Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

A مواد إرشادية النهج فحص لتطوير الكمي سول جل ميكروأرس بروتين المشتقة

Published: August 26, 2013 doi: 10.3791/50689
Automatic Translation
1, 1
1Department of Chemistry and Chemical Biology, McMaster University

Summary

ووصف نهج فحص المواد الموجهة لتطوير سول جل المستمدة من البروتين ميكروأرس مخدر باستخدام طريقة الناشئة دبوس الطباعة من تلفيق. ويتجلى هذا من خلال منهجية تطوير أستيل وmultikinase ميكروأرس، والتي تستخدم لفحص جزيء صغير فعالة من حيث التكلفة.

Abstract

وقد وجدت ميكروأرس استخدامها في تطوير فحوصات عالية الإنتاجية لمواد جديدة واكتشاف جزيء صغير يؤدي المخدرات. نحن هنا وصف نهج فحص المواد الإرشادية لتحديد المواد مقرها سول جل التي هي مناسبة لإنتاج ميكروأرس بروتين ثلاثي الأبعاد. النهج أولا بتحديد المواد التي يمكن طباعتها كما ميكروأرس، يضيق على عدد من المواد عن طريق تحديد تلك التي تتوافق مع فحص انزيم معين، ومن ثم يشحذ في على مواد الأمثل على أساس الإبقاء على نشاط انزيم أقصى. يتم تطبيق هذا النهج لتطوير ميكروأرس مناسبة لاثنين من المقايسات انزيم مختلفة، واحد باستخدام أستيل والآخر باستخدام مجموعة من أربعة تحركات الرئيسيين المشاركين في السرطان. في كل حالة، كان من الممكن أن ينتج ميكروأرس التي يمكن استخدامها لكمي المقايسات فحص جزيء صغير وإنتاج تعتمد على الجرعة منحنيات استجابة المانع. الأهم من ذلك، هو القدرة على فرز العديد من زميلهأنتجت ريال معلومات عن أنواع من المواد التي تناسب أفضل كل من الانتاج ميكروأري والاحتفاظ نشاط انزيم. توفير البيانات مواد ثاقبة الاحتياجات من المواد الأساسية اللازمة لتفصيل الأمثل، ذات الكثافة العالية سول جل ميكروأرس مشتقة.

Introduction

اكتسبت ميكروأرس شعبية داخل المجتمع العلمي كوسيلة لزيادة الإنتاجية مقايسة. منذ تطوير تكنولوجيا متطورة لتقييم التعبير الجيني 1 في منتصف 1990s، وقد وجدت ميكروأرس استخدامها في تطوير فحوصات عالية الإنتاجية لتحديد البروتين البروتين والبروتين التفاعلات جزيء صغير، والعثور على مواد جديدة ذات خصائص فريدة من نوعها. 2-5 وفي الآونة الأخيرة، تم تطوير ميكروأرس حيث يتم استخدام مواد معينة لشل حركة بروتينات وظيفية، وتنتج عنصرا ميكروأري ثلاثي الأبعاد الذي يتم فيه شرك البروتينات، والسماح لقياس السطحية من النشاط الأنزيمي وتثبيط على ميكروأري نفسها باستخدام مضان مناسبة مقايسة أن يقترن إلى دوران الركيزة. 5-10 الأهم من ذلك، مثل ميكروأرس يمكن أن تكون مصممة لتشمل جميع المكونات اللازمة لعينات الشاشة والضوابط معا بطريقة يتوازى للغاية. 5،8 </ P>

الأمثلة في وقت مبكر من ميكروأرس البروتين عادة أعدت باستخدام الطرق القياسية لتجميد البروتين على دعامات صلبة، مثل التعلق التساهمية، 11 تقارب التقاط 3 والامتزاز المادية. 12 في حين أن هذه الأساليب من الشلل الحيوية تسمح لزيادة تركيز العينة وحركية التفاعل المعجل المطلوبة لل التصغير فحص، فإنها تعاني كل السلبيات. بشكل عام، كل يسبب انخفاضا في وظيفة جزيء حيوي الأصلي بسبب التعديل الكيميائي للسطح، أعاقت الوصول إلى مواقع نشطة، أو التوجه غير لائق بسبب الشلل غير محددة. وهكذا، كل أساليب نتيجة في أقل حساسية الفحص على الرغم من الزيادة في ترسب جزيء حيوي، استجابة المرجح أن ينشأ بسبب الحاجة إلى ربط مصطنع الجزيئات الحيوية إلى السطح.

نهج الناشئة لإنتاج ميكروأرس جزيء حيوي وظيفية من خلال دبوس الطباعة من البروتين مخدرSOLS السيليكا على دعامات صلبة، والتي عادة ما تكون الشرائح الزجاجية إما functionalized أو الآبار الفردية من لوحات microwell. عملية سول جل نفسه يحدث في بيئة مائي في درجة حرارة الغرفة، وأنه هو مقدمة السائلة التي يتم طباعتها ثم المواد الهلامية إلى الجزيئات الحيوية إيقاع داخل المصفوفة 3D، والسماح لنسبة عالية من البروتين التحميل 13 وكذلك انحباس مكونات متعددة داخل العنصر ميكروأري نفسه. ويمكن أن يتم 13،14 خياطة من المواد سول جل المستمدة من خلال الاختيار الدقيق السلائف السيليكا مختلفة، وكذلك عن طريق تغيير عنصر مائي من خلال استخدام مخازن مختلفة (درجة الحموضة، والقوة الأيونية)، وإدراج المضافات المختلفة (البوليمرات، الجزيئات الصغيرة) لتحقيق مادة الأمثل، وطبيعة محددة من الذي يعتمد على جزيء حيوي أن يتم شرك. 10

وجود قيود المحتملة المرتبطة النامية سول جل ميكروأرس بروتين مشتق عبر دبوس الطباعةالحاجة إلى تحديد المواد المركبة القائمة على سول جل التي يمكن طباعتها دون التبلور في دبوس أو إظهار خصائص غير مرغوب فيه (أحجام irreproducible بقعة، وتكسير، وضعف التصاق، مع عدم توافق مكونات مقايسة، وضعف نشاط بروتين) مرة واحدة مطبوعة على السطح. 5 في وقت واحد الاستفادة المثلى من كل من هذه المعلمات يمنع والمواد حيث النهج ويمكن تصميم دي نوفو، أو فحص ببطء بطريقة تسلسلية. من ناحية أخرى، وفحص عشوائي من عدة آلاف أو عشرات الآلاف من المواد ليس الوقت ولا فعالة من حيث التكلفة.

في هذه المقالة، ونحن تصف نهج الفرز الموجهة التي تتيح التعرف السريع على المواد المناسبة لإنتاج ميكروأرس البروتين دون الحاجة لفحص عشوائي أعداد كبيرة من مواد. باستخدام نهج الموجهة، ويتم تحديد المواد المناسبة للطباعة ميكروأري الأولى، تليها سلسلة من الشاشات الصغيرة لتحديد الأمثل سول جل المستمدة العتادمجموعات القاعدة، والتي يمكن طباعتها بتكاثر، دون تكسير ومتوافقة مع فحص معين. وأخيرا، يتم تحديد المواد الأمثل على أساس الإبقاء على نشاط انزيم والأداء في جزيء صغير الفحص الفحص النهائي. في هذه الطريقة، ويمكن تحديد المواد الأمثل من عدة آلاف من المرشحين باستخدام سوى بضع مئات من الخطوات مقايسة. ونحن لشرح هذا النهج لتصنيع كلا أستيل عالية الكثافة وميكروأرس multikinase واستخدام مثل هذه ميكروأرس لفحص جزيء صغير.

Protocol

1. إعداد حلول المضافة

  1. إعداد 25 و 50 ملي تريس (هيدروكسي) aminomethane (تريس قاعدة، M ص 121.14 غ / مول) وHEPES (M ص 238.3 جم / مول) في درجة الحموضة 7.0، 7.2، 7.4، 7.6، 7.8، 8.0 و 8.2 في 50 مل الطرد المركزي الأنابيب. ضبط درجة الحموضة باستخدام 1 N حمض الهيدروكلوريك وهيدروكسيد الصوديوم، على التوالي. تخزين في درجة حرارة الغرفة واستبدال بعد 3 أشهر.
  2. إعداد 24٪ (W / V) بولي (فينيل الكحول) (PVA): تزن 2.4 غرام من PVA (M W 9،000 - 10،000، 80٪ تحلل) وإضافة إلى 10 مل من الماء منزوع الأيونات-المقطر ([ده 2 O)، ويحل الكريات البوليمر قبل vortexing. استخدام الحل 24٪ (W / V) لإعداد أحجام متساوية من 16٪ (W / V)، 12٪ (W / V) و 8٪ (W / V) حلول PVA. حلول ديغا بواسطة صوتنة قبل الاستخدام. تخزينها في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 1 في الشهر.
  3. إعداد 24٪ (W / V) البولي ايثيلين إمين (PEI): إضافة 4.8 مل من PEI (M W 1،300، 50٪ (W / W) في H 2 O) إلى 5.2 مل من DDH 2 O. استخدام الحل 24٪ (W / V) لإعداد أحجام متساويةمن 16٪ (W / V)، 12٪ (W / V) و 8٪ (W / V) حلول PEI. حلول ديغا بواسطة صوتنة قبل الاستخدام. تخزينها في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 1 في الشهر.
  4. إعداد 60٪ (W / V) البولي ايثيلين جلايكول (PEG): يزن 6 غرام من PEG (M ث 600) وإضافة إلى 10 مل من DDH 2 O، ويحل الكريات البوليمر قبل vortexing. استخدام التخفيف المتسلسل لإعداد حجم مساو من 30٪ (W / V) حل PEG. حلول ديغا بواسطة صوتنة قبل الاستخدام. تخزينها في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 1 في الشهر.
  5. إعداد 24٪ (V / V) N-(3-triethoxysilylpropyl) gluconamide (GLS): إضافة 480 ميكرولتر من GLS (50٪ في الايثانول - قد تتطلب GLS الاسهم استخدام حمام الماء لتسخين وتذوب الحل إذا البلورية) إلى 520 ميكرولتر من 95٪ (V / V) الإيثانول ومزيج لمدة 20 دقيقة قبل صوتنة. استخدام (V / V) حل 24٪ لجعل حجم مساو من 16٪ (V / V) حل GLS. جعل حلول جديدة لاستخدامها في اليوم الواحد.
  6. إعداد 24٪ (V / V) methyltrimethoxysilane (MTMS): إضافة 240 ميكرولتر من MTMS إلى 760 ميكرولتر من القائمة يحمض [ده 2 O (درجة الحموضة 2.0، 1 N حمض الهيدروكلوريك) وتخلط لمدة 20 دقيقة قبل sonification. استخدام (V / V) حل 24٪ لجعل حجم مساو من 16٪ (V / V) حل MTMS. جعل حلول جديدة لاستخدامها في اليوم الواحد.
  7. إعداد 24٪ (V / V) مكررا [(3-methyldimethoxylsilyl) بروبيل] أكسيد البولي بروبلين (MDSPPO): إضافة 240 ميكرولتر من MDSPPO إلى 760 ميكرولتر من القائمة يحمض [ده 2 O (درجة الحموضة 2.0، 1 N حمض الهيدروكلوريك) وتخلط لمدة 20 دقيقة بواسطة sonification. استخدام (V / V) حل 24٪ لجعل حجم مساو من 16٪ (V / V) حل MDSPPO. جعل حلول جديدة لاستخدامها في اليوم الواحد.
  8. إعداد 24٪ (V / V) 3 - (أمينو بروبيل)-triethoxysilane (APTES): إضافة 240 ميكرولتر من APTES إلى 760 ميكرولتر من القائمة يحمض [ده 2 O (درجة الحموضة 2.0، 1 N حمض الهيدروكلوريك) وتخلط لمدة 20 دقيقة قبل sonification. استخدام (V / V) حل 24٪ لجعل حجم مساو من 16٪ (V / V) APTES حل. جعل حلول جديدة لاستخدامها في اليوم الواحد.
  9. إعداد 24٪ (V / V) مكررا (triethoxysily) الإيثان (مكرر TEOS): إضافة 240 ميكرولتر من مكرر TEOS إلى 760 ميكرولتر من القائمة يحمض [ده 2 O (درجة الحموضة 2.0، 1 N حمض الهيدروكلوريك) وتخلط لمدة 20 دقيقة قبل sonification. استخدام (V / V) حل 24٪ لجعل حجم مساو من 16٪ (V / V) حل مكرر TEOS. جعل حلول جديدة لاستخدامها في اليوم الواحد.
  10. إعداد 24٪ (V / V) carboxyethylsilanetriol (سي COOH): إضافة 960 ميكرولتر من سي COOH (25٪ في DDH 2 O) إلى 40 ميكرولتر من القائمة يحمض [ده 2 O (درجة الحموضة 2.0، 1 N حمض الهيدروكلوريك) ومزيج ل 20 دقيقة بواسطة sonification. استخدام (V / V) حل 24٪ لجعل حجم مساو من 16٪ (V / V) حل سي COOH. جعل حلول جديدة لاستخدامها في اليوم الواحد.
  11. إعداد على حدة 3 ملي N ε - أسيتيل-L-يسين، D-السوربيتول، α-α-طرهالوز (M ص 188.22 غ / مول، 182.17 جم / مول، و378.33 غ / مول، على التوالي)، و 1.5 ملي تريتون X-100 (متوسط ​​M W 625 جم / مول) في DDH 2 O. وحدات التخزين يمكن أن تختلف تبعا كم هو المطلوب، وجعل حلول جديدة لاستخدامها في اليوم الواحد.
  12. إعداد 60٪ (W / W) الجلسرين: إضافة 2.4 غرام من الجلسرين اللامائية إلى 1.6 غرام من [ده 2 O، مزيج من قبل دوامة. ديغا حلبواسطة صوتنة قبل الاستخدام. تخزينها في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 1 في الشهر.
  13. إعداد 30٪ (W / W) الجلسرين: إضافة 1.6 غرام من الجلسرين اللامائية إلى 2.4 غرام من [ده 2 O، مزيج من قبل دوامة. حل ديغا بواسطة صوتنة قبل الاستخدام. تخزينها في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 1 في الشهر.

2. إعداد سوليس السيليكا

بعد الإجراءات أدناه، وSOLS منها، عندما أبقى على الجليد، يمكن استخدام ما يصل إلى 1 ساعة بعد إضافة الماء. SOLS استخدامها إلى ما بعد 1 نتيجة الموارد البشرية في تناقص / غير متناسقة مرات دبق المواد.

  1. إعداد سيليكات الصوديوم (SS) مقرها سول
    1. تزن من 120 غرام من راتنج التبادل الأيوني في كوب من البلاستيك 500 مل.
    2. إضافة 150 مل من حمض الهيدروكلوريك 0.1 N ويقلب لمدة 1 ساعة باستخدام 2 بوصة قضيب تحريك مغناطيسي.
    3. تحديد الحل باستخدام القمع بوخنر متصلا فراغ.
    4. إضافة ببطء [ده 2 O لغسل الراتنج تصفيتها حتى الراشح الناتج هو واضح. وهذا يستغرق ما يقرب من 100مل من DDH 2 O.
    5. جمع وتخزين الراتنج أعد في وعاء من البلاستيك في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 1 في الشهر.
    6. تزن من 2.59 غرام من سيليكات الصوديوم (SS، 27٪ (W / W) شافي 2، 10٪ (W / W) هيدروكسيد الصوديوم) في كوب من البلاستيك 50 مل.
    7. إضافة 10 مل من DDH 2 O إلى SS. دوامة بلطف باليد لخلط الحل.
    8. تزن من 5.60 غرام من الراتنج المعدة إلى منفصلة 50 مل دورق البلاستيك. أضف إلى حل سيليكات الصوديوم والمزيج لمدة 2 دقيقة باستخدام بوصة واحدة قضيب تحريك مغناطيسي.
    9. تحديد الحل خليط مع قمع بوخنر متصلا الشافطة تعلق على صنبور المياه.
    10. استخدام حقنة بلاستيك 10 مل مجهزة 0.2 ميكرومتر غشاء فلتر لتصفية حل سول. هذا ينتج سول مع 5.6٪ (W / W) المشار إليها السيليكا SS في مزيد من النص. الحفاظ على سول على الجليد عندما لا تكون قيد الاستعمال.
    11. ½ SS: إضافة 1 مل من المعدة SS سول إلى 1 مل من DDH 2 O، مزيج من قبل دوامة. الحفاظ على سول على الجليد عندما لا تكون قيداستخدام.
  2. إعداد diglycerylsilane (DGS) مقرها سول
    1. تجميع أسهم دبي للذهب كما هو موضح في مكان آخر. 15،16 DGS البلورية المتجر في مجفف في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 6 أشهر.
    2. تزن خارج ما يقرب من 1 غرام من أسهم دبي للذهب بلوري.
    3. استخدام قذائف المورتر ومدقة لطحن DGS إلى مسحوق ناعم. إكمال هذه الخطوة في أسرع وقت ممكن لمنع امتصاص الرطوبة من الجو.
    4. نقل بعناية DGS المطحون ناعما إلى فارغة 20 مل قارورة التلألؤ، وتسجيل كتلة (إلى الألف من الجرام).
    5. أضف ده 2 O لتسفر عن 0.5 جم / مل أسهم دبي للذهب.
    6. يصوتن DGS تحلل على الجليد لمدة 20 دقيقة، ومزيج من قبل دوامة لمدة 5 ثوانى كل 5 دقائق. خلال أيام الرطبة، قد حل كاملة من أسهم دبي للذهب تتطلب إضافة 10 ميكرولتر من 1 N حمض الهيدروكلوريك. وينبغي أن يضاف هذا إلى حل قبل صوتنة.
    7. استخدام حقنة بلاستيكية 3 مل مجهزة غشاء 0.2 ميكرون فلتر لتصفية حل سول، وإزالة الجسيمات الدقيقة. هذا ينتج سول مع 5.0٪ (W / W) المشار إليها السيليكا أسهم دبي للذهب في مزيد من النص. الحفاظ على سول على الجليد عندما لا تكون قيد الاستعمال.
    8. ½ DGS: إضافة 1 مل من المعدة DGS سول إلى 1 مل من DDH 2 O، مزيج من قبل دوامة. الحفاظ على سول على الجليد عندما لا تكون قيد الاستعمال.

3. الفرز المسبق لتحديد المواد قابلة للطباعة

ويرد مخطط المعمم يبين المراحل المختلفة لتحليل العوامل الموجهة المستخدمة لتحديد المواد القابلة للطباعة في الشكل 1. ينصح الحد الأدنى إجمالي حجم المواد من 100 ميكرولتر. استخدام كميات أصغر يجعل تصور دبق المادية الصعبة.

  1. المرحلة 1: العازلة وسيلاني
    1. إضافة 50 ميكرولتر من العازلة (25 و 50 ملي تريس أو HEPES في درجة الحموضة 7.0، 7.2، 7.4، 7.6، 7.8، 8.0، 8.2) إلى 2 مل زجاج قارورة التلألؤ.
    2. إضافة 50 ميكرولتر من محلول المناسب (DGS، ½ أسهم دبي للذهب، SS، ½ SS) وخليط دوامة بطريقة على وقبالة لمدة 10 ثانية قبلتتحرك القارورة داخل وخارج خلاط دوامة.
    3. ضبط مواد للراحة في درجة حرارة الغرفة، ومراقبة الوقت من دبق المواد. ويعرف الوقت دبق كما النقطة التي توقف عن المواد التي تتدفق بحرية على الدورية القارورة إلى زاوية 45 درجة.
    4. استبعاد تركيبات المواد مع أقل الأوقات دبق من 2.5 ساعة من مراحل فحص المواد اللاحقة.
  2. المرحلة 2: العازلة، سيلاني والبوليمر
    1. في كوب 2 مل قارورة التلألؤ، إضافة 3.13 ميكرولتر من إما 16٪ (W / V) أو 8٪ (W / V) PVA / PEI حل أو 6.3 ميكرولتر من 30٪ (W / V) أو 60٪ (W / V) حل PEG.
    2. إضافة 50 HEPES ملم (8.0 درجة الحموضة) لتبرزي حجم مجتمعة إلى 50 ميكرولتر، مزيج الحل بواسطة دوامة.
    3. إضافة 50 ميكرولتر من محلول المناسب (DGS، ½ أسهم دبي للذهب، SS، ½ SS)، في مزيج من الأزياء هو موضح في الخطوة 3.1.2.
    4. استبعاد تركيبات المواد مع أوقات دبق (كما هو موضح في الخطوة 3.1.3) أقل من 2.5 ساعة من مراحل فحص المواد اللاحقة.
  3. المرحلة 3: العازلة، سيلاني، البوليمر وorganosilane
    1. في كوب 2 مل قارورة التلألؤ، إضافة 3.13 ميكرولتر من إما 16٪ (W / V) أو 8٪ (W / V) حل PVA أو 6.3 ميكرولتر من 30٪ (W / V) أو 60٪ (W / V) حل PEG.
    2. إضافة 3.13 ميكرولتر من 16٪ (W / V) organosilane (GLS، MTMS، MDSPPO، مكررا TEOS، سي COOH أو APTES).
    3. إضافة 50 HEPES ملم (8.0 درجة الحموضة) لتبرزي حجم مجتمعة إلى 50 ميكرولتر، مزيج الحل بواسطة دوامة.
    4. إضافة 50 ميكرولتر من محلول المناسب (DGS، ½ أسهم دبي للذهب، SS، ½ SS) وخلط في الأزياء هو موضح في الخطوة 3.1.2. استبعاد تركيبات المواد مع أوقات دبق (كما هو موضح في الخطوة 3.1.3) أقل من 2.5 ساعة من مراحل فحص المواد اللاحقة.
  4. المرحلة 4: العازلة، سيلاني، والمضافات الصغيرة جزيء البوليمر، وorganosilane
    1. في كوب 2 مل قارورة التلألؤ، إضافة 2.08 ميكرولتر من إما 24٪ (W / V) أو 12٪ (W / V) حل PVA أو 6.3 ميكرولتر من 30٪ (W / V) أو 60٪ (W / V) حل PEG.
    2. إضافة2.08 ميكرولتر من 24٪ (W / V) organosilane (GLS، سي COOH).
    3. إضافة 2.08 ميكرولتر من 3 ملي حل جزيء صغير (N ε - أسيتيل-L-يسين، D-السوربيتول، α-α-طرهالوز) أو 1.5 مم (تريتون X-100).
    4. إضافة 50 HEPES ملم (8.0 درجة الحموضة) لتبرزي حجم مجتمعة إلى 50 ميكرولتر، مزيج الحل بواسطة دوامة.
    5. إضافة 50 ميكرولتر من محلول المناسب (DGS، ½ أسهم دبي للذهب، SS، ½ SS) وخلط في الأزياء هو موضح في الخطوة 3.1.2.
    6. استبعاد تركيبات المواد مع أوقات دبق (كما هو موضح في الخطوة 3.1.3) أقل من 2.5 ساعة من مراحل الطباعة المواد اللاحقة.

4. إعداد مواد قابلة للطباعة البروتين مخدر

وتنفذ المواد التي تم تحديدها في نهاية الخطوة 3.4.6 قدما في دراسات القابلية، مع الانزيم المناسبة يجري الآن إدراجها في سول. في جميع الحالات المبينة أدناه، محلول مائي يحتوي على جميع المكونات ما عدا سيلانيمستعدة في microwell، تليها إضافة لسول فقط قبل الطباعة. لاستيعاب استخدام لوحة 384 عيار مكروي، يتم استخدام السعة الإجمالية الحل من 50 ميكرولتر بدلا من 100 ميكرولتر.

  1. أستيل (أستيلكولينستراز) ميكروأري
    1. إعداد 2 كو / مل حل أستيلكولينستراز في 50 HEPES ملم (8.0 درجة الحموضة) بعد الكثير من نشاط انزيم معين (وحدات النشاط في ملغ) المعلومات المقدمة من قبل الشركة المصنعة.
    2. قسامة 2 كو / مل محلول المخزون انزيم في 5 ميكرولتر الكسور باستخدام أنابيب microcentrifuge 500 ميكرولتر وتخزينها في -20 درجة مئوية. تبقى 2 كو / مل حلول الأسهم أستيلكولينستراز مستقرة لمدة تصل إلى 4 أشهر عند تخزينها في -20 درجة مئوية.
    3. إعداد المواد الأساسية من خلال الجمع بين نصف وحدات التخزين من البوليمرات المقابلة، organosilanes والمواد المضافة الصغيرة جزيء يتم تحديدها من خلال الخطوة 3.4.6 في وحة microtiter 384 جيدا.
    4. إضافة 5 ميكرولتر من 2 كو / مل أستيلكولينستراز في 50 HEPES ملم (8.0 درجة الحموضة).
    5. باستخدام 50 HEPES ملم (8.0 درجة الحموضة)، وجلب مجتمعةحجم جيد ل25 ميكرولتر مزيج من قبل pipetting الحل صعودا وهبوطا عدة مرات.
  2. Multikinase ميكروأري
    1. إعداد 100 نانوغرام / ميكرولتر الحلول كيناز (p38α، MAPK2، EGFR، GSK-3β) في DDH 2 O في أعقاب النشاط (U / مل أو U / ملغ) والمعلومات الكمية المقدمة من قبل الشركة المصنعة. تخزين حلول كيناز في aliquots من 2 ميكرولتر في -80 درجة مئوية.
    2. إعداد كيناز ركائز (MBP، P (E 4 Y)، GSM) في 5 ملغ / مل، 50 ملغ / مل أو 300 ميكرومتر في DDH 2 O، في أعقاب المعلومات الكمية المقدمة من قبل الشركة المصنعة. ركائز مخزن في aliquots من 2.5 ميكرولتر في -80 درجة مئوية.
    3. إعداد المواد الأساسية من خلال الجمع بين نصف وحدات التخزين من البوليمرات المقابلة، organosilanes والمواد المضافة الصغيرة جزيء يتم تحديدها من خلال الخطوة 3.4.6 في وحة microtiter 384 جيدا.
    4. إلى كل تحتوي أيضا على المواد الأساسية، إضافة 2.5 ميكرولتر كيناز و 2 ميكرولتر من الركيزة الخاصة به (p38α وMBP، MAPK2 وMBP، EGFR و P (E 4 Y)، GSK-3β وGSM) كما أعدت في خطوات 4.2.1 و 4.2.2، على التوالي.
    5. باستخدام 50 HEPES ملم (7.4 درجة الحموضة)، تبرزي حجم جيدا مجتمعة إلى 25 ميكرولتر. خلط قبل pipetting.

5. ميكروأري تشكيل

يشرح هذا القسم الإجراء مفصلة لطباعة المواد على سطح شريحة واحدة. للطباعة على الأسطح متعددة الشرائح المعدلة (أمين، الايبوكسي، ألدهيد وPMMA)، ويتكرر هذا الإجراء 4 مرات.

  1. تشكيل ميكروأرس باستخدام اتصال دبوس الطباعة الروبوت مجهزة مرحلة XYZ. استخدام الدبابيس غمد فترة زمنية محددة من قطر ميكرومتر 100 لإيداع SOLS البروتين مخدر.
  2. ضبط الرطوبة داخل غرفة الطباعة إلى 80-90٪. الرطوبة <80٪ قد يؤدي إلى تبخر عينة وأوجه عدم الاتساق في الطباعة، ويرجع ذلك إلى وحدات التخزين ترسب الصغيرة.
  3. يصوتن الدبابيس الموجودة في DDH 2 O لمدة 15 دقيقة قبل الطباعة والجافة تحت تيار من النيتروجين. استخدام cleane الأنابيبr لإزالة الرطوبة المتبقية من داخل حامل دبوس ووضع بعناية من دبوس في رأس الطباعة. قد فشل لإزالة الرطوبة المتبقية تعيق دبوس من التحرك بحرية مع حامل، مما أدى في اماكن تفويتها.
  4. أنماط مجموعة التحكم من خلال برنامج برو كاتب رقاقة (فريق العمل). لكل عينة جيدا في لوحة مصدر 384 جيدا، تطبع 200 النقاط (الحد الأقصى لعدد البقع في امتصاص باستخدام دبوس غمد SMP3) على A-تعديل سطح شريحة زجاجية.
  5. تبدأ عملية الطباعة من خلال البرنامج. مجموعة السفر في الاتجاه XY إلى 10 ملم / ثانية وسرعة عينة نهج (Z اتجاه) إلى 2 ملم / ثانية مع 2.5 ثانية عينة وقت التحميل.
  6. إيقاف التشغيل من خلال فريق العمل. خفض دبوس في العينة وإضافة 25 ميكرولتر من محلول منها (DGS، ½ أسهم دبي للذهب، SS، ½ SS) إلى البئر بواسطة ماصة. مزيج الحل باستخدام حركة pipetting صعودا ونزولا المتكررة 50X. عند خلط قبل pipetting، وتقليل كمية الهواء دمجها في الحل. فقاعات الهواء المنعتي استكمال التحميل من عينة داخل دبوس.
  7. تبدأ عملية الطباعة من خلال فريق العمل، وطباعة العينة على سطح شريحة واحدة. إيقاف عملية الطباعة قبل التحميل عينة من لوحة مصدر اللاحقة أيضا.
  8. إزالة دبوس الطباعة باستخدام المغناطيس ووضعه على نظافة أنابيب في رأس الطباعة لمنع تراكم الرطوبة في رأس الطباعة.
  9. شطف دبوس الطباعة مع DDH 2 O، ويصوتن في نظيفة [ده 2 O لمدة 30 ثانية.
  10. تجفيف دبوس الطباعة تحت تيار من النيتروجين وإزالة أنظف الأنابيب، ووضع دبوس مرة أخرى إلى رأس الطباعة.
  11. تبدأ الطباعة باتباع الخطوات 5،6-5،10، لجميع العينات المتبقية داخل لوحة مصدر. ما يصل إلى 12،000 البقع من 100 ميكرومتر في القطر يمكن أن تودع على شريحة واحدة.
  12. ويمكن أيضا أن تطبق هذه الطريقة لمواد الطباعة على الجزء السفلي من الآبار داخل صفيحة ميكروسكوبية 96-جيدا. بعد ملف معايرة فريق العمل، إعادة ضبط دبوس الطباعة لضمان distanسافر CE يصل بين ترسب بقعة هو فوق ارتفاع لوحة microwell. وهذا يسمح للدبوس لطباعة باستمرار من جيد إلى جيد بطريقة خطية دون الإضرار دبوس.
  13. سن مجموعة مدة لا تقل عن 30 دقيقة، وتصل إلى 24 ساعة داخل غرفة الطباعة في الرطوبة 80-90٪ بعد الانتهاء من تجربة الطباعة بأكملها.

6. أستيل نشاط الفحص

  1. إعداد مراقبة إيجابية (PC) عينات
    1. إعداد 1 ملم يوديد acetylthiocholine (ATCH: M ص 289.18 غ / مول) في الجلسرين 4٪، 25 ملي تريس (الرقم الهيدروجيني 7.0) في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. ATCH يحتاج إلى إعداد جديدة قبل كل استعمال واستخدام منطقة عازلة في درجة الحموضة 7.0 درجة الحموضة كحواجز العالي يسبب حلمهة ذاتية السريع، وتنتج ايجابيات كاذبة. يمكن أن تختلف في الحجم النهائي اعتمادا على عدد من العينات (25 ميكرولتر لكل عينة).
    2. إضافة 0.14 ميكرولتر من 5 ملم bodipy-FL-L-سيستين إلى 25 ميكرولتر من 1 ملم ATCH في البئر لجيش التحرير الشعبى الصينى 384 عيار مكرويالشركة المصرية للاتصالات.
    3. إضافة ميكرولتر 24.86 الجلسرين 4٪، 25 ملي تريس (الرقم الهيدروجيني 7.0)؛ مزيج من قبل pipetting بعناية لتجنب تشكيل فقاعة في الحل. ويمكن إدراج مثبطات انزيم المحتملة في حل PC قبل ان يصل حجم إلى 50 ميكرولتر مع العازلة.
  2. إعداد التحكم (NC) عينات السلبية
    1. إضافة ميكرولتر 0.14 من 5 ملي bodipy-FL-L-سيستين إلى 49.86 ميكرولتر من الجلسرين 4٪، 25 ملي تريس (الرقم الهيدروجيني 6.5) في بئر من لوحة 384 عيار مكروي. خلط قبل pipetting.
  3. الطباعة الفوقية PC والحلول NC
    1. OVERPRINT على ميكروأرس العمر بعد خطوات 5،1-5،10 (تجاهل الخطوة 5.6) من البروتوكول. استخدام الدبابيس غمد مشقوق من 235 ميكرومتر في القطر لإيداع PC وحلول الطباعة الفوقية NC. وهذا يضمن الحل يغطي بقعة المودعة سابقا تماما.
    2. صفائف سن 80-90٪ الرطوبة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. ونظرا لحلمهة ذاتية من ATCH، قد مرات حضانة أطول يؤدي إلى ايجابيات كاذبة أو زيادة ENإنزيم آخر.

7. كيناز نشاط الفحص

  1. إعداد 500 ميكرومتر الأدينوزين ثلاثي الفوسفات 5'-(ATP) الحل باستخدام الأسهم ATP (100 ملم) المخزنة في -20 درجة مئوية. جعل الحل لكل تجربة جديدة وضبط مستوى الصوت إلى ضرورة التجريبية: كل حل يتطلب الطباعة 5 ميكرولتر.
  2. إعداد ملي كلوريد المغنيسيوم 100 (MgCl 2: M R 95.21 جم / مول) حل الأسهم في DDH 2 O.
  3. مراقبة إيجابية (PC)
    1. إضافة 2.5 ميكرولتر من 100 ملي MgCl 2 و 5 ميكرولتر 500 ميكرومتر ATP إلى بئر من لوحة 384 عيار مكروي.
    2. جلب إجمالي حجم جيدا إلى 50 ميكرولتر مع 50 HEPES ملم (7.4 درجة الحموضة)؛ مزيج من قبل pipetting. ويمكن إدراج مثبطات انزيم المحتملة في حل PC قبل ان يصل حجم إلى 50 ميكرولتر مع العازلة.
  4. السيطرة السلبية (NC)
    1. إضافة 2.5 ميكرولتر من 100 ملي MgCl 2 و 5 ميكرولتر DDH 2 O إلى البئر من 384-Mلوحة icrotiter.
    2. جلب إجمالي حجم جيدا إلى 50 ميكرولتر مع 50 HEPES ملم (7.4 درجة الحموضة)، ومزيج قبل pipetting.
  5. الطباعة الفوقية PC والعوامل المساعدة مقايسة NC
    1. اتبع الخطوة 6.3.1 من البروتوكول.
    2. صفائف العمر في الرطوبة 80-90٪ لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  6. تلطيخ الشريحة
    1. مكان ميكروأري الشرائح المطبوعة بشكل فردي في طبق بتري مع صبغ ما يكفي (من عدة) لتغطية الشريحة بأكملها. هزة متوسطة (~ 200 دورة في الدقيقة) لمدة 45 دقيقة باستخدام لوحة شاكر.
    2. إزالة الشريحة باستخدام ملقط ومكان في طبق بتري نظيفة مع غسل العازلة (من عدة). هزة متوسطة (~ 200 دورة في الدقيقة) لمدة 45 دقيقة باستخدام لوحة شاكر.
    3. إزالة الشريحة باستخدام ملقط وتدور الجافة باستخدام سطح المكتب microcentrifuge ميكروأري التقليدية مجهزة حامل الشرائح.

8. ميكروأري التصوير والتحليل

  1. التصوير

    لاحظ أن طريقة التصوير ستكون لياليpecific إلى نوع من قارئ مجموعة المتاحة. لهذه الدراسات، ألفا INNOTECH NovaRay تصوير مع مصدر ضوء أبيض ونظام الكشف عن CCD مجهزة 478 ± 17 نانومتر الإثارة و 538 ± 21 نانومتر تصفية الانبعاثات لميكروأرس اشي و 530 ± 40 نانومتر الإثارة و 614 ± 62 نانومتر الانبعاثات تصفية ميكروأرس كيناز تم استخدامه. ويمكن أيضا أنظمة المسح الضوئي ليزر متحد البؤر أن تستخدم لقراءة المصفوفات، على الرغم من أن الإعدادات سوف تكون محددة في الصك.

    1. ضع الشريحة في حامل الشريحة مع اماكن لمواجهة.
    2. تعيين عدد الأقسام معاينة (ينصح كحد أدنى من 2، واحد على حد سواء من شريحة المجهر)، والقرار (ينصح لا تقل عن 4 ميكرون) والتعرض (ينصح السيارات) ضمن برامج التصوير.
    3. الحصول على صورة الشريحة وحفظ باسم ". شجار" ملف.
  2. تحليل
    1. فتح صورة الشريحة المكتسبة في ImageJ64.
    2. انقر فوق أداة التحديد البيضاوي وقياسإشارة كثافة كل بقعة باستخدام الخيار التدبير تحت علامة التبويب تحليل. عند اختيار المنطقة لقياس وتحديد منطقة أكبر قليلا من بقعة المرصودة وحجم متسقة بين اماكن للحد من يماغيج الذاتية.
    3. متوسط ​​كثافة من 25 اماكن PC مماثلة، مقسوما على متوسط ​​كثافة من 25 اماكن NC مماثلة للحصول على PC / NC النسب للمكونات المادية الفردية.

Representative Results

عن طريق إجراء تحليل العوامل الموجهة للشاشة المواد، كنا قادرين على تقليل عدد المواد اختبارها من ~ 20،000 إلى بضع مئات من أن زيارتها مرة دبق مناسبة للطباعة. عن طريق تطبيق المبدأ التوجيهي تتطلب مواد زمنية صارمة من دبق 2.5 ساعة أو أكثر، والمواد المحتمل أن تسد دبابيس الطباعة أو إنتاج صفائف irreproducible طبعت أبدا. طبعت مواد قابلة للطباعة التي تم تحديدها لديك ما يكفي من (> 2.5 ساعة) مرات دبق على السطوح 4 شريحة زجاجية functionalized مختلفة. من أجل أن يعتبر "طباعة"، وكان الحد الأقصى لعدد البقع في حجم الإقبال على دبوس المراد طباعتها (SMP3 = 200). تم تقييم البقع أيضا لمورفولوجيا بقعة لضمان ان لا تكسير أو غير مرغوب فيه مرحلة الانفصال وقعت باستخدام المجهر brightfield بسيط كما هو مبين في الشكل 2.

من هذه المرحلة من مواد قابلة للطباعة التي تم تحديدها، وأنتجت ميكروأرس مع أستيلكولينستراز وتحركات إدراجها في عنصر مائي مخزنة. تم تحديد المواد التي كانت متوافقة مع هذا الإجراء فحص (بما في ذلك الطباعة الفوقية المحتملة وغسل أو تلطيخ الخطوات) من خلال مراقبة الاحتفاظ اماكن ميكروأري (لا تكسير، وفقدان بقع أو أنماط غير عادية مضان) والسيطرة الايجابية (PC) إلى السيطرة السلبية (NC ) نسبة أكبر من 1 كما لوحظ من خلال الصورة. كما كان هذا حوالي 50٪ من المواد، وهو أكبر PC / NC نسبة 3 كان يستخدم لتحديد المواد الأمثل مع الإبقاء على نشاط البروتين. من خلال هذه الطريقة، 26 مواد سول جل مشتقة تحتوي على مواد أستيلكولينستراز و 2 تحتوي على تحركات راض المعايير> 3 PC / NC. الشكل 3 والشكل 4 تظهر انهيار رسومية من 5 خطوات موجهة مادة الشاشة لتحديد أستيلكولينستراز الأمثل وكيناز ميكروأرس، على التوالي.

ويمكن أيضا للفحوصات يمكن التحقق من صحة من خلال توليد يسجل Z '17 الشكل 5 يظهر مؤامرة Z 'تم الحصول عليها من خلال مقارنة إشارة ولدت من 200 البقع، 100 جهاز كمبيوتر و 100 NC بعد الطباعة الفوقية الصبغة مؤشر والركيزة على مجموعة الألم. نتج من آلام وصفائف كيناز في عشرات Z 'كل من 0.60 و 0.67، مما يدل على مقايسة ممتازة. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أنه قبل التحقق من صحة الفحص، كان تركيز الانزيم، صبغ، الركيزة والعامل المساعد على مجموعة إلى أن يكون الأمثل من قبل الطباعة الفوقية مجموعة من تركيزات من كل مكون واختيار التركيز التي أنتجت أعلى إشارة، كما هو موضح بالتفصيل في مكان آخر 5

للتحقق من صحة المقايسات، تم الحصول على بيانات تثبيط الكمي باستخدام مثبطات أستيلكولينستراز المعروفة وغير المعروفة، وكانت النتائج التي أجريت في مكررة والمستخدمة لإنتاج المؤامرات مكررة (الشكل 6A) والمنحنيات تثبيط (أرقام 6B و 6C). <وموشحة اماكن> القوي الأول مع خليط من المعروف مثبطات جزيء صغير نشطة بيولوجيا ثم مع صبغ والركيزة، وأدرجت مخاليط التحكم التي تحتوي على مثبطات سواء المعروفة أو لا المانع. وقد تم توليد المؤامرات مكررة لتقييم نشاط انزيم، واعتبرت أي مخاليط التي أسفرت في أقل من 25 نشاط انزيم٪ إيجابي لتثبيط. تم اختبار مركبات فرد من هذه الخلائط ثم في تكرار لتحديد جزيء صغير محددة (ق) المسؤولة عن تثبيط. وبمجرد تحديدها، وقد استخدمت هذه الجزيئات الصغيرة لتوليد منحنيات تثبيط كمي لتحديد IC 50 القيم والثوابت تثبيط.

وتم الحصول على نتائج نوعية مماثلة باستخدام مجموعة multikinase مع مثبط كيناز المشتركة، staurosporine. 7A الشكل 7B وتظهر صورة ميكروأري وتشير إلى أن شدة إشارة بعد الطباعة الفوقية وتلطيخ multikinaseمجموعة كما هو متوقع لعنصر تحكم السالب (- ATP)، مراقبة إيجابية (+ ATP) والمانع المعروفة (ATP + + INH). لإثبات القدرة على الحصول على البيانات تثبيط كمية من ميكروأرس، وقد تم تركيز تعتمد مقايسة تثبيط لكيناز واحد. كما هو مبين في الأرقام و8A 8B، كثافة إشارة تتناقص مع تزايد تركيز مثبط، واستجابة يتبع منحنى تركيز تثبيط تعتمد المتوقعة للكيناز / الركيزة نظام p38α/MBP.

الشكل 1
الشكل 1. التخطيطي العام للمواد نهج الفرز الموجهة. كل كتلة تمثل خطوة من الشاشة في ترتيب تسلسلي. أرقام على اليسار تمثل العدد الإجمالي من المواد المعدة للتحليل. باستخدام الوقت دبق أكبر من 2.5 ساعة (المواد مع أوقات دبق أقل من 2.5 ساعة عه المشار إليها بواسطة قذفة)، وأشار عدد من المواد التي مرت كل مرحلة والتي رحلت خلال شاشة المواد من قبل عدد على اليمين. * تمثل المواد مع أقل من المستوى الأمثل مرحلة الانفصال.

الشكل 2
الشكل 2. الصور البصرية تظهر وسائط مختلفة من المواد فشل في الخطوة القابليه من الشاشة. يظهر أيضا صورة من مادة "جيد" (الصف الثاني، العمود الثالث) للمقارنة. أعيد طبعها بإذن من المرجع 8، حقوق الطبع والنشر 2013 الجمعية الكيميائية الأمريكية.

الشكل (3)
الشكل (3). نهج فحص المواد الموجهة لتحديد المواد الأمثل لافتعال سول جل المستمدة ميكروأرس الألم. أعيد طبعها بيرمission من المرجع 5، حقوق الطبع والنشر 2013 الجمعية الكيميائية الأمريكية.

الشكل 4
الشكل 4. A مواد نهج الفرز الموجهة لتحديد المواد الأمثل لافتعال ميكروأرس كيناز سول جل المشتقة. أعيد طبعها بإذن من المرجع 8، حقوق الطبع والنشر 2013 الجمعية الكيميائية الأمريكية.

الرقم 5
الشكل 5. (أ) قسم من ميكروأري أستيلكولينستراز تظهر HC (خضراء زاهية) وLC (الضوء الأخضر) بقع (تم تطبيق لوحة الأسود والأخضر وpseudocolor أجل وضوح العرض)، (B) نسخة مكبرة من منطقة محاصر لتسليط الضوء على بقعة مورفولوجيا والمواءمة؛ و (C) مؤامرة Z 'خطوط الصلبة تشير إلى متوسط ​​لل يعيد، في حين الخطوط المتقطعة تتوافق مع 3SD. أعيد طبعها بإذن من المرجع 5، حقوق الطبع والنشر 2013 الجمعية الكيميائية الأمريكية.

الشكل (6)
الشكل (6). (A) تكرار مؤامرة للفحص على مجموعة من النظير الاصطناعية من قلويدات Amaryllidaceae؛ (B) IC 50 قطع من مثبطات المحتملة التي تم تحديدها وضعت مركبات 1 و (C) مركب 2، مع أشرطة الخطأ تمثل واحدة الانحراف المعياري للمتوسط ​​من 25 مكررات. وتظهر البقع الممثل لتوضيح الاختلافات في إشارة النسبي لتركيزات مثبط. أعيد طبعها بإذن من المرجع 5، حقوق الطبع والنشر 2013 الجمعية الكيميائية الأمريكية. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

NT "FO: المحافظة على together.within الصفحات =" دائما "> الرقم 7
الرقم 7. مقايسة على مجموعة من أربعة تحركات باستخدام 1.4SS/1.0PVA لانحباس وطباعتها على شريحة AMINE-derivatized. (A) صورة لقسم من ميكروأري التي تم موشحة البقع مع تحركات شارك في شرك مع ركائز كل منهما مع العازلة (NC، الصف العلوي)، أو محاليل تحتوي على ATP (PC، صف الأوسط) أو ATP + staurosporine (الصف السفلي). (B) الرسوم البيانية المقارنة بين شدة إشارة بين مستعمل وردود الفعل غير مأهولة، بعد الطرح من الإشارات الخلفية وأشرطة الخطأ تمثل واحدة الانحراف المعياري للمتوسط ​​من 25 مكررات. أعيد طبعها بإذن من المرجع 8، حقوق الطبع والنشر 2013 الجمعية الكيميائية الأمريكية.

الرقم 8
الرقم 8. Inhibiti. على فحص على ميكروأري p38a/MBP (A) أقسام ميكروأرس تظهر بقع ممثل overspotted مع تركيزات staurosporine متفاوتة، كما هو مبين (تم الحصول على الصور عن طريق فحص واحد من نفس الشريحة؛ يظهر صورة مركبة لوضوح). (B) IC 50 منحنى ولدت من الصور مجموعة تحليلها. تم طرح كثافة الحصول على 100 ملي من جميع الصور؛ تم تطبيع جميع كثافات أخرى عن طريق تعيين كثافة تم الحصول عليها في 10 نانومتر إلى قيمة النشاط بنسبة 100٪. أعيد طبعها بإذن من المرجع 8، حقوق الطبع والنشر 2013 الجمعية الكيميائية الأمريكية.

الرقم 9
الشكل 9. صور مجهرية دبوس الشبح المستخدمة للاتصال دبوس الطباعة تظهر مختلف عيوب: (أ) انسداد، (B) عازمة.

Discussion

وقد تم اختيار المنهجية الموصوفة هنا باعتباره الأنسب لتحديد طباعة سول جل المواد المشتقة مع طابعة الاتصال، مما ينتج عنه وقت وإجراء فعال من حيث التكلفة لتحديد بسرعة المواد الأمثل دون الحاجة لفحص أعداد كبيرة من مواد. من إجمالي 20،000 ~ المواد المحتملة، وكان من الممكن تحديد ~ 200 المواد التي كانت مناسبة للطباعة على أساس الوقت دبق وحدها. هذا إلى خفض كبير في عدد من المواد اللازمة لتكون على استعداد للمحاكمات الطباعة اللاحقة. ثم تم طبع هذه المواد قابلة للطباعة على السطوح الشريحة 4 ليصبح المجموع 768 تركيبات المواد الشريحة. في المتوسط، 50 اماكن ل/ مكرر من مادة واحدة يمكن أن تكون مطبوعة في ~ 3 دقائق، بما في ذلك تحميل عينة، ترسب بقعة والتنظيف دبوس. من هؤلاء، 155 مواد، أو ما يقرب من 20٪، سمح لطباعة أكبر عدد ممكن من النقاط في امتصاص حل وتنتج أحجام بقعة استنساخه. وتجدر الإشارة إلى أن من ال 4 SLالسطوح IDE اختبارها، وطبع مواد أفضل في الترتيب: أمين> الايبوكسي> ألدهيد> PMMA؛ لم الشرائح PMMA لا تنتج صفائف مفيدة لأي مواد. وكان من المحتمل يعزى ذلك إلى قطبية طلاء السطح. مقارنة أسطح الشرائح المذكورة آنفا، وأمين أكثر القطبية والايبوكسي وأكثر ملاءمة للSOLS مائي مقارنة مع الشرائح PMMA. وعلاوة على ذلك، من السطوح اختبارها، والشرائح المغلفة أمين توفير إمكانات سطح موجبة لتودع أنيوني سول إلى السندات. نشك، والسيليكا النانوية في مجال التفاعل بين الشريحة وسول التفاعل على طول السطح. كل من الايبوكسي والسطوح الشريحة ألدهيد تفتقر إلى نفس التفاعل الأولي على أساس تهمة. لضمان الأمثل ترسب بقعة ينصح بشدة لاستخدام الشرائح قبل المغلفة من مورد مثل Arrayit. طلاء في المنزل تنتج أسطح غير متناسقة التي تؤدي إلى سوء بقعة استنساخ 13 و، في بعض الحالات، قد يؤدي إلى مشكله الكميLEMS 18 من نفس القدر من الأهمية، ودرجة الحرارة والرطوبة تؤثر على "القابلية" من ​​المواد. بينما لم تجر أي دراسات تفصيلية عن الآثار الناجمة عن درجة الحرارة خارج، ونفذت الطباعة دائما في درجة حرارة الغرفة (23 ± 3 درجة مئوية). وتمت السيطرة الرطوبة (أكبر من 80٪) أيضا داخل غرفة الطباعة لمنع عدم انتظام ترسب شكل بسبب ترسب كميات صغيرة (0،7-2،3 NL) والتبخر.

في حين استرشدت شاشة المواد نحو تحديد المواد المشتقة سول جل الأمثل خصيصا لطباعة أستيلكولينستراز وتحركات، مجموعة صغيرة من مواد تم تحديد أن عملت لكلا النوعين من البروتينات. والحقيقة أن كلا من المواد التي تم تحديدها لكيناز ميكروأري تلفيق استندت SS + + PVA الجلسرين، وحددت أيضا كل من المواد في المواد 26 التي اختيرت لميكروأرس الألم. هذه المواد "الأمثل" قد تقدم نقطة انطلاق عام لتطوير مزيد المتواجدفي مخدر سول جل ميكروأرس مقرها، والشاشات الصغيرة تتمحور حول هذه المؤلفات قد تحدد المواد حتى أفضل لميكروأري تلفيق. والنقطة الثانية هو أن نلاحظ أهمية انزيم المستخدمة. في حالة أستيلكولينستراز (انزيم قوية نوعا ما)، 26 (أو ما يقرب من 40٪) من الاصل و66 مواد على النحو المحدد مقايسة المتوافقة مع الإبقاء على النشاط من أستيلكولينستراز شرك. ومع ذلك، لتحركات أكثر حساسية، وكانت قادرة على الإبقاء على نشاط كل تحركات 2 فقط من التراكيب مقايسة متوافق مع 69، أو ما يقرب من 3٪ من المواد،. في حين لم تدرس أعداد كافية من الإنزيمات المختلفة في الإدلاء ببيانات قاطعة، يبدو أن تلفيق مجموعة الأمثل مع الانزيمات مستقرة نسبيا قد تؤدي إلى كشف هوية المواد التي يمكن أن اصطاد مجموعة واسعة من البروتينات للسماح mutliplexed ميكروأري تلفيق.

مستقلة من البروتين المختار، كان العامل قطع رئيسية لتحديد المواد القابلة للطباعة الحاجة لفترة طويلةمرات دبق المادة (> 2.5 ساعة). عند وضع SS القائمة على المواد سول جل، فمن المهم جدا أن يكفل، بعد التبادل الأيوني والترشيح، وسول هو في حوالي درجة الحموضة 4. SOLS مع الرقم الهيدروجيني أقل الأولية قد يؤدي إلى المواد مع الرقم الهيدروجيني أقل مما كان محايدا، والتي يمكن أن تؤثر على نشاط الإنزيم. 19 ضبط كمية من Dowex (راتنج التبادل الأيوني) إلى SS يمكن أن تغير درجة الحموضة النهائية لسول. عندما يتم إعداد دفعة جديدة من الراتنج نسبة الراتنج لSS يحتاج إلى تعديل وذلك لإنتاج حوالي SOLS في درجة الحموضة 4 بعد الإجراء الموجود في المقطع 2 من البروتوكول.

وبالمثل، فإن إعداد DGS البلورية وغالبا ما يكون مصدر الخطأ المرتبط فشل المواد عند استخدام DGS SOLS مقرها لانحباس جزيء حيوي. على الرغم من عدم ذكر هنا بالتفصيل، يحتاج إلى رعاية كبيرة الواجب اتخاذها أثناء تركيب بلوري أسهم دبي للذهب، ولا سيما ضرورة تجنب وجود الماء خلال التوليف، والتي يمكن أن تنتج السيليكا polyglyceratedقسم التدريب والامتحانات بدلا من DGS أحادى. أيضا، نظرا لطبيعة استرطابي من أسهم دبي للذهب، يحتاج العينة البلورية ليتم تخزينها المجفف واستخدامها في غضون 6 أشهر بعد التوليف. أسهم دبي للذهب بلوري تزيد أعمارهم عن 6 أشهر قد لا تذوب تماما (بسبب المختصرة جزئيا مادة سيليكات polyglyceryl) حتى مع صوتنة في بيئة حمضية. أسهم دبي للذهب غير مكتملة حل تنتج SOLS مع محتوى السيليكا غير معروف ويمكن السيطرة عليها، وبالتالي، مواد أقل قوة.

نقطة مهمة أن نلاحظ مع الطباعة الاتصال هي نوعية المسامير. سوف دبابيس تلف أو أسيء التعامل معها (الشكل 9) أبدا إنتاج صفائف استنساخه مستقلة عن المواد التي يجري طباعتها. فمن المستحسن للتحقق من جودة دبوس باستخدام مجهر تشريح لضمان عدم استخدام دبابيس كسر أو انسداد. معالجة متأنية يضمن حياة طويلة للدبابيس. الحركة الحرة للدبوس مهم أيضا. في الحالات التي يتم فيها محاصرة الرطوبة في رأس الطباعة بين الرأس ودبوس، دبوسولن مقعد بشكل صحيح، وبالتالي لا تجعل الاتصال السليم مع السطح، مما أدى إلى عدم وجود ترسب المواد.

في الختام، لقد قدمنا، نهج مفصل الفرز متعددة الخطوات لتطوير عالي الكثافة البروتين مخدر ميكروأرس دبوس المطبوعة. الفحص ينطوي على تعظيم الاستفادة من خصائص المواد (الوقت دبق والقابلية) للسماح للطباعة مواد، تليها فحص أكثر تركيزا على تحديد المواد التي تتوافق مع فحص معين وقادرة على الاحتفاظ نشاط انزيم. ويمكن تطبيق هذا النهج فحص المواد الموجهة إلى صيغ ميكروأري إضافية لخفض الوقت والتكلفة المرتبطة بإنتاج ميكروأرس الكثافة كفاءة عالية.

Disclosures

ليس لدينا شيء في الكشف عنها.

Acknowledgments

المؤلفان بالشكر ماريا فندق Monton، جولي Lebert، Jessamyn ليتل، شين قه ولورا Lautens للمساعدة في تطوير ميكروأرس البروتين. كما نشكر واضعي العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا (NSERC) لتمويل هذا العمل. كما نشكر واضعي مؤسسة كندا للإبداع والابتكار أونتاريو الاستئماني لدعم هذا العمل. مجلس الدفاع المشترك يحمل كرسي أبحاث كندا في الكيمياء Bioanalytical ونظام BioInterfaces.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
  Reagent/Material
Poly(vinyl alcohol) (PVA) Sigma-Alderich 360627 80% hydrolozyed, Mw 600
Polyethylene glycol 600 (PEG) Sigma-Alderich 87333  
Polyethylenimine (PEI) Sigma-Alderich 482595 50 wt% solution in water
Carboxyethylsilanetriol (Si-COOH) Gelest, Inc. SIC2263.0 25% in water
N-(3-triethoxysilylpropyl) gluconamide(GLS) Gelest, Inc. SIT8189.0 50% in ethanol
bis[(3-methyldimethoxysilyl)propyl]polypropylene oxide (MDSPPO) Gelest, Inc. SIB1660.0  
Methyltrimethoxysilane (MTMS) Gelest, Inc. SIM6560.1  
Bis(triethoxysiyly)ethane (Bis-TEOS) Gelest, Inc. SIB1817.0  
3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES) Gelest, Inc. SIA0610.0  
Glycerol Sigma-Alderich 49767  
D-Sorbitol Sigma-Alderich 240850  
D-(+)-Trehalose dihydrate Sigma-Alderich T9531  
Triton X-100 Sigma-Alderich X-100  
Nε-Acetyl-L-lysine Sigma-Alderich A4021  
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Sigma-Alderich 154563  
HEPES Sigma-Alderich H3375  
Sodium hydroxide, 1.0 N LabChem Inc. LC24350-2  
Hydrochloric Acid, 1.0 N/0.1 N LabChem Inc. LC15300-2/LC152220-2  
Magnesium chloride Sigma-Alderich M8266  
Diglycerolsilane (DGS) Prepared in laboratory
Sodium silicate solution Fisher Scientific SS338-1  
Dowex 50WX8-100 ion exchance resin Sigma-Alderich 217492  
Acetylthiocholine iodide Sigma-Alderich 1480  
Acetylcholinesterase from Electrophorus electricus (electric eel) Sigma-Alderich C2888  
BODIPY FL L-Cystine Invitrogen B-20340  
Pro-Q Diamond Phosphoprotein/Phosphopeptide Microarray Stain Kit Invitrogen P33706  
Adenosine 5'triphosphate disodium salt (ATP) solution Sigma-Alderich A6559  
MAP Kinase 2 (MAPK2) EMD Millipore 454850  
p38α/SAPK2a (T106M), active EMD Millipore 14-687M  
Epidermal growth factor (EGFR) EMD Millipore Donated by Millipore
Glycogen synthase kinase 3β (GSK-3β) EMD Millipore 14-306  
Myelin basic protein (MBP) EMD Millipore Substrate for MAPK2 and p38α, Donated by Millipore
GSM EMD Millipore 12-533 Substrate for GSK-3β
Poly-glu-tyr polypeptide p(E4Y) EMD Millipore 12-440 Substrate for EGFR
Stealth pin ArrayIt SMP3  
Stealth pin ArrayIt SMP7  
Amine coated slides ArrayIt SMM2  
Aldehyde coated slides ArrayIt SMA2  
Exposy coated slides ArrayIt SME2  
Poly(methylmethacrylate) (PMMA) coated slides Exakt Technologies Inc. 41500  
0.2-μm syringe filter PALL Life Sciences 4612  
  Equipment
Virtek Contact Printer BioRad  
Novaray Fluorescence Slide Imager Alpha Innotech Corporation  
Desktop microarray centrifuge ArrayIt MHC110V  
MilliQ Synthesis A10 Millipore Used to filter all water required for experiments

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schena, M. M., Shalon, D. D., Davis, R. W. R., Brown, P. O. P. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science (New York, N.Y.). 270 (5235), 467-470 (1995).
  2. MacBeath, G., Schreiber, S. L. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. Science (New York, N.Y.). 289 (5485), 1760-1763 (2000).
  3. Zhu, H. H., Bilgin, M. M., et al. Global analysis of protein activities using proteome chips. Science (New York, N.Y.). 293 (5537), 2101-2105 (2001).
  4. Hook, A. L., Chang, C. -Y., et al. Combinatorial discovery of polymers resistant to bacterial attachment. Nature Biotechnology. , (2012).
  5. Monton, M. R. N., Lebert, J. M., Little, J. R. L., Nair, J. J., McNulty, J., Brennan, J. D. A Sol-Gel-Derived Acetylcholinesterase Microarray for Nanovolume Small-Molecule Screening. Analytical Chemistry. 82 (22), 9365-9373 (2010).
  6. Cho, E. J., Tao, Z., Tehan, E. C., Bright, F. V. Multianalyte pin-printed biosensor arrays based on protein-doped xerogels. Analytical Chemistry. 74 (24), 6177-6184 (2002).
  7. Cho, E. J., Tao, Z., et al. Tools to Rapidly Produce and Screen Biodegradable Polymer and Sol-Gel-Derived Xerogel Formulations. Applied Spectroscopy. Society for Applied Spectroscopy. 56 (11), 1385-1389 (2002).
  8. Ge, X., Lebert, J. M., Monton, M. R. N., Lautens, L. L., Brennan, J. D. Materials Screening for Sol-Gel-Derived High-Density Multi-Kinase Microarrays. Chemistry of Materials. 23 (16), 3685-3691 (2011).
  9. Rupcich, N., Green, J. R. A., Brennan, J. D. Nanovolume Kinase Inhibition Assay Using a Sol-Gel-Derived Multicomponent Microarray. Analytical Chemistry. 77 (24), 8013-8019 (2005).
  10. Rupcich, N. Coupled enzyme reaction microarrays based on pin-printing of sol-gel derived biomaterials. Analytica Chimica Acta. 500 (1-2), 3-12 (2003).
  11. MacBeath, G. G., Schreiber, S. L. S. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. Science (New York, N.Y.). 289 (5485), 1760-1763 (2000).
  12. Stillman, B. A. B., Tonkinson, J. L. J. FAST slides: a novel surface for microarrays. BioTechniques. 29 (3), 630-635 (2000).
  13. Rupcich, N., Goldstein, A., Brennan, J. D. Optimization of sol-gel formulations and surface treatments for the development of pin-printed protein microarrays. Chemistry of Materials. 15 (9), 1803-1811 (2003).
  14. Gill, I., Ballesteros, A. Encapsulation of biologicals within silicate, siloxane, and hybrid sol-gel polymers: An efficient and generic approach. Journal of the American Chemical Society. 120 (34), 8587-8598 (1998).
  15. Brook, M. A., Chen, Y., et al. Proteins entrapped in silica monoliths prepared from glyceroxysilanes. Journal of Sol-gel Science and Technology. 31 (1), 343-348 (2004).
  16. Brook, M. A., Chen, Y., Guo, K., Zhang, Z., Brennan, J. D. Sugar-modified silanes: precursors for silica monoliths. Journal of Materials Chemistry. 14 (9), 1469 (2004).
  17. Zhang, J., Chung, T., Oldenburg, K. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
  18. Next generation of protein microarray support materials: Evaluation for protein and antibody microarray applications. Journal of Chromatography A. , 1-8 (2013).
  19. Bhatia, R. B., Brinker, C. J., Gupta, A. K., Singh, A. K. Aqueous Sol-Gel Process for Protein Encapsulation. Chemistry of Materials. 12 (8), 2434-2441 (2000).

Tags

الكيمياء، العدد 78، الكيمياء الحيوية، الهندسة الكيميائية، علم الأحياء الجزيئي، علم الوراثة، الهندسة الحيوية، والهندسة الطبية الحيوية، المواد حيويا، السيلوكسانات، الإنزيمات، مشلول، وتقنيات التحليل الكيميائي والكيمياء (عام)، والمواد (عام)، التحليل الطيفي (الكيمياء)، والبوليمر مصفوفة المركبات، واختبار المواد (مواد مركبة)، سول جل، ميكروأري، وفحص عالية الإنتاجية، أستيل، كيناز، واكتشاف المخدرات، مقايسة
A مواد إرشادية النهج فحص لتطوير الكمي سول جل ميكروأرس بروتين المشتقة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Helka, B. J., Brennan, J. D. A… More

Helka, B. J., Brennan, J. D. A Guided Materials Screening Approach for Developing Quantitative Sol-gel Derived Protein Microarrays. J. Vis. Exp. (78), e50689, doi:10.3791/50689 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter