaging

   Notez que la méthode d'imagerie sera spécifique le type de lecteur de réseau disponible. Pour ces études, un Alpha Innotech NovaRay imageur avec une source de lumière blanche et un système de détection CCD équipé d'un 478 ± 17 nm d'excitation et 538 ± 21 filtre nm d'émission pour les puces de ventre, et 530 ± 40 nm d'excitation et 614 ± 62 émissions nm filtrer les puces de kinases ont été utilisées. Systèmes de balayage laser confocal peuvent également être utilisés pour la lecture des tableaux, si les réglages sont spécifiques à l'instrument.

   1. Placer la lame dans le support de diapositives avec des taches vers le haut.
   2. Définissez le nombre de sections d'aperçu (un minimum de 2 est recommandée, une à chaque extrémité de la lame de microscope), la résolution (un minimum de 4 um est recommandé) et l'exposition (auto est recommandé) dans le logiciel d'imagerie.
   3. Acquérir image de diapositive et enregistrer dans un fichier ". Tiff".
2. Analyse
   1. Ouvrez image de diapositive acquise en ImageJ64.
   2. Cliquez sur l'outil de sélection ovale et de mesurer l'intensité du signal de chaque spot en utilisant l'option de mesure sous l'onglet analyser. Lors de la sélection de la zone à mesurer, sélectionnez une région légèrement plus grande que la tache observée et de taille uniforme entre les taches de réduire ImageJ subjectivité.
   3. L'intensité moyenne de 25 points de PC similaires, divisé par l'intensité moyenne sur 25 points NC semblables à obtenir des rapports de PC / NC pour les compositions de matériaux différents.

Representative Results

En effectuant une analyse factorielle guidée de l'écran de matériel, nous avons réussi à réduire le nombre de matériaux testés à partir de ~ 20.000 à quelques centaines qui a eu temps de gélification appropriés pour l'impression. En appliquant une directive exigeant du temps de gélification du matériau stricte de 2,5 heures ou plus, les matériaux susceptibles d'obstruer les aiguilles d'impression ou de produire des tableaux reproductibles n'ont jamais été imprimé. Les matériaux imprimables identifiés avoir suffisante (> 2,5 h) temps de gélification ont été imprimés sur 4 surfaces de glissement de verre fonctionnalisés différents. Pour être considéré comme "imprimable", le nombre maximum de points pour un volume d'absorption de la broche a dû être imprimé (SMP3 = 200). Spots ont également été évalués pour la première place morphologie afin de s'assurer qu'aucune séparation de phase fissuration ou indésirables s'était produite en utilisant la microscopie en fond clair simples comme le montre la figure 2.

A partir de ce stade de matériaux imprimables identifiés, les puces ont été produites à l'AChE etkinases incorporées dans le composant aqueux tamponné. Les matériaux qui sont compatibles avec la procédure de test (y compris surimpression potentiel et le lavage ou la coloration étapes) ont été identifiés par l'observation de la rétention des taches microarray (pas de fissure, la perte de points ou de motifs de fluorescence inhabituels) et un contrôle positif (PC) à un contrôle négatif (CN ) ratio supérieur à 1, comme observé à travers l'image. Comme il s'agissait d'environ 50% des matières, un ratio de PC / NC plus de 3 a été utilisé pour définir les matériaux optimaux avec maintien de l'activité de la protéine. Grâce à cette méthode, 26 matériaux sol-gel dérivés contenant des matières Ache et 2 contenant des kinases satisfait aux critères> 3 PC / NC. Figures 3 et 4 montrent une répartition graphique des 5 étapes à l'écran matériels guidées pour l'identification de l'acétylcholinestérase et kinase optimale microarrays, respectivement.

Les tests pourraient également être validés par la génération de marquer un Z ^'17. Figure 5 montre parcelle Z 'obtenue en comparant le signal généré à partir de 200 places, 100 PC et 100 NC après surimpression le colorant indicateur et le substrat sur ​​le tableau AChE. La douleur et les tableaux de kinases ont donné lieu à des scores Z 'respectifs de 0,60 et 0,67, indiquant une excellente analyse. Toutefois, il convient de noter que, avant la validation des essais, les concentrations enzyme, un colorant, le substrat et le cofacteur sur-array ont dû être optimisé par surimpression une gamme de concentrations de chaque composant et en sélectionnant la concentration qui produit le signal le plus élevé, comme décrit en détail ailleurs ^5.

Pour valider les analyses, les données quantitatives d'inhibition ont été obtenus en utilisant des inhibiteurs de l'AChE connus et inconnus, avec des résultats réalisés en double et utilisé pour produire des tracés en double (figure 6A) et les courbes d'inhibition (figures 6B et 6C). <strong> Spots ont d'abord été surchargés avec des mélanges d'inhibiteurs à petite molécule biologiquement actives connues puis avec de la teinture et du substrat, et les mélanges de contrôle contenant soit des inhibiteurs connus ou pas d'inhibiteur ont été inclus. Parcelles en double ont été réalisées pour évaluer l'activité enzymatique, et les mélanges qui ont abouti à l'activité de l'enzyme moins de 25% ont été considérés comme positifs pour l'inhibition. Composés individuels de ces mélanges ont ensuite été testés en double à identifier la petite molécule spécifique (s) responsable de l'inhibition. Une fois identifiés, ces petites molécules ont été utilisés pour générer des courbes d'inhibition quantitatives pour déterminer les valeurs _IC50 et les constantes d'inhibition.

Résultats qualitatifs similaires ont été obtenus en utilisant le tableau de kinases avec un inhibiteur de la kinase commun, staurosporine. Figure 7A et 7B montrent l'image des puces et indiquent que les intensités du signal après la surimpression et la coloration du multikinaseréseau sont comme prévu pour un contrôle négatif (- ATP), contrôle positif (+ ATP) et inhibiteur connu (+ ATP + INH). Pour démontrer sa capacité à obtenir des données quantitatives d'inhibition des microarrays, un test d'inhibition dépendante de la concentration a été fait pour une seule kinase. Comme le montrent les figures 8A et 8B, l'intensité du signal diminue à mesure que la concentration d'inhibiteur augmente, et la réponse suit la courbe d'inhibition dépendante de la concentration attendue pour le système p38α/MBP kinase / substrat.

Figure 1. Schéma général de la démarche de dépistage des matériaux guidée. Chaque bloc représente une étape de l'écran dans un ordre séquentiel. Chiffres à gauche représentent le nombre total de matières préparées pour l'analyse. L'utilisation d'un temps de gélification supérieur à 2,5 h (matériaux avec des temps de gélification de moins de 2,5 h are indiquée par l'barré), le nombre de matériaux qui passaient chaque étape et reportées au cours de l'écran du matériau sont indiquées par le numéro sur la droite. * Représente matériaux ayant moins de séparation de phase optimale.

Figure 2. Les images optiques montrent différents modes de défaillance des matériaux à l'étape de l'imprimabilité de l'écran. Une image d'un «bon» matériel (deuxième rangée, troisième colonne) sont également présentés pour comparaison. Reproduit avec la permission de la référence ^8, copyright 2013 américaine Chemical Society.

Figure 3. Une approche de dépistage du matériau réalisé pour l'identification des meilleurs matériaux pour la fabrication de dérivés de sol-gel microarrays mal. Reproduit avec la permission de référence ^5, copyright 2013 américaine Chemical Society.

Figure 4. Une approche de criblage des matériaux réalisé pour l'identification des meilleurs matériaux pour la fabrication de puces sol-gel dérivés kinase. Reproduit avec la permission de la référence ^8, copyright 2013 américaine Chemical Society.

Figure 5. (A) Une section de microarray AChE montrant HC (vert clair) et LC (vert clair) points (une palette noir-vert a été appliquée comme pseudocouleur pour la clarté de la présentation), (B) une vue agrandie de la zone encadrée pour mettre en évidence endroit morphologie et l'alignement;. et (C) une parcelle Z 'lignes pleines indiquent la moyenne de la répétitions, tandis que les lignes pointillées correspondent à 3SD. Reproduit avec la permission de la référence ^5, copyright 2013 américaine Chemical Society.

Figure 6. (A) en double complot pour le dépistage en série d'analogues synthétiques des alcaloïdes de l'Amaryllidaceae; (B) IC ₅₀ parcelles d'inhibiteurs potentiels identifiés marqués comme composés 1 et (C) composé 2, avec des barres d'erreur représentent un écart type de la moyenne de 25 répétitions. spots représentatifs sont présentés pour illustrer les différences de signal proportionnel à la concentration de l'inhibiteur. Reproduit avec la permission de la référence ^5, copyright 2013 américaine Chemical Society. Cliquez ici pour agrandir la figure .

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Figure 7. Essai sur tableau de quatre kinases en utilisant 1.4SS/1.0PVA de piégeage et imprimé sur un toboggan amine dérivé. (A) Une image d'une section de puces dans lequel les taches avec kinases co-emprisonnées avec leurs substrats respectifs étaient surchargés avec un tampon (NC, rangée du haut), ou des solutions contenant de l'ATP (PC, rangée du milieu) ou ATP + staurosporine (rangée du bas). (B) Les graphiques à barres comparant les intensités de signaux entre inhibés et réactions décomplexé, après soustraction du bruit de fond et les barres d'erreur représentent un écart type de la moyenne de 25 répétitions. Reproduit avec la permission de la référence ^8, copyright 2013 américaine Chemical Society.

Figure 8. Inhibiti. sur le dosage sur un p38a/MBP microarray (A) Sections de puces montrant des taches représentatives overspotted avec des concentrations variant de staurosporine, comme indiqué (les images ont été obtenues par un simple balayage de la même lame; image composite est représenté pour plus de clarté). (B) _CI50 courbe générée à partir des images de réseau analysés. L'intensité obtenue à 100 mM a été soustraite de toutes les images, tous les autres intensités sont normalisées en fixant l'intensité obtenue à 10 nm à une valeur de 100% d'activité. Reproduit avec la permission de la référence ^8, copyright 2013 américaine Chemical Society.

Figure 9. Images de pin furtif microscopique utilisé en contact pin-impression montrant diverses imperfections: (A) bouché, (B) cintrées.

Discussion

La méthodologie décrite ici a été choisi comme le plus approprié pour l'identification imprimables matériaux issus sol-gel avec une imprimante de contact, produisant une fois et procédure rentable pour identifier rapidement les matériaux optimaux sans avoir à filtrer un grand nombre de matériaux. Sur un total de ~ 20.000 matériaux potentiels, il a été possible d'identifier environ 200 documents qui ont été adaptés pour l'impression sur la base du temps de gélification seul. Cela a considérablement réduit le nombre de matériaux nécessaires pour être prêt pour les essais d'impression ultérieurs. Ces matériaux imprimables sont ensuite imprimées sur 4 surfaces de glissement pour un total de 768 combinaisons matériau-diaporamas. En moyenne, 50 points / répétitions d'un matériau peuvent être imprimés en ~ 3 min, y compris le chargement des échantillons, le dépôt au comptant et le nettoyage des broches. Parmi eux, 155 matériaux, soit environ 20%, a permis pour l'impression du nombre maximum de points par l'absorption de la solution et produire tailles de spot reproductibles. Il convient de noter que le 4 slide surfaces testées, les documents imprimés mieux dans l'ordre: amine> époxy> aldéhyde> PMMA, PMMA diapositives n'ont pas produit des tableaux utiles pour toutes les matières. Ceci a été probablement attribuable à la polarité du revêtement de surface. En comparant les surfaces de glissement précitées, l'amine plus polaire et époxy sont mieux adaptés pour les sols aqueux par rapport aux glissières de PMMA. En outre, des surfaces testées, les lames recouvertes amine offrent une surface chargée positivement potentiel pour le dépôt sol anionique à caution. Nous pensons, la silice des nanoparticules à l'interface entre le coulisseau et le sol d'interagir long de la surface. Tant l'époxy et les surfaces de glissement des aldéhydes n'ont pas la même interaction charge initiale basée. Pour assurer un dépôt au comptant optimale, il est fortement recommandé d'utiliser des diapositives pré-enduites d'un fournisseur comme Arrayit. Revêtement interne produit des surfaces incohérentes qui mènent à la mauvaise place reproductibilité ¹³ et, dans certains cas, peut conduire à des problèmes de quantificationblèmes. ^{18 de} la même importance, la température et l'humidité affectent la "imprimabilité" des matériaux. Bien qu'aucune des études détaillées sur les effets liés à la température ont été effectuées, l'impression est toujours réalisée à température ambiante (23 ± 3 ° C). Humidité (supérieure à 80%) a également été contrôlé à l'intérieur de la chambre d'impression pour empêcher le dépôt de forme irrégulière en raison des faibles volumes de dépôt (0,7-2,3 nl) et de l'évaporation.

Lorsque l'écran de matériau a été guidé vers l'identification des matériaux issus sol-gel optimales spécifiquement pour l'impression de l'acétylcholinestérase et les kinases, une petite série de documents ont été identifiés qui ont travaillé pour les deux types de protéines. En effet, à la fois des matériaux qui ont été identifiés pour la kinase microarray fabrication étaient fondées sur SS + PVA + glycérol, et les deux matériaux ont également été identifiés au cours des 26 matériaux choisis pour microarrays mal. Ces matériaux «optimales» peuvent offrir un point de départ générique pour développer protedans dopées puces à base de sol-gel, et les petits écrans centrées autour de ces compositions peuvent identifier encore meilleurs matériaux pour la fabrication de biopuces. Un second point à noter est l'importance de l'enzyme utilisée. Dans le cas de l'acétylcholinestérase (une enzyme plutôt robuste), 26 (soit environ 40%) des 66 matériaux d'origine identifiés comme test compatible conservé l'activité de l'acétylcholinestérase piégé. Toutefois, pour les kinases plus délicates, seulement 2 des compositions dosage compatibles 69, soit environ 3% des matériaux, ont été en mesure de conserver l'activité de tous les kinases. Alors que nombre suffisant de différentes enzymes n'ont pas été étudiées de faire des déclarations concluantes, il semble que la fabrication de la matrice d'optimisation des enzymes relativement instables peuvent mener à l'identification de matériaux qui peuvent piéger un large éventail de protéines pour permettre mutliplexed microarray fabrication.

Indépendamment de la protéine choisie, le principal facteur de coupure pour identifier les matériaux imprimables était la nécessité d'une longuetemps de gélification matérielles (> 2,5 h). Lors du développement de matériaux à base de sol-gel SS, il est très important de veiller à ce que, suite à un échange d'ions et filtration, le sol est à un pH d'environ 4. Sols avec un pH initial inférieur peuvent entraîner des matériaux ayant un pH inférieur à la neutralité, ce qui peut affecter l'activité enzymatique. ¹⁹ ajustant la quantité de Dowex (résine échangeuse d'ions) de SS peut modifier le pH final du sol. Quand un nouveau lot de la résine est préparé le rapport de la résine de SS doit être ajusté de façon à produire des sols à pH d'environ 4 suivant la procédure de l'article 2 du protocole.

De même, la préparation de la DGS cristallin est souvent une source d'erreur associée à l'insuffisance de matériel lors de l'utilisation des sols DGS base pour le piégeage de biomolécules. Bien que n'étant pas signalés ici en détail, un grand soin doit être pris lors de la synthèse de DGS cristallins, en particulier la nécessité d'éviter la présence d'eau au cours de la synthèse, qui peut produire de la silice polyglyceratedtes plutôt que DGS monomères. En outre, en raison de la nature hygroscopique du DGS, l'échantillon cristallin doit être stocké desséché et utilisé dans les 6 mois après la synthèse. DGS cristallines de plus de 6 mois peut ne pas dissoudre complètement (en raison partiellement condensé silicate polyglyceryl) même avec des ultrasons dans un milieu acide. DGS incomplète dissolution produit sols à forte teneur en silice inconnu et incontrôlable et par conséquent, moins de matières solides.

Un point important à noter avec tirage par contact, c'est la qualité des broches. Broches endommagées ou mal (figure 9) ne seront jamais produire des réseaux reproductibles indépendants du matériel en cours d'impression. Il est recommandé de vérifier la qualité de l'axe à l'aide d'un microscope à dissection pour assurer cassées ou obstrué ne sont pas utilisés. Une manipulation soigneuse assure une longue durée de vie pour les broches. La libre circulation de l'axe est également important. Dans le cas où l'humidité est piégée dans la tête d'impression entre la tête et la broche, la brochene sera pas le siège correctement et donc ne fera pas un bon contact avec la surface, ce qui entraîne un manque de dépôt de matière.

En conclusion, nous avons fourni une approche de dépistage détaillée, plusieurs étapes pour développer protéines dopés puces pin-imprimés à haute densité. Le dépistage implique l'optimisation des propriétés des matériaux (temps de gélification et d'imprimabilité) afin de permettre l'impression de documents, suivi par un dépistage plus ciblé pour identifier les matériaux qui sont compatibles avec un dosage donné et en mesure de conserver l'activité enzymatique. Cette approche de dépistage du matériau guidée peut être appliqué à des formats de puces à ADN supplémentaires pour réduire le temps et les coûts associés à la production efficaces puces à haute densité.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Reagent/Material
Poly(vinyl alcohol) (PVA)	Sigma-Alderich	360627	80% hydrolozyed, Mw 600
Polyethylene glycol 600 (PEG)	Sigma-Alderich	87333
Polyethylenimine (PEI)	Sigma-Alderich	482595	50 wt% solution in water
Carboxyethylsilanetriol (Si-COOH)	Gelest, Inc.	SIC2263.0	25% in water
N-(3-triethoxysilylpropyl) gluconamide(GLS)	Gelest, Inc.	SIT8189.0	50% in ethanol
bis[(3-methyldimethoxysilyl)propyl]polypropylene oxide (MDSPPO)	Gelest, Inc.	SIB1660.0
Methyltrimethoxysilane (MTMS)	Gelest, Inc.	SIM6560.1
Bis(triethoxysiyly)ethane (Bis-TEOS)	Gelest, Inc.	SIB1817.0
3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES)	Gelest, Inc.	SIA0610.0
Glycerol	Sigma-Alderich	49767
D-Sorbitol	Sigma-Alderich	240850
D-(+)-Trehalose dihydrate	Sigma-Alderich	T9531
Triton X-100	Sigma-Alderich	X-100
Nε-Acetyl-L-lysine	Sigma-Alderich	A4021
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Sigma-Alderich	154563
HEPES	Sigma-Alderich	H3375
Sodium hydroxide, 1.0 N	LabChem Inc.	LC24350-2
Hydrochloric Acid, 1.0 N/0.1 N	LabChem Inc.	LC15300-2/LC152220-2
Magnesium chloride	Sigma-Alderich	M8266
Diglycerolsilane (DGS)			Prepared in laboratory
Sodium silicate solution	Fisher Scientific	SS338-1
Dowex 50WX8-100 ion exchance resin	Sigma-Alderich	217492
Acetylthiocholine iodide	Sigma-Alderich	1480
Acetylcholinesterase from Electrophorus electricus (electric eel)	Sigma-Alderich	C2888
BODIPY FL L-Cystine	Invitrogen	B-20340
Pro-Q Diamond Phosphoprotein/Phosphopeptide Microarray Stain Kit	Invitrogen	P33706
Adenosine 5'triphosphate disodium salt (ATP) solution	Sigma-Alderich	A6559
MAP Kinase 2 (MAPK2)	EMD Millipore	454850
p38α/SAPK2a (T106M), active	EMD Millipore	14-687M
Epidermal growth factor (EGFR)	EMD Millipore		Donated by Millipore
Glycogen synthase kinase 3β (GSK-3β)	EMD Millipore	14-306
Myelin basic protein (MBP)	EMD Millipore		Substrate for MAPK2 and p38α, Donated by Millipore
GSM	EMD Millipore	12-533	Substrate for GSK-3β
Poly-glu-tyr polypeptide p(E4Y)	EMD Millipore	12-440	Substrate for EGFR
Stealth pin	ArrayIt	SMP3
Stealth pin	ArrayIt	SMP7
Amine coated slides	ArrayIt	SMM2
Aldehyde coated slides	ArrayIt	SMA2
Exposy coated slides	ArrayIt	SME2
Poly(methylmethacrylate) (PMMA) coated slides	Exakt Technologies Inc.	41500
0.2-μm syringe filter	PALL Life Sciences	4612
			Equipment
Virtek Contact Printer	BioRad
Novaray Fluorescence Slide Imager	Alpha Innotech Corporation
Desktop microarray centrifuge	ArrayIt	MHC110V
MilliQ Synthesis A10	Millipore		Used to filter all water required for experiments