En guidet Materials Screening tilgang til udvikling af Kvantitative Sol-gel protein Microarrays

Summary

En guidet materiale screening tilgang til at udvikle sol-gel protein dopede microarrays ved hjælp af en spirende pin-udskrivning fremstillingsmetode beskrives. Denne metode er påvist gennem udvikling af acetylcholinesterase og multikinasehæmmer microarrays, som anvendes til omkostningseffektiv små molekyler screening.

Abstract

Microarrays har fundet anvendelse i udviklingen af ​​high-throughput assays for nye materialer og opdagelsen af ​​små molekyler lægemiddelkandidater. Heri beskriver vi en guidet materiale screening metode til at kortlægge sol-gel-baserede materialer, der er egnede til fremstilling af tredimensionale protein microarrays. Den tilgang først identificerer materialer, der kan udskrives som microarrays, indsnævrer antallet af materialer ved at identificere dem, der er kompatible med en given enzym assay, og derefter skærper i på optimale materialer baseret på fastholdelse af maksimal enzymaktivitet. Denne tilgang anvendes til at udvikle microarrays egnet til to forskellige enzymassays, den ene med acetylcholinesterase, og den anden ved hjælp af et sæt af fire centrale kinaser involveret i kræft. I hvert tilfælde var det muligt at fremstille microarrays, der kunne anvendes til kvantitative små molekyler screeningsassays og produktion af dosis-afhængige inhibitor responskurver. Vigtigere er, at evnen screene mange materialer fremlagt oplysninger om de typer af materialer, der passer bedst både microarray produktion og fastholdelse af enzymaktivitet. De materialer data giver indsigt i basale materielle krav, der er nødvendige for at skræddersy optimale, high-density sol-gel afledte microarrays.

Introduction

Microarrays har vundet popularitet i det videnskabelige samfund som en metode til at øge assay gennemløb. Da udviklingen af microarray-teknologi til at vurdere genekspression ¹ i midten af 1990'erne, har microarrays fundet anvendelse i udviklingen af high-throughput assays til at identificere protein-protein og protein-small molecule interaktioner, og for at finde nye materialer med unikke egenskaber. ^2-5 For nylig er microarrays blevet udviklet, hvori specifikke materialer bruges til at immobilisere funktionelle proteiner, der producerer et tredimensionalt microarray element i hvilke proteiner er indesluttet, giver mulighed for facile måling af enzymatisk aktivitet og hæmning på microarray selv ved hjælp af en passende fluorescens assay, der er koblet til underlaget omsætning. ^5-10 vigtigere, kan sådanne microarrays være konstrueret til at indeholde alle nødvendige komponenter til at screene prøver og kontroller sammen i et stærkt parallel mode. ^5,8 </ P>

Tidlige eksempler på protein microarrays blev typisk fremstillet under anvendelse af standardmetoder til proteinimmobilisering på faste bærere, såsom kovalent binding, ¹¹ affinitet fange ³ og fysisk adsorption. ^12. Selv om disse metoder for bio-immobilisering giver mulighed for øget prøvekoncentration og accelererede reaktionskinetik kræves for assay miniaturisering, de hver lider ulemper. I almindelighed forårsager alle en reduktion i nativ biomolekyle funktionalitet på grund kemisk modifikation af overfladen, hindres adgang til aktive sites, eller forkert orientering på grund af ikke-specifik immobilisering. Således er alle metoder resulterer i lavere analysesensitivitet trods en stigning i biomolekyle aflejring, en reaktion, der sandsynligvis opstår som følge af behovet for kunstigt binde biomolekyler til en overflade.

En ny fremgangsmåde til fremstilling af funktionelle biomolekyler microarrays er gennem pin-trykning af protein-dopedsilicasoler på faste bærere, som typisk enten funktionaliserede objektglas eller individuelle brønde i mikrobrøndsplader. Sol-gel proces selv finder sted i et vandigt miljø ved stuetemperatur, og det er den flydende precursor, der er trykt og derefter geler til indfange biomolekyler i 3D matrix, der giver mulighed for højt proteinindhold lastning ¹³ samt indfangning af flere komponenter inden samme microarray element. ^13,14 tilpasning af sol-gel afledt materiale kan ske ved omhyggelig udvælgelse af forskellige silica forstadier, samt ved at ændre den vandige komponent ved anvendelse af forskellige puffere (pH, ionstyrke), og inddragelse af forskellige tilsætningsstoffer (polymerer, små molekyler) for at opnå en optimal materiale særlige karakter afhænger af biomolekylet der er indfanget. ^10.

En potentiel begrænsning forbundet med at udvikle sol-gel protein microarrays via pin-udskrivning erbehovet for at identificere sol-gel-baserede kompositmaterialer, der kan udskrives, uden gelering i stift eller viser uønskede egenskaber (reproducerbare pletstørrelser, revner, dårlig vedhæftning, uforenelighed med assaykomponenterne, dårlig protein aktivitet) en gang trykt på en overflade. ^5. Samtidig optimering af alle disse parametre hinder En tilgang hvori materialer kan designes de novo, eller behandles langsomt på en seriel måde. På den anden side, er tilfældigt screening af mange tusinde eller titusinder af materialer hverken tid-eller omkostningseffektivt.

I denne artikel beskriver vi en rettet screening tilgang, der tillader hurtig identifikation af egnede materialer til fremstilling af protein microarrays uden behov for tilfældigt screening af store mængder af materialer. Ved hjælp af en guidet fremgangsmåde, der er egnede til microarray trykning først identificeret, efterfulgt af en række små skærme til at identificere optimale sol-gel afledt materialeral kombinationer, der kan udskrives reproducerbart, uden revner og er kompatible med en given assay. Endelig er optimale materialer identificeret på baggrund af fastholdelse af enzym-aktiviteter og resultater i en endelig lille molekyle screening assay. På denne måde, kan optimale materialer identificeres fra mange tusinde kandidater kun bruger et par hundrede analysetrin. Vi viser denne fremgangsmåde til fremstilling af både high-density acetylcholinesterase og multikinasehæmmer microarrays og anvendelsen af ​​sådanne microarrays for små-molekyle screening.

Protocol

1.. Udarbejdelse af Additive Solutions

1. Forbered 25 og 50 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethan (Tris-base, _Mr 121,14 g / mol) og HEPES _(Mr 238,3 g / mol) ved pH 7,0, 7,2, 7,4, 7,6, 7,8, 8,0 og 8,2 i 50 ml centrifugerør rør. PH justeres med 1 N HCI og NaOH hhv. Opbevares ved stuetemperatur og erstatte efter 3 måneder.
2. Forbered 24% (w / v) poly (vinylalkohol) (PVA): afvejes 2,4 g PVA _(Mw 9.000 - 10.000, 80% hydrolyseret) og tilsæt til 10 ml deioniseret vand _(ddH2O), opløses de polymerpellets ved hvirvelblanding. Bruge 24% (w / v) opløsning til fremstilling af lige volumener af 16% (w / v), 12% (w / v) og 8% (w / v) PVA-løsninger. Afgasses løsninger ved lydbehandling før brug. Opbevares ved 4 ° C i op til 1 måned.
3. Forbered 24% (w / v) polyethylenimin (PEI): Der tilsættes 4,8 ml af PEI _(Mw 1.300, 50% (w / w) i _H2O) til 5,2 ml Hedeselskabet ₂ O. Bruge 24% (w / v) opløsning til fremstilling af lige volumeneraf 16% (w / v), 12% (w / v) og 8% (w / v) PEI-løsninger. Afgasses løsninger ved lydbehandling før brug. Opbevares ved 4 ° C i op til 1 måned.
4. Forbered 60% (w / v) polyethylenglycol (PEG): afvejes 6 g PEG _(Mw 600), og der tilsættes 10 ml _ddH2O, opløses polymerpellets ved hvirvelbehandling. Brug seriefortynding at forberede et lige volumen af ​​30% (w / v) PEG-opløsning. Afgasses løsninger ved lydbehandling før brug. Opbevares ved 4 ° C i op til 1 måned.
5. Forbered 24% (v / v) N-(3-triethoxysilylpropyl) gluconamide (GLS): add 480 pi GLS (50% i ethanol - stock GLS kan kræve anvendelse af et vandbad for at opvarme og opløse løsning, hvis krystallinsk) til 520 pi af 95% (v / v) ethanol og blandes i 20 minutter ved sonikering. Bruge 24% (v / v) opløsning for at gøre et lige volumen af ​​16% (v / v) GLS opløsning. Gør nye løsninger til brug per dag.
6. Forbered 24% (v / v) methyltrimethoxysilan (MTMS): add 240 pi MTMS til 760 pi af eksisterende syrnet _ddH2O (pH 2,0, 1 N HCI) og bland i 20 min ved lydbehandling. Bruge 24% (v / v) opløsning for at gøre et lige volumen af ​​16% (v / v) MTMS opløsning. Gør nye løsninger til brug per dag.
7. Forbered 24% (v / v)-bis ​​[(3-methyldimethoxylsilyl) propyl] polypropylenoxid (MDSPPO): add 240 pi MDSPPO til 760 pi af eksisterende syrnet _ddH2O (pH 2,0, 1 N HCI) og bland i 20 minutter ved lydbehandling. Bruge 24% (v / v) opløsning for at gøre et lige volumen af ​​16% (v / v) MDSPPO opløsning. Gør nye løsninger til brug per dag.
8. Forbered 24% (v / v) 3 - (aminopropyl)-triethoxysilan (APTES): add 240 pi APTES til 760 pi af eksisterende syrnet _ddH2O (pH 2,0, 1 N HCI) og bland i 20 minutter ved lydbehandling. Bruge 24% (v / v) opløsning for at gøre et lige volumen af ​​16% (v / v) APTES opløsning. Gør nye løsninger til brug per dag.
9. Forbered 24% (v / v)-bis ​​(triethoxysily) ethan (bis-TEOS): add 240 pi bis-TEOS til 760 pi af eksisterende forsuret _ddH2O (pH 2,0, 1 N HCI) Og bland i 20 min ved lydbehandling. Bruge 24% (v / v) opløsning for at gøre et lige volumen af ​​16% (v / v)-bis-TEOS opløsning. Gør nye løsninger til brug per dag.
10. Forbered 24% (v / v) carboxyethylsilanetriol (Si-COOH): add 960 pi Si-COOH (25% i _ddH2O) til 40 ul af eksisterende syrnet _ddH2O (pH 2,0, 1 N HCI) og blandes til 20 min ved lydbehandling. Bruge 24% (v / v) opløsning for at gøre et lige volumen af ​​16% (v / v) Si-COOH opløsning. Gør nye løsninger til brug per dag.
11. Separat at fremstille 3 mM _N-ε - acetyl-L-lysin, D-sorbitol, α-α-trehalose _(Mr 188,22 g / mol, 182,17 g / mol, og 378,33 g / mol, henholdsvis) og 1,5 mM Triton X-100 (gennemsnitlig _Mw 625 g / mol) i Hedeselskabet ₂ O. Mængderne kan variere afhængigt af hvor meget der kræves lave nye løsninger til brug per dag.
12. Forbered 60% (w / w) glycerol: Tilsæt 2,4 g vandfri glycerol til 1,6 g _ddH2O, blandes ved vortex. Degas-løsningved lydbehandling før brug. Opbevares ved 4 ° C i op til 1 måned.
13. Forbered 30% (w / w) glycerol: Tilsæt 1,6 g vandfri glycerol til 2,4 g _ddH2O, blandes ved vortex. Afgasses opløsning ved lydbehandling før brug. Opbevares ved 4 ° C i op til 1 måned.

2.. Fremstilling af silicasoler

Efter nedenstående procedurer, de respektive soler, når det opbevares på is, kan bruges op til 1 time efter tilsætning af vand. Sols brugt over 1 time resultere i nedsat / inkonsistente materiale gellation tider.

1. Fremstilling af en natrium-silikat (SS) baseret sol
   1. Afvejes 120 g ionbytterharpiks i en 500 ml plastbæger.
   2. Tilsæt 150 ml 0,1 N HCI og omrøres i 1 time ved hjælp af en 2-tommers magnetisk omrørerstav.
   3. Opløsningen filtreres ved hjælp af en Buchner tragt forbundet til vakuum.
   4. Tilsættes langsomt _ddH2O at vaske filtrerede harpiks indtil den resulterende filtrat er klar. Dette tager cirka 100ml Hedeselskabet ₂ O.
   5. Indsamle og opbevare den forberedte harpiks i en plastikbeholder ved stuetemperatur i op til 1 måned.
   6. Afvejes 2,59 g natriumsilicat (SS, 27% ​​(vægt / vægt) _SiO2, 10% (w / w) NaOH) i en 50 ml plastbæger.
   7. Tilføj 10 ml _ddH2O til SS. Vendes forsigtigt med hånden for at blande opløsningen.
   8. Afvejes 5,60 g af færdige harpiks i en separat 50 ml plastbæger. Tilføj til natriumsilicatopløsningen og blandes i 2 minutter ved hjælp af en en-tommer magnetisk omrørerstav.
   9. Blandingen filtreres opløsningen med en Buchner tragt forbundet til en aspirator knyttet til en vandhane.
   10. Brug en 10 ml plastsprøjte forsynet med et 0,2 um membranfilter at foretage sol løsning. Dette giver en sol med 5,6% (w / w) siliciumoxid benævnt SS i yderligere tekst. Hold solen på is, når den ikke er i brug.
   11. ½ SS: tilsættes 1 ml forberedt SS sol til 1 ml _ddH2O, blandes ved vortex. Hold solen på is, når den ikkebrug.
2. Udarbejdelse af en diglycerylsilane (DGS) baseret sol
   1. Syntetisere DGS som beskrevet andetsteds. ^15,16 Store krystallinske indskudsgarantiordning i et ekssikkator til stuetemperatur i op til 6 måneder.
   2. Afvejes omkring 1 g af krystallinske DGS.
   3. Brug en morter og støder at male DGS til et fint pulver. Udfør dette trin så hurtigt som muligt for at forhindre fugt absorption fra luften.
   4. Omhyggeligt overføre fintmalede DGS til en tom 20 ml scintillationshætteglas, registrerer massen (til en tusindedel af et gram).
   5. Tilføj _ddH2O at give en 0,5 g / ml DGS.
   6. Sonikeres de hydrolyserede DGS på is i 20 min, bland ved vortex i 5 sekunder hver 5 min. Under fugtige dage, kan fuldstændig opløsning af DGS kræve tilsætning af 10 pi af 1 N HCI. Dette bør føjes til opløsningen før sonikering.
   7. Brug en 3-ml plastsprøjte forsynet med et 0,2 um membranfilter at foretage sol opløsning, fjerne fine partikler. Dette giver en sol med 5,0% (w / w) siliciumoxid benævnt DGS i yderligere tekst. Hold solen på is, når den ikke er i brug.
   8. ½ DGS: Tilsæt 1 ml af færdige DGS sol til 1 ml _ddH2O, blandes ved vortex. Hold solen på is, når den ikke er i brug.

3.. Pre-screening for at identificere Printable Materials

En generaliseret skema, der viser de forskellige stadier af guidet faktoranalyse bruges til at identificere printbare materialer er vist i figur 1.. Et minimum samlede materiale volumen på 100 ul anbefales. Anvendelse af mindre mængder gør visualisere materiale gelering vanskelig.

1. Fase 1: buffer og silan
   1. Der tilsættes 50 pi puffer (25 og 50 mM Tris eller HEPES ved pH 7,0, 7,2, 7,4, 7,6, 7,8, 8,0, 8,2) til et 2 ml glasscintillationshætteglas.
   2. Tilføj 50 pi af den passende sol (DGS, ½ DGS, SS, ½ SS) og vortex blandingen i en on-and-off mode for 10 sek vedflytte hætteglasset og slukkes hvirvelmixer.
   3. Indstil materialer til hvile ved stuetemperatur, overvåger den tid materiale gelering. Geleringstiden er defineret som det punkt, hvor materialet ikke flyder frit ved at vende hætteglasset til en 45 ° vinkel.
   4. Udeluk materialekombinationer med geleringsproblemer gange mindre end 2,5 hr fra efterfølgende materiale screening etaper.
2. Trin 2: buffer, silan og polymer
   1. I en 2 ml glasscintillationshætteglas, tilsættes 3,13 pi af enten 16% (w / v) eller 8% (w / v) PVA / PEI opløsning eller 6,3 pi 30% (w / v) eller 60% (vægt / v) PEG-opløsning.
   2. Tilføj 50 mM HEPES (pH 8,0) for at bringe den samlede mængde til 50 ul, blande opløsningen af ​​vortex.
   3. Tilføj 50 pi af den passende sol (DGS, ½ DGS, SS, ½ SS), blandes i mode beskrevet i trin 3.1.2.
   4. Udeluk materialekombinationer med geleringsproblemer gange (som defineret i trin 3.1.3) mindre end 2,5 time fra efterfølgende materiale screening etaper.
3. Trin 3: buffer, silan polymer og organosilan
   1. I en 2 ml glasscintillationshætteglas, tilsættes 3,13 pi af enten 16% (w / v) eller 8% (w / v) PVA-opløsning eller 6,3 pi 30% (w / v) eller 60% (w / v) PEG-opløsning.
   2. Tilføj 3.13 pi 16% (w / v) organosilan (GLS, MTMS, MDSPPO, bis-TEOS, Si-COOH eller APTES).
   3. Tilføj 50 mM HEPES (pH 8,0) for at bringe den samlede mængde til 50 ul, blande opløsningen af ​​vortex.
   4. Tilføj 50 pi af den passende sol (DGS, ½ DGS, SS, ½ SS) og blandes i mode beskrevet i trin 3.1.2. Udeluk materialekombinationer med geleringsproblemer gange (som defineret i trin 3.1.3) mindre end 2,5 time fra efterfølgende materiale screening etaper.
4. Trin 4: buffer, silan polymer organosilan og små-molekyle tilsætningsstof
   1. I en 2 ml glasscintillationshætteglas, tilsættes 2,08 pi af enten 24% (w / v) eller 12% (w / v) PVA-opløsning eller 6,3 pi 30% (w / v) eller 60% (w / v) PEG-opløsning.
   2. Tilføj2,08 pi 24% (w / v) organosilan (GLS, Si-COOH).
   3. Tilføj 2,08 ul af 3 mM små-molekyle opløsning (N _ε - acetyl-L-lysin, D-sorbitol, α-α-trehalose) eller 1,5 mM (Triton X-100).
   4. Tilføj 50 mM HEPES (pH 8,0) for at bringe den samlede mængde til 50 ul, blande opløsningen af ​​vortex.
   5. Tilføj 50 pi af den passende sol (DGS, ½ DGS, SS, ½ SS) og blandes i mode beskrevet i trin 3.1.2.
   6. Udeluk materialekombinationer med geleringsproblemer gange (som defineret i trin 3.1.3) mindre end 2,5 time fra efterfølgende væsentlige udskrivning etaper.

4.. Udarbejdelse af Printable Protein-doped Materials

Materialerne er identificeret ved afslutningen af ​​trin 3.4.6 fremføres i trykbarhedsegenskaber undersøgelser med passende enzym nu indgår i sol. I alle tilfælde beskrevet nedenfor, vandig opløsning indeholdende alle komponenter undtagen silanenfremstilles i en mikrobrønd, efterfulgt af tilsætning af solen lige før udskrivning. At tilpasse brugen af ​​en 384-mikrotiterplade, er en samlet løsning volumen på 50 pi anvendes i stedet for 100 gl.

1. Acetylcholinesterase (AChE) microarray
   1. Forbered en 2 kU / ml opløsning af AChE i 50 mM HEPES (pH 8,0) efter partiet specifikt enzym aktivitet (enheder aktivitet pr mg) oplysninger fra producenten.
   2. Aliquot 2 kU / ml enzym stamopløsning i 5 pi fraktioner med 500 ul mikrocentrifugerør og opbevares ved -20 ° C. 2 KU / ml AChE stamopløsninger forblive stabil i op til 4 måneder ved opbevaring ved -20 ° C.
   3. Forbered basismaterialer ved at kombinere halvdelen mængder tilsvarende polymerer, organosilaner og små molekyler tilsætningsstoffer identificeret ved trin 3.4.6 i en 384-godt mikrotiterplade.
   4. Tilsæt 5 pi 2 kU / ml AChE i 50 mM HEPES (pH 8,0).
   5. Brug 50 mM HEPES (pH 8,0), bringe den kombineredebrøndvolumen til 25 ul mix ved pipettering af opløsningen op og ned flere gange.
2. Multikinasehæmmer microarray
   1. Forbered 100 ng / ul kinase løsninger (p38a, MAPK2, EGFR, GSK-3β) i _ddH2O efter aktivitet (U / ml eller U / mg) og mængde oplysninger fra producenten. Opbevar kinase opløsninger i portioner på 2 gl ved -80 ° C.
   2. Forbered kinase substrater (MBP, s. (E ₄ Y), GSM) ved 5 mg / ml, 50 mg / ml eller 300 uM i _ddH2O efter mængde oplysninger fra producenten. Opbevar substrater i portioner af 2,5 pi ved -80 ° C.
   3. Forbered basismaterialer ved at kombinere halvdelen mængder tilsvarende polymerer, organosilaner og små molekyler tilsætningsstoffer identificeret ved trin 3.4.6 i en 384-godt mikrotiterplade.
   4. Til hver brønd indeholdende basismaterialerne, 2.5 pi kinase og 2 pi af dens respektive substrat (p38a og MBP, MAPK2 og MBP, EGF tilføjeR og p (E ₄ Y), GSK-3β og GSM) som fremstillet i trin 4.2.1 og 4.2.2, hhv.
   5. Brug 50 mM HEPES (pH 7,4), bringe det kombinerede godt volumen til 25 ul. Bland ved pipettering.

5.. Microarray Formation

Dette afsnit forklarer den detaljerede procedure for udskrivning af materiale på et enkelt dias overflade. Sådan udskrives på flere modificerede glideflader (amin, epoxy, aldehyd og PMMA), er denne procedure gentages 4 gange.

1. Form microarrays ved hjælp af en kontaktstift-printing robot er udstyret med et XYZ stadium. Brug slidsede kappe stifter af 100 uM diameter at deponere protein-doped sols.
2. Indstil fugtigheden i trykning kammeret til 80-90%. Fugtighed <80% kan resultere i prøvefordampning og uoverensstemmelser i trykning på grund af de små deposition mængder.
3. Sonikeres ben i _ddH2O i 15 minutter forud for trykning og tørres under en strøm af nitrogen. Brug et rør cleaner for at fjerne tilbageværende fugt indefra kegleholderens og anbring forsigtigt stiften i printhovedet. Manglende fjerne tilbageværende fugt kan hindre stiften bevæge sig frit med holderen, hvilket resulterer i ubesvarede pletter.
4. Kontrol-array mønstre gennem Chip Writer Pro (CWP) program. For hver prøve godt inden for 384-godt source plade er 200 pletter (maksimalt antal spots pr optagelse ved hjælp af SMP3 kappe ben) trykt på en overflade-modificeret objektglas.
5. Påbegynde trykprocessen via softwaren. Indstil rejse i XY retningen til 10 mm / s og prøve anflyvningshastighed (Z-retning) til 2 mm / s med en 2,5 sek prøveindføringen tid.
6. Pause i løbe igennem CWP. Sænk stiften i prøven og tilsættes 25 ul af de respektive sol (DGS, ½ DGS, SS, ½ SS) til brønden med pipette. Bland opløsningen ved hjælp af en up-and-down pipettering bevægelse gentages 50x. Ved blanding ved pipettering, minimere mængden af ​​luft blæst ind i opløsningen. Luftbobler forebyggelset komplet indlæsning af prøve i stiften.
7. Påbegynde trykprocessen gennem CWP, og udskrive prøven på én slide overflade. Pause trykprocessen før læsning prøve fra den efterfølgende kilde pladen godt.
8. Fjern udskrivning pin ved hjælp af en magnet og placere en piberenser i printhovedet for at forhindre fugt oprustning i printhovedet.
9. Skyl udskrivning pin med Hedeselskabet ₂ O og soniker i rent _ddH2O i 30 sek.
10. Tør trykning pin under en strøm af nitrogen og fjern piberenser, placerer stiften tilbage i printhovedet.
11. Begynd udskrivningen ved at følge trin 5,6-5,10, for alle prøver forbliver inden kilden plade. Op til 12.000 pletter af 100 um diameter kan deponeres på et enkelt dias.
12. Denne metode kan også anvendes til trykning af materialer på bunden af ​​brøndene i en 96-brønds mikroplade. Efter CWP kalibreringsfil, trykning pin kalibrere at sikre afstandece rejste op mellem spot deposition er over højden af ​​mikrobrønd pladen. Dette gør det muligt for stiften at udskrive konsekvent fra brønd til brønd i et lineært uden at beskadige stiften.
13. Alder array i mindst 30 min og op til 24 timer inden udskrivningen kammer ved 80-90% luftfugtighed efter afslutningen af ​​hele trykning eksperiment.

6.. Acetylcholinesterase Activity Assay

1. Forberedelse positive kontrol (PC) prøver
   1. Klargør 1 mM acetylthiocholin iodid (atch: _Mr 289,18 g / mol) i 4% glycerol, 25 mM Tris (pH 7,0) i et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Atch behov for at være forberedt frisk før hver brug, og ved hjælp af en buffer ved pH 7,0, som højere pH buffere forårsage hurtig autohydrolysis, der producerer falske positiver. Det endelige volumen kan varieres afhængigt af antallet af prøver (25 pi per prøve).
   2. Tilføj 0.14 ul 5 mM BODIPY-Fl-L-cystin til 25 pi 1 mM atch i brønden af ​​en 384-mikrotiter PLAte.
   3. Tilføj 24.86 pi 4% glycerol, 25 mM Tris (pH 7,0) og blandes ved pipettering forsigtigt for at undgå bobledannelse i opløsningen. Potentielle enzymhæmmere kan inkorporeres i pc-løsning, før at bringe lydstyrken til 50 pi med buffer.
2. Forberedelse negative kontrol (NC) prøver
   1. Tilføj 0.14 ul 5 mM BODIPY-Fl-L-cystin til 49.86 pi 4% glycerol, 25 mM Tris (pH 6,5) i brønden af ​​en 384-mikrotiterplade. Bland ved pipettering.
3. Overtrykslakker PC og NC-løsninger
   1. Overprinte alderen microarrays følgende trin 5,1-5,10 (ignorerer trin 5.6) i protokollen. Brug slidsede kappe stifter af 235 uM diameter til at deponere PC og NC overprint løsninger. Dette sikrer løsningen dækker de tidligere deponerede stedet helt.
   2. Alder arrays på 80-90% fugtighed i 1 time ved stuetemperatur. På grund af autohydrolysis af atch kan længere inkubationstider resultere i falske positiver eller øges daZyme aktivitet.

7.. Kinaseaktivitet Assay

1. Forbered 500 pM adenosin-5'-triphosphat (ATP) opløsning med lager ATP (100 mM), opbevaret ved -20 ° C. Lave frisk løsning for hver eksperimentere og justere lydstyrken til eksperimentel behov: hver udskrivning løsning kræver 5 pi.
2. Forbered en 100 mM magnesiumchlorid _{(MgCl2: Mr} 95.21 g / mol) stamopløsning i Hedeselskabet ₂ O.
3. Positive kontrol (PC)
   1. Tilsæt 2,5 ul 100 mM _MgCl2 og 5 gl 500 pM ATP til brønden af en 384-mikrotiterplade.
   2. Bring det samlede brøndvolumen til 50 ul med 50 mM HEPES (pH 7,4) og blandes ved pipettering. Potentielle enzymhæmmere kan inkorporeres i pc-løsning, før at bringe lydstyrken til 50 pi med buffer.
4. Negativ kontrol (NC)
   1. Tilsæt 2,5 ul 100 mM _MgCl2 og 5 pi _ddH2O til brønden i en 384-microtiter plade.
   2. Bring det samlede brøndvolumen til 50 ul med 50 mM HEPES (pH 7,4) og blandes ved pipettering.
5. Overtrykslakker PC og NC assay cofaktorer
   1. Følg trin 6.3.1 i protokollen.
   2. Alder arrays på 80-90% fugtighed i 2 timer ved stuetemperatur.
6. Slide farvning
   1. Place udskrevet microarray glider enkeltvis på en petriskål med nok farvestof (fra kit) til at dække hele dias. Ryst moderat (~ 200 rpm) i 45 min ved anvendelse af en pladeryster.
   2. Fjern slide ved hjælp af pincet og anbringes i en ren petriskål med vaskebuffer (fra kit). Ryst moderat (~ 200 rpm) i 45 min ved anvendelse af en pladeryster.
   3. Fjern slide ved hjælp af pincet og spin tørt med en konventionel desktop microarray mikrocentrifuge udstyret med en slide holder.

8.. Microarray Imaging and Analysis

1. Imaging

   Bemærk, at den billeddannende metode vil være sPECIFIKKE til den type matrix læser tilgængelige. Til disse undersøgelser udstyret en Alpha Innotech NovaRay imager med en hvid lyskilde og CCD detektion system med en 478 ± 17 nm excitation og 538 ± 21 nm emission filter for AChE microarrays, og 530 ± 40 nm excitation og 614 ± 62 nm emission filtrere for kinase microarrays blev anvendt. Konfokale laserscanning systemer kan også anvendes til aflæsning af arrays, selvom indstillingerne vil være specifikke for instrumentet.

   1. Placer slide i diasholderen med pletter opad.
   2. Angiv antallet af preview-sektioner (minimum 2 anbefales, en på hver ende af objektglasset), opløsning (minimum 4 um anbefales) og eksponering (auto anbefales) inden for imaging software.
   3. Anskaf slide billede og gemme som en ". Tiff" fil.
2. Analyse
   1. Åbn erhvervet slide billede i ImageJ64.
   2. Klik på det ovale markeringsværktøj og målesignalere intensitet hver plet ved hjælp af foranstaltningen under punktet analysere fanen. Når du vælger området for at måle, skal du vælge et område lidt større end den observerede stedet og af ensartet størrelse blandt spots at reducere ImageJ subjektivitet.
   3. Gennemsnitlig intensiteten fra 25 lignende PC pletter, divideret med den gennemsnitlige intensitet af 25 lignende NC spots for at få PC / NC nøgletal for de enkelte materialesammensætninger.

Representative Results

Ved at udføre en guidet faktoranalyse for materialet skærmen, var vi i stand til at minimere antallet af materialer testet fra ~ 20.000 til et par hundrede, der havde geleringsproblemer gange er velegnede til udskrivning. Ved at anvende en streng retningslinje kræver materiale Geleringstiden på 2,5 hr eller større, blev materialer, der kan tilstoppe udskrivning stifter eller producerer reproducerbare arrays udskrives aldrig. De printbare materialer er identificeret at have tilstrækkelige (> 2,5 t) geleringsproblemer tider blev trykt på 4 forskellige funktionaliserede objektglas overflader. For at blive betragtet som "udskrives", havde det maksimale antal spots pr optagelse volumen pin der skal udskrives (SMP3 = 200). Spots blev også vurderet for spot morfologi for at sikre ingen revnedannelse eller uønsket faseadskillelse havde fundet sted ved hjælp af simple brightfield mikroskopi, som vist i figur 2..

Fra dette tidspunkt af identificerede printbare materialer blev microarrays produceret med AChE ogkinaser inkorporeres i den bufrede vandige komponent. Materialer, der var kompatible med analysen procedure (herunder potentielle overprinting og vask eller farvning trin) blev identificeret ved at observere tilbageholdelse af microarray spots (krakeleringer, tab af pletter eller usædvanlige fluorescens mønstre) og en positiv kontrol (PC) til den negative kontrol (NC ) forhold større end 1, som observeret gennem billedet. Som det var omkring 50% af de materialer, en større PC / NC forholdet 3 blev anvendt til at definere optimale materialer med bibeholdelse af protein-aktivitet. Gennem denne metode, viser 26 sol-gel afledte materialer, der indeholder smerte og 2 materialer, der indeholder kinaser opfyldte> 3 PC / NC kriterier. Figur 3 og 4 en grafisk oversigt over de 5 guidede materiale skærmen trin for identifikation af optimal AChE og kinase microarrays, hhv.

Analyserne kan også valideres ved produktion af en Z 'score. ^17. Figur 5 viser Z 'plot opnået ved sammenligning af signalet genereret fra 200 spots, 100 PC og 100 NC efter overprint indikatorfarvestoffet og substrat på AChE array. De AChE og kinase arrays resulterede i de respektive Z 'snesevis af 0,60 og 0,67, hvilket indikerer en fremragende analyse. Dog skal det bemærkes, at før analyse validering, på array-enzym, et farvestof, substrat og cofaktor koncentrationer skulle optimeres ved overprint en række koncentrationer af hver komponent og vælge den koncentration, der producerede det højeste signal, som beskrevet detaljeret andetsteds . ^5.

At validere assays blev kvantitative hæmning data opnået under anvendelse af kendte og ukendte AChE-inhibitorer, med resultater udført in duplo og anvendes til at producere dublerede jordlodder (figur 6A) og inhibering kurver (figur 6B og 6C). <strong> Spots blev først påtrykt blandinger af kendte biologisk aktive små molekyler inhibitorer derefter med farvestof og substrat, og kontrolsystemer blandinger, der indeholder enten kendte hæmmere eller ingen inhibitor blev inkluderet. Duplicate parceller blev genereret at vurdere enzymaktivitet, og eventuelle blandinger, der resulterede i mindre end 25% enzymaktivitet blev betragtet som positive for hæmning. Individuelle forbindelser fra sådanne blandinger blev derefter testet in duplo at identificere de specifikke lille molekyle (r) ansvarlig for hæmning. Når identificeret, disse små molekyler blev anvendt til at generere kvantitative inhiberingskurver at bestemme _{IC50-værdier} og inhiberingskonstanter.

Tilsvarende kvalitative resultater blev opnået ved anvendelse af multikinasehæmmer array med en fælles kinaseinhibitor, staurosporin. Figur 7A og 7B viser microarray billede og viser, at signalintensiteter efter overprint og farvning af multikinasehæmmermatrix er som forventet for en negativ kontrol (- ATP), positiv kontrol (+ ATP) og kendt inhibitor (+ ATP + indb.). At demonstrere evnen til at opnå kvantitative hæmning data fra microarrays, blev en koncentrationsafhængig hæmning assay udført for en enkelt kinase. Som vist i figur 8A og 8B, signalintensitet aftager som inhibitorkoncentration stiger, og reaktionen følger den forventede koncentration afhængig inhiberingskurve for p38α/MBP kinase / substrat-system.

Figur 1. Generel skematisk for guidet materialer screening tilgang. Hver blok repræsenterer et skridt på skærmen i rækkefølge. Numre til venstre repræsenterer det totale antal af materialer fremstillet til analyse. Ved hjælp af en gelering tidsrum større end 2,5 timer (materialer med geleringsproblemer gange mindre end 2,5 timer are angivet af overstreget) er antallet af materialer, der passerede hver fase og fremføres under den materielle skærmen angivet ved tallet til højre. * Repræsenterer materialer med mindre end optimal faseseparation.

Figur 2. Optiske billeder viser forskellige fejltilstande af materialer på trykbarheden trin på skærmen. Et billede af en "god" materiale (anden række, tredje kolonne) er også vist til sammenligning. Genoptrykt med tilladelse fra henvisningen ^8, copyright 2013 American Chemical Society.

Figur 3. En rettet materiale screening tilgang til identifikation af optimale materialer til fabrikere sol-gel-afledte AChE microarrays. Genoptrykt med permission fra henvisningen ^5, copyright 2013 American Chemical Society.

Figur 4.. En rettet materialer screening tilgang til identifikation af optimale materialer til fabrikere sol-gel-afledte kinase microarrays. Genoptrykt med tilladelse fra henvisningen ^8, copyright 2013 American Chemical Society.

Figur 5. (A) En del af AChE microarray viser HC (lys grøn) og LC (lys grøn) pletter (en sort-grøn palet blev anvendt pseudo for klarhed præsentation), (B) en forstørret visning af indrammede område at fremhæve spot morfologi og tilpasning;. og (C) en Z 'plot Streger angiver middelværdien af replikater, mens stiplede linier svarer til 3SD. Genoptrykt med tilladelse fra henvisning ^5, copyright 2013 American Chemical Society.

Figur 6.. (A) Duplicate plot for den array screening af syntetiske analoger af Amaryllidaceae alkaloider, (B) _IC50 parceller identificerede potentielle inhibitorer markeret som forbindelserne 1 og (C) forbindelse 2, med fejlsøjler repræsenterer en standardafvigelse af middelværdien fra 25 replikater. Repræsentative pletter er vist for at illustrere forskellene i signal proportionalt inhibitorkoncentrationer. Genoptrykt med tilladelse fra henvisning ^5, copyright 2013 American Chemical Society. Klik her for at se større figur .

nt "fo: keep-together.within-page =" altid ">
Figur 7. On-matrix analyse af fire kinaser hjælp 1.4SS/1.0PVA til indfangning og trykt på en amin-derivatiseret slide. (A) Et billede af en sektion af microarray hvor pletter med kinaser co-indesluttet med deres respektive substrater blev overtrykt med puffer (NC, øverste række) eller opløsninger, der indeholder ATP (PC, midterste række), eller ATP + staurosporin (nederste række). (B) søjlediagrammer, som sammenligner signalintensiteter mellem hæmmet og uhæmmede reaktioner, efter fradrag af baggrundssignaler og fejl barer repræsenterer en standardafvigelse af middelværdien fra 25 gentagelser. Genoptrykt med tilladelse fra henvisningen ^8, copyright 2013 American Chemical Society.

Figur 8. Inhibiti. på assay på en p38a/MBP microarray (A) Afsnit af microarrays viser repræsentative pletter overspotted med varierende koncentrationer af staurosporin, som anført (billeder blev opnået ved en enkelt scanning af den samme slide, sammensat billede er vist for klarhed). (B) _IC50 kurve genereret fra de analyserede Array billeder. Intensiteten opnået ved 100 mM blev trukket fra alle billeder, alle andre intensiteter blev normaliseret ved at indstille intensiteten opnået ved 10 nM til en værdi på 100% aktivitet. Genoptrykt med tilladelse fra henvisningen ^8, copyright 2013 American Chemical Society.

Figur 9. Billeder af mikroskopiske stealth pin bruges til kontakt pin-udskrivning viser forskellige ufuldkommenheder: (A) tilstoppet, (B) bøjet.

Discussion

Metodikken beskrevet her blev valgt som den mest egnede til identifikation printable sol-gel afledte materialer med en kontakt printer, der producerer en tid-og omkostningseffektiv procedure til hurtig identifikation optimale materialer uden at screene store antal materialer. Fra i alt ~ 20.000 potentielle materialer, var det muligt at identificere ~ 200 materialer, der var egnet til udskrivning på grundlag af gelering tid alene. Det gør det væsentligt reduceret antallet af nødvendige materialer til at være forberedt på efterfølgende udskrivning forsøg. Disse printbare materialer blev derefter trykt på 4 glideflader for i alt 768 materiale-slide kombinationer. I gennemsnit kan 50 pletter / gentagelser af ét materiale blive trykt i ~ 3 min, herunder prøve lastning, spot deposition og pin rengøring. Af dem, tillod 155 materialer, eller omkring 20%, til udskrivning af det maksimale antal af pletter pr opløsning optagelse og produceret reproducerbare pletstørrelser. Det skal bemærkes, at af de 4 slide overflader testet materialer trykt bedre i rækkefølge: amin> epoxy> aldehyd> PMMA, PMMA slides ikke frembringe nyttige arrays til alle materialer. Dette var sandsynligvis tilskrives polariteten af ​​overfladebelægningen. Sammenligne de førnævnte glideflader, blev den mere polære amin og epoxy bedre egnet til de vandige sole forhold til PMMA dias. Endvidere af de testede overflader, giver amin coatede objektglas en potentiel positivt ladet overflade for den indskudte anioniske sol til binding. Vi formoder, at silica nanopartikler ved grænsefladen mellem slæden og sol interagere langs overfladen. Både epoxy og aldehyd glideflader mangler den samme oprindelige ladning-interaktion. For at sikre optimal spot deposition er det stærkt anbefales at bruge pre-coatede objektglas fra en leverandør som Arrayit. In-house coating producerer inkonsistente overflader, der fører til dårlig spot reproducerbarhed ^13, og i nogle tilfælde kan føre til kvantificering probblemer. ^18. Af lige så stor betydning, temperatur og fugtighed påvirker "trykbarhed" af materialerne. Selv om der ikke detaljerede undersøgelser af virkningerne relateret til temperatur blev udført, blev trykning altid udføres ved stuetemperatur (23 ± 3 ° C). Luftfugtighed (over 80%) blev også kontrolleret inden print kammeret for at forhindre uregelmæssig form aflejring på grund af små deposition volumener (0,7-2,3 nl) og fordampning.

Mens materialet skærmen blev styret til at identificere optimale sol-gel afledte materialer specielt til udskrivning af AChE og kinaser, et lille sæt af materialer blev identificeret, som arbejdede for begge typer af proteiner. Faktisk var begge af de materialer, der blev identificeret for kinase microarray fabrikation baseret på SS + PVA + glycerol, og begge materialer blev også identificeret inden for de 26 udvalgte materialer for AChE microarrays. Disse "optimale" materialer kan tilbyde en generisk udgangspunkt for at udvikle yderligere protei-doterede sol-gel-baserede microarrays, og små skærme centreret omkring disse sammensætninger kan identificere endnu bedre materialer til microarray fabrikation. Et andet punkt at bemærke er betydningen af ​​det anvendte enzym. I tilfælde af AChE (en temmelig robust enzym), beholdt 26 (eller omtrent 40%) af de oprindelige 66 materialer identificeret som assay-kompatibelt aktivitet indesluttet AChE. Men for de mere sarte kinaser, var kun 2 af de 69-assay-kompatible præparater, eller omkring 3% af de materialer, i stand til at bevare aktiviteten af ​​alle kinaser. Mens tilstrækkeligt antal forskellige enzymer ikke er blevet undersøgt for at gøre endegyldige udsagn, fremgår det, at optimering matrix fabrikation med relativt ustabile enzymer kan føre til identifikation af materialer, der kan vikle en bred vifte af proteiner til at tillade mutliplexed microarray fabrikation.

Uafhængigt af den valgte protein, de store cut-off faktor til identifikation printbare materialer var behovet for en langmateriale geleringsproblemer gange (> 2,5 timer). Ved udviklingen SS baserede sol-gel materialer, er det meget vigtigt at sikre, at der efter ionbytning og filtrering, solen er på omkring pH 4. Soler med en lavere pH-værdi kan resultere i materialer med en lavere-end-neutralt pH, hvilket kan påvirke enzymaktivitet. ^19. justere mængden af Dowex (ionbytterharpiks) til SS kan ændre det endelige pH af solen. Når en ny batch af harpiks fremstilles forholdet mellem harpiks SS skal justeres således at producere soler på omkring pH 4 efter proceduren i punkt 2 i protokollen.

Tilsvarende fremstillingen af ​​krystallinske DGS er ofte en kilde til fejl i forbindelse med materiale svigt ved anvendelse DGS baserede soler til biomolekyle indfangning. Selvom det ikke er rapporteret her i detaljer, stor omhu skal tages under syntesen af ​​krystallinske DGS, især behovet for at undgå tilstedeværelsen af ​​vand i løbet af syntesen, der kan producere polyglycerated silicates snarere end monomere DGS. Også på grund af den hygroskopiske natur af DGS, den krystallinske prøve skal lagres udtørret og anvendes inden for 6 måneder efter syntese. Krystallinske DGS ældre end 6 måneder, kan ikke opløses fuldstændigt (på grund af delvis kondenseret polyglyceryl silikat materiale) selv med lydbehandling i et surt miljø. Ufuldstændig DGS opløsning producerer soler med ukendte og ukontrollerbare indhold af silica og dermed mindre robuste materialer.

Et vigtigt punkt at bemærke med kontakt udskrivning er kvaliteten af ​​ben. Beskadigede eller fejlhåndtering stifter (figur 9), vil aldrig give reproducerbare arrays uafhængigt af det materiale, der udskrives. Det anbefales at kontrollere pin kvalitet ved hjælp af en dissektion mikroskop for at sikre knuste eller tilstoppede ben er ikke brugt. Omhyggelig håndtering sikrer lang levetid for stifterne. Fri bevægelighed for stiften er også vigtig. I de tilfælde, hvor fugt er fanget i printhovedet mellem hovedet og pin, stiftenvil ikke sæde korrekt og vil således ikke gøre korrekt kontakt med overfladen, hvilket resulterer i en mangel på aflejring af materiale.

Afslutningsvis har vi givet et detaljeret, flertrins screening tilgang til udvikling af high-density protein doterede pin-trykte microarrays. Screeningen omfatter optimering af materialeegenskaber (gelering tid og trykbarhed) for at tillade trykning af materialer, efterfulgt af mere fokuseret screening til at identificere materialer, der er kompatible med en given assay og i stand til at bevare enzymaktivitet. Denne guidede materiale screening tilgang kan anvendes til yderligere microarray-formater for at reducere tid og omkostninger forbundet med at producere effektive high-density microarrays.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
			Reagent/Material
Poly(vinyl alcohol) (PVA)	Sigma-Alderich	360627	80% hydrolozyed, Mw 600
Polyethylene glycol 600 (PEG)	Sigma-Alderich	87333
Polyethylenimine (PEI)	Sigma-Alderich	482595	50 wt% solution in water
Carboxyethylsilanetriol (Si-COOH)	Gelest, Inc.	SIC2263.0	25% in water
N-(3-triethoxysilylpropyl) gluconamide(GLS)	Gelest, Inc.	SIT8189.0	50% in ethanol
bis[(3-methyldimethoxysilyl)propyl]polypropylene oxide (MDSPPO)	Gelest, Inc.	SIB1660.0
Methyltrimethoxysilane (MTMS)	Gelest, Inc.	SIM6560.1
Bis(triethoxysiyly)ethane (Bis-TEOS)	Gelest, Inc.	SIB1817.0
3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES)	Gelest, Inc.	SIA0610.0
Glycerol	Sigma-Alderich	49767
D-Sorbitol	Sigma-Alderich	240850
D-(+)-Trehalose dihydrate	Sigma-Alderich	T9531
Triton X-100	Sigma-Alderich	X-100
Nε-Acetyl-L-lysine	Sigma-Alderich	A4021
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Sigma-Alderich	154563
HEPES	Sigma-Alderich	H3375
Sodium hydroxide, 1.0 N	LabChem Inc.	LC24350-2
Hydrochloric Acid, 1.0 N/0.1 N	LabChem Inc.	LC15300-2/LC152220-2
Magnesium chloride	Sigma-Alderich	M8266
Diglycerolsilane (DGS)			Prepared in laboratory
Sodium silicate solution	Fisher Scientific	SS338-1
Dowex 50WX8-100 ion exchance resin	Sigma-Alderich	217492
Acetylthiocholine iodide	Sigma-Alderich	1480
Acetylcholinesterase from Electrophorus electricus (electric eel)	Sigma-Alderich	C2888
BODIPY FL L-Cystine	Invitrogen	B-20340
Pro-Q Diamond Phosphoprotein/Phosphopeptide Microarray Stain Kit	Invitrogen	P33706
Adenosine 5'triphosphate disodium salt (ATP) solution	Sigma-Alderich	A6559
MAP Kinase 2 (MAPK2)	EMD Millipore	454850
p38α/SAPK2a (T106M), active	EMD Millipore	14-687M
Epidermal growth factor (EGFR)	EMD Millipore		Donated by Millipore
Glycogen synthase kinase 3β (GSK-3β)	EMD Millipore	14-306
Myelin basic protein (MBP)	EMD Millipore		Substrate for MAPK2 and p38α, Donated by Millipore
GSM	EMD Millipore	12-533	Substrate for GSK-3β
Poly-glu-tyr polypeptide p(E4Y)	EMD Millipore	12-440	Substrate for EGFR
Stealth pin	ArrayIt	SMP3
Stealth pin	ArrayIt	SMP7
Amine coated slides	ArrayIt	SMM2
Aldehyde coated slides	ArrayIt	SMA2
Exposy coated slides	ArrayIt	SME2
Poly(methylmethacrylate) (PMMA) coated slides	Exakt Technologies Inc.	41500
0.2-μm syringe filter	PALL Life Sciences	4612
			Equipment
Virtek Contact Printer	BioRad
Novaray Fluorescence Slide Imager	Alpha Innotech Corporation
Desktop microarray centrifuge	ArrayIt	MHC110V
MilliQ Synthesis A10	Millipore		Used to filter all water required for experiments