En guidet materiale screening tilgang til at udvikle sol-gel protein dopede microarrays ved hjælp af en spirende pin-udskrivning fremstillingsmetode beskrives. Denne metode er påvist gennem udvikling af acetylcholinesterase og multikinasehæmmer microarrays, som anvendes til omkostningseffektiv små molekyler screening.
Microarrays har fundet anvendelse i udviklingen af high-throughput assays for nye materialer og opdagelsen af små molekyler lægemiddelkandidater. Heri beskriver vi en guidet materiale screening metode til at kortlægge sol-gel-baserede materialer, der er egnede til fremstilling af tredimensionale protein microarrays. Den tilgang først identificerer materialer, der kan udskrives som microarrays, indsnævrer antallet af materialer ved at identificere dem, der er kompatible med en given enzym assay, og derefter skærper i på optimale materialer baseret på fastholdelse af maksimal enzymaktivitet. Denne tilgang anvendes til at udvikle microarrays egnet til to forskellige enzymassays, den ene med acetylcholinesterase, og den anden ved hjælp af et sæt af fire centrale kinaser involveret i kræft. I hvert tilfælde var det muligt at fremstille microarrays, der kunne anvendes til kvantitative små molekyler screeningsassays og produktion af dosis-afhængige inhibitor responskurver. Vigtigere er, at evnen screene mange materialer fremlagt oplysninger om de typer af materialer, der passer bedst både microarray produktion og fastholdelse af enzymaktivitet. De materialer data giver indsigt i basale materielle krav, der er nødvendige for at skræddersy optimale, high-density sol-gel afledte microarrays.
Microarrays har vundet popularitet i det videnskabelige samfund som en metode til at øge assay gennemløb. Da udviklingen af microarray-teknologi til at vurdere genekspression 1 i midten af 1990'erne, har microarrays fundet anvendelse i udviklingen af high-throughput assays til at identificere protein-protein og protein-small molecule interaktioner, og for at finde nye materialer med unikke egenskaber. 2-5 For nylig er microarrays blevet udviklet, hvori specifikke materialer bruges til at immobilisere funktionelle proteiner, der producerer et tredimensionalt microarray element i hvilke proteiner er indesluttet, giver mulighed for facile måling af enzymatisk aktivitet og hæmning på microarray selv ved hjælp af en passende fluorescens assay, der er koblet til underlaget omsætning. 5-10 vigtigere, kan sådanne microarrays være konstrueret til at indeholde alle nødvendige komponenter til at screene prøver og kontroller sammen i et stærkt parallel mode. 5,8 </ P>
Tidlige eksempler på protein microarrays blev typisk fremstillet under anvendelse af standardmetoder til proteinimmobilisering på faste bærere, såsom kovalent binding, 11 affinitet fange 3 og fysisk adsorption. 12. Selv om disse metoder for bio-immobilisering giver mulighed for øget prøvekoncentration og accelererede reaktionskinetik kræves for assay miniaturisering, de hver lider ulemper. I almindelighed forårsager alle en reduktion i nativ biomolekyle funktionalitet på grund kemisk modifikation af overfladen, hindres adgang til aktive sites, eller forkert orientering på grund af ikke-specifik immobilisering. Således er alle metoder resulterer i lavere analysesensitivitet trods en stigning i biomolekyle aflejring, en reaktion, der sandsynligvis opstår som følge af behovet for kunstigt binde biomolekyler til en overflade.
En ny fremgangsmåde til fremstilling af funktionelle biomolekyler microarrays er gennem pin-trykning af protein-dopedsilicasoler på faste bærere, som typisk enten funktionaliserede objektglas eller individuelle brønde i mikrobrøndsplader. Sol-gel proces selv finder sted i et vandigt miljø ved stuetemperatur, og det er den flydende precursor, der er trykt og derefter geler til indfange biomolekyler i 3D matrix, der giver mulighed for højt proteinindhold lastning 13 samt indfangning af flere komponenter inden samme microarray element. 13,14 tilpasning af sol-gel afledt materiale kan ske ved omhyggelig udvælgelse af forskellige silica forstadier, samt ved at ændre den vandige komponent ved anvendelse af forskellige puffere (pH, ionstyrke), og inddragelse af forskellige tilsætningsstoffer (polymerer, små molekyler) for at opnå en optimal materiale særlige karakter afhænger af biomolekylet der er indfanget. 10.
En potentiel begrænsning forbundet med at udvikle sol-gel protein microarrays via pin-udskrivning erbehovet for at identificere sol-gel-baserede kompositmaterialer, der kan udskrives, uden gelering i stift eller viser uønskede egenskaber (reproducerbare pletstørrelser, revner, dårlig vedhæftning, uforenelighed med assaykomponenterne, dårlig protein aktivitet) en gang trykt på en overflade. 5. Samtidig optimering af alle disse parametre hinder En tilgang hvori materialer kan designes de novo, eller behandles langsomt på en seriel måde. På den anden side, er tilfældigt screening af mange tusinde eller titusinder af materialer hverken tid-eller omkostningseffektivt.
I denne artikel beskriver vi en rettet screening tilgang, der tillader hurtig identifikation af egnede materialer til fremstilling af protein microarrays uden behov for tilfældigt screening af store mængder af materialer. Ved hjælp af en guidet fremgangsmåde, der er egnede til microarray trykning først identificeret, efterfulgt af en række små skærme til at identificere optimale sol-gel afledt materialeral kombinationer, der kan udskrives reproducerbart, uden revner og er kompatible med en given assay. Endelig er optimale materialer identificeret på baggrund af fastholdelse af enzym-aktiviteter og resultater i en endelig lille molekyle screening assay. På denne måde, kan optimale materialer identificeres fra mange tusinde kandidater kun bruger et par hundrede analysetrin. Vi viser denne fremgangsmåde til fremstilling af både high-density acetylcholinesterase og multikinasehæmmer microarrays og anvendelsen af sådanne microarrays for små-molekyle screening.
Metodikken beskrevet her blev valgt som den mest egnede til identifikation printable sol-gel afledte materialer med en kontakt printer, der producerer en tid-og omkostningseffektiv procedure til hurtig identifikation optimale materialer uden at screene store antal materialer. Fra i alt ~ 20.000 potentielle materialer, var det muligt at identificere ~ 200 materialer, der var egnet til udskrivning på grundlag af gelering tid alene. Det gør det væsentligt reduceret antallet af nødvendige materialer til at være forberedt på efterfølgende udskrivning forsøg. Disse printbare materialer blev derefter trykt på 4 glideflader for i alt 768 materiale-slide kombinationer. I gennemsnit kan 50 pletter / gentagelser af ét materiale blive trykt i ~ 3 min, herunder prøve lastning, spot deposition og pin rengøring. Af dem, tillod 155 materialer, eller omkring 20%, til udskrivning af det maksimale antal af pletter pr opløsning optagelse og produceret reproducerbare pletstørrelser. Det skal bemærkes, at af de 4 slide overflader testet materialer trykt bedre i rækkefølge: amin> epoxy> aldehyd> PMMA, PMMA slides ikke frembringe nyttige arrays til alle materialer. Dette var sandsynligvis tilskrives polariteten af overfladebelægningen. Sammenligne de førnævnte glideflader, blev den mere polære amin og epoxy bedre egnet til de vandige sole forhold til PMMA dias. Endvidere af de testede overflader, giver amin coatede objektglas en potentiel positivt ladet overflade for den indskudte anioniske sol til binding. Vi formoder, at silica nanopartikler ved grænsefladen mellem slæden og sol interagere langs overfladen. Både epoxy og aldehyd glideflader mangler den samme oprindelige ladning-interaktion. For at sikre optimal spot deposition er det stærkt anbefales at bruge pre-coatede objektglas fra en leverandør som Arrayit. In-house coating producerer inkonsistente overflader, der fører til dårlig spot reproducerbarhed 13, og i nogle tilfælde kan føre til kvantificering probblemer. 18. Af lige så stor betydning, temperatur og fugtighed påvirker "trykbarhed" af materialerne. Selv om der ikke detaljerede undersøgelser af virkningerne relateret til temperatur blev udført, blev trykning altid udføres ved stuetemperatur (23 ± 3 ° C). Luftfugtighed (over 80%) blev også kontrolleret inden print kammeret for at forhindre uregelmæssig form aflejring på grund af små deposition volumener (0,7-2,3 nl) og fordampning.
Mens materialet skærmen blev styret til at identificere optimale sol-gel afledte materialer specielt til udskrivning af AChE og kinaser, et lille sæt af materialer blev identificeret, som arbejdede for begge typer af proteiner. Faktisk var begge af de materialer, der blev identificeret for kinase microarray fabrikation baseret på SS + PVA + glycerol, og begge materialer blev også identificeret inden for de 26 udvalgte materialer for AChE microarrays. Disse "optimale" materialer kan tilbyde en generisk udgangspunkt for at udvikle yderligere protei-doterede sol-gel-baserede microarrays, og små skærme centreret omkring disse sammensætninger kan identificere endnu bedre materialer til microarray fabrikation. Et andet punkt at bemærke er betydningen af det anvendte enzym. I tilfælde af AChE (en temmelig robust enzym), beholdt 26 (eller omtrent 40%) af de oprindelige 66 materialer identificeret som assay-kompatibelt aktivitet indesluttet AChE. Men for de mere sarte kinaser, var kun 2 af de 69-assay-kompatible præparater, eller omkring 3% af de materialer, i stand til at bevare aktiviteten af alle kinaser. Mens tilstrækkeligt antal forskellige enzymer ikke er blevet undersøgt for at gøre endegyldige udsagn, fremgår det, at optimering matrix fabrikation med relativt ustabile enzymer kan føre til identifikation af materialer, der kan vikle en bred vifte af proteiner til at tillade mutliplexed microarray fabrikation.
Uafhængigt af den valgte protein, de store cut-off faktor til identifikation printbare materialer var behovet for en langmateriale geleringsproblemer gange (> 2,5 timer). Ved udviklingen SS baserede sol-gel materialer, er det meget vigtigt at sikre, at der efter ionbytning og filtrering, solen er på omkring pH 4. Soler med en lavere pH-værdi kan resultere i materialer med en lavere-end-neutralt pH, hvilket kan påvirke enzymaktivitet. 19. justere mængden af Dowex (ionbytterharpiks) til SS kan ændre det endelige pH af solen. Når en ny batch af harpiks fremstilles forholdet mellem harpiks SS skal justeres således at producere soler på omkring pH 4 efter proceduren i punkt 2 i protokollen.
Tilsvarende fremstillingen af krystallinske DGS er ofte en kilde til fejl i forbindelse med materiale svigt ved anvendelse DGS baserede soler til biomolekyle indfangning. Selvom det ikke er rapporteret her i detaljer, stor omhu skal tages under syntesen af krystallinske DGS, især behovet for at undgå tilstedeværelsen af vand i løbet af syntesen, der kan producere polyglycerated silicates snarere end monomere DGS. Også på grund af den hygroskopiske natur af DGS, den krystallinske prøve skal lagres udtørret og anvendes inden for 6 måneder efter syntese. Krystallinske DGS ældre end 6 måneder, kan ikke opløses fuldstændigt (på grund af delvis kondenseret polyglyceryl silikat materiale) selv med lydbehandling i et surt miljø. Ufuldstændig DGS opløsning producerer soler med ukendte og ukontrollerbare indhold af silica og dermed mindre robuste materialer.
Et vigtigt punkt at bemærke med kontakt udskrivning er kvaliteten af ben. Beskadigede eller fejlhåndtering stifter (figur 9), vil aldrig give reproducerbare arrays uafhængigt af det materiale, der udskrives. Det anbefales at kontrollere pin kvalitet ved hjælp af en dissektion mikroskop for at sikre knuste eller tilstoppede ben er ikke brugt. Omhyggelig håndtering sikrer lang levetid for stifterne. Fri bevægelighed for stiften er også vigtig. I de tilfælde, hvor fugt er fanget i printhovedet mellem hovedet og pin, stiftenvil ikke sæde korrekt og vil således ikke gøre korrekt kontakt med overfladen, hvilket resulterer i en mangel på aflejring af materiale.
Afslutningsvis har vi givet et detaljeret, flertrins screening tilgang til udvikling af high-density protein doterede pin-trykte microarrays. Screeningen omfatter optimering af materialeegenskaber (gelering tid og trykbarhed) for at tillade trykning af materialer, efterfulgt af mere fokuseret screening til at identificere materialer, der er kompatible med en given assay og i stand til at bevare enzymaktivitet. Denne guidede materiale screening tilgang kan anvendes til yderligere microarray-formater for at reducere tid og omkostninger forbundet med at producere effektive high-density microarrays.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Maria Monton, Julie Lebert, Jessamyn Little, Xin Ge og Laura Lautens om bistand til udvikling af protein microarrays. Forfatterne takker også naturvidenskab og Engineering Research Council of Canada (NSERC) for at finansiere dette arbejde. Forfatterne takker også Canada Foundation for Innovation og Ontario Innovation Trust for støtte for dette arbejde. JDB holder Canada Research Chair i Bioanalytisk kemi og Biointerfaces.
Reagent/Material | |||
Poly(vinyl alcohol) (PVA) | Sigma-Alderich | 360627 | 80% hydrolozyed, Mw 600 |
Polyethylene glycol 600 (PEG) | Sigma-Alderich | 87333 | |
Polyethylenimine (PEI) | Sigma-Alderich | 482595 | 50% (w/w) solution in water |
Carboxyethylsilanetriol (Si-COOH) | Gelest, Inc. | SIC2263.0 | 25% in water |
N-(3-triethoxysilylpropyl) gluconamide(GLS) | Gelest, Inc. | SIT8189.0 | 50% in ethanol |
bis[(3-methyldimethoxysilyl)propyl]polypropylene oxide (MDSPPO) | Gelest, Inc. | SIB1660.0 | |
Methyltrimethoxysilane (MTMS) | Gelest, Inc. | SIM6560.1 | |
Bis(triethoxysiyly)ethane (Bis-TEOS) | Gelest, Inc. | SIB1817.0 | |
3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES) | Gelest, Inc. | SIA0610.0 | |
Glycerol | Sigma-Alderich | 49767 | |
D-Sorbitol | Sigma-Alderich | 240850 | |
D-(+)-Trehalose dihydrate | Sigma-Alderich | T9531 | |
Triton X-100 | Sigma-Alderich | X-100 | |
Nε-Acetyl-L-lysine | Sigma-Alderich | A4021 | |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Alderich | 154563 | |
HEPES | Sigma-Alderich | H3375 | |
Sodium hydroxide, 1.0 N | LabChem Inc. | LC24350-2 | |
Hydrochloric Acid, 1.0 N/0.1 N | LabChem Inc. | LC15300-2/LC152220-2 | |
Magnesium chloride | Sigma-Alderich | M8266 | |
Diglycerolsilane (DGS) | Prepared in laboratory | ||
Sodium silicate solution | Fisher Scientific | SS338-1 | |
Dowex 50WX8-100 ion exchance resin | Sigma-Alderich | 217492 | |
Acetylthiocholine iodide | Sigma-Alderich | 1480 | |
Acetylcholinesterase from Electrophorus electricus (electric eel) | Sigma-Alderich | C2888 | |
BODIPY FL L-Cystine | Invitrogen | B-20340 | |
Pro-Q Diamond Phosphoprotein/Phosphopeptide Microarray Stain Kit | Invitrogen | P33706 | |
Adenosine 5'triphosphate disodium salt (ATP) solution | Sigma-Alderich | A6559 | |
MAP Kinase 2 (MAPK2) | EMD Millipore | 454850 | |
p38α/SAPK2a (T106M), active | EMD Millipore | 14-687M | |
Epidermal growth factor (EGFR) | EMD Millipore | Donated by Millipore | |
Glycogen synthase kinase 3β (GSK-3β) | EMD Millipore | 14-306 | |
Myelin basic protein (MBP) | EMD Millipore | Substrate for MAPK2 and p38α, Donated by Millipore | |
GSM | EMD Millipore | 12-533 | Substrate for GSK-3β |
Poly-glu-tyr polypeptide p(E4Y) | EMD Millipore | 12-440 | Substrate for EGFR |
Stealth pin | ArrayIt | SMP3 | |
Stealth pin | ArrayIt | SMP7 | |
Amine coated slides | ArrayIt | SMM2 | |
Aldehyde coated slides | ArrayIt | SMA2 | |
Exposy coated slides | ArrayIt | SME2 | |
Poly(methylmethacrylate) (PMMA) coated slides | Exakt Technologies Inc. | 41500 | |
0.2-μm syringe filter | PALL Life Sciences | 4612 | |
Equipment | |||
Virtek Contact Printer | BioRad | ||
Novaray Fluorescence Slide Imager | Alpha Innotech Corporation | ||
Desktop microarray centrifuge | ArrayIt | MHC110V | |
MilliQ Synthesis A10 | Millipore | Used to filter all water required for experiments |