Een begeleide materiaal screening benadering van sol-gel afkomstig eiwit gedoteerde microarrays met behulp van een opkomende methode pin-drukken van fabricage ontwikkeling wordt beschreven. Deze methode wordt aangetoond door de ontwikkeling van acetylcholinesterase en multikinaseremmer microarrays, die voor rendabele kleine moleculen screening.
Microarrays zijn gebruik in de ontwikkeling van high-throughput assays voor nieuwe materialen en werden kleine-molecule drug leads. Hierin beschrijven we een geleide materiaal screening aanpak sol-gel gebaseerde materialen die geschikt zijn voor het produceren driedimensionale eiwit microarrays te identificeren. De eerste benadering identificeert materialen die kunnen worden afgedrukt microarrays, versmalt het aantal materialen die momenten die compatibel zijn met een bepaald enzym assay en vervolgens slijpstenen in op optimale materialen gebaseerd op behoud van maximale enzymactiviteit. Deze benadering wordt toegepast op microarrays voor twee verschillende enzymanalyses, een met acetylcholinesterase en de andere met behulp van een set van vier kinasen betrokken bij kanker. In ieder geval was het mogelijk om microarrays die kunnen worden gebruikt voor de kwantitatieve kleine-molecule screening assays en productie van dosis-afhankelijke remmer responscurves produceren. Belangrijk is de mogelijkheid om veel mate screenenrials geproduceerde informatie over de soorten materialen die het meest geschikt zowel microarray productie en retentie van enzymactiviteit. De materialen gegevens geven inzicht in basismateriaal eisen die nodig zijn voor het op maat optimaal, high-density sol-gel afgeleid microarrays.
Microarrays zijn populariteit binnen de wetenschappelijke gemeenschap verworven als een methode voor het verhogen van test throughput. Sinds de ontwikkeling van microarray technologie om genexpressie 1 beoordelen in het midden van de jaren 1990, hebben microarrays gebruikt in de ontwikkeling van high-throughput assays om eiwit-eiwit en eiwit-klein molecuul interacties te identificeren en om nieuwe materialen te vinden met unieke eigenschappen. 2-5 Recenter microarrays zijn ontwikkeld waarbij specifieke materialen worden gebruikt om functionele eiwitten te immobiliseren, waardoor een driedimensionale microarray element waarin eiwitten worden ingesloten, waardoor gemakkelijke meting van enzymatische activiteit en remming van de microarray zelf met een geschikt fluorescentie test die is gekoppeld substraat omzet. 5-10 Belangrijk is dat dergelijke microarrays zijn ontworpen om alle noodzakelijke componenten voor het screenen monsters en controles samen omvatten in een zeer parallel mode. 5,8 </ P>
Vroege voorbeelden van eiwit microarrays werden meestal bereid met behulp van standaard methoden voor eiwitimmobilisatie op vaste dragers, zoals covalente binding, 11 affiniteit vastleggen 3 en fysische adsorptie. 12 Hoewel deze methoden van bio-immobilisatie zorgen voor verhoogde monsterconcentratie en versnelde reactiekinetiek nodig voor assay miniaturisatie, zij elk lijden nadelen. Meer algemeen houdt verlagen het natieve biomolecuul functionaliteit wegens chemische modificatie van het oppervlak, gehinderde toegang tot actieve plaatsen of onjuiste oriëntatie door niet-specifieke immobilisatie. Derhalve zijn alle werkwijzen resulteren in lagere testgevoeligheid ondanks een toename biomolecuul depositie, een reactie die waarschijnlijk ontstaat door de noodzaak om kunstmatig biomoleculen binden aan een oppervlak.
Een nieuwe benadering voor de productie van functionele biomolecule microarrays is via pin-drukken van eiwit-gedoteerdesilica sols op vaste dragers, die typisch ofwel gefunctionaliseerde glasplaatjes of individuele putjes van platen met microputjes. De sol-gel-werkwijze zelf gebeurt in een waterige omgeving bij kamertemperatuur, en het is de vloeibare precursor die wordt afgedrukt en gels te vangen biomoleculen in de 3D-matrix, waardoor eiwitrijke laden 13 en insluiten van meerdere componenten binnen dezelfde microarray element. 13,14 Afstemming van de sol-gel afgeleide materiaal kan door zorgvuldige selectie van verschillende silica precursoren, en door het veranderen van de waterige component door het gebruik van verschillende buffers (pH, ionsterkte) en opname van verschillende toevoegsels (polymeren, kleine moleculen) een optimale materiaal bereiken, de specifieke aard afhangt van de biologische molecule die wordt ingesloten. 10
Een mogelijke beperking in verband met de ontwikkeling van sol-gel afkomstig eiwit microarrays via pin-afdrukken isde noodzaak om sol-gel composietmaterialen kunnen worden afgedrukt zonder gelering in de pen of met ongewenste eigenschappen (reproduceerbaar spotgroottes, barsten, slechte hechting, onverenigbaarheid met testcomponenten, slechte eiwitactiviteit) eenmaal afgedrukt op een oppervlak bepalen. 5 Gelijktijdige optimalisering van al deze parameters sluit aanpak waarbij materialen worden ontworpen novo of langzaam op seriële wijze onderzocht. Anderzijds, steekproeven van vele duizenden of tienduizenden materialen noch tijd niet kosteneffectief.
In dit artikel beschrijven we een gerichte screening aanpak die snelle identificatie van geschikte materialen kunnen voor de productie van eiwit-microarrays zonder willekeurig screenen van grote aantallen materialen. Met een geleide benadering worden die geschikt zijn voor microarray druk eerst geïdentificeerd, gevolgd door een reeks van kleine schermen identificeren optimale sol-gel afgeleide materialenal combinaties die kunnen reproduceerbaar worden afgedrukt, zonder barsten en verenigbaar zijn met een gegeven test. Tenslotte worden optimale materiaal geïdentificeerd op basis van retentie van enzymactiviteit en prestaties in een laatste kleine-molecule screeningstest. Op deze wijze kan een optimale materialen worden geïdentificeerd uit vele duizenden kandidaten met slechts enkele honderden assaystappen. We demonstreren deze benadering voor de productie van zowel high-density acetylcholinesterase en multikinaseremmer microarrays en het gebruik van dergelijke microarrays voor kleine molecule screening.
De hier beschreven methode werd gekozen als het meest geschikt voor het identificeren printable sol-gel afgeleide materialen met een contact printer, waardoor een tijd-en kosten-effectieve procedure voor het snel identificeren van optimale materialen zonder grote hoeveelheden materialen te screenen. Uit een totaal van ~ 20.000 mogelijke materialen, het mogelijk was ~ 200 materialen die geschikt zijn voor afdrukken op basis van geleringstijd alleen waren identificeren. Dit het aantal materialen moeten worden voorbereid vervolgens printen proeven aanzienlijk verminderd. Deze bedrukbare materialen werden vervolgens op 4 dia oppervlakken voor een totaal van 768 materiaal-slide combinaties afgedrukt. Gemiddeld kan 50 vlekken / replica van een materiaal worden gedrukt in ca. 3 min., inclusief sample laden, spot depositie en pin reiniging. Van deze 155 materiaal, ongeveer 20%, toegestaan voor het drukken het maximum aantal vlekken per opname oplossing en geproduceerd reproduceerbaar vlekgroottes. Opgemerkt wordt dat de 4 slide oppervlakken getest, materialen beter afgedrukt in de volgorde: amine> epoxy> aldehyde> PMMA; PMMA dia's leverden geen bruikbare arrays voor alle materialen. Dit is waarschijnlijk toe te schrijven aan de polariteit van de oppervlaktelaag. Vergelijking van de bovengenoemde glijvlakken zijn de meer polaire amine en epoxy beter geschikt voor de sols in vergelijking met de PMMA dia. Verder van de geteste oppervlakken de amine gecoate glaasjes een potentieel positief geladen oppervlak voor het ingebrachte anionische sol te binden. We vermoeden, het silicium nanodeeltjes op het raakvlak tussen de glijbaan en de sol interactie langs het oppervlak. Zowel de epoxy en de aldehyde glijvlakken missen dezelfde initiële kosten gebaseerde interactie. Om een optimale plek depositie verzekeren is het sterk aanbevolen om pre-gecoate glaasjes gebruiken van een leverancier, zoals Arrayit. In-house coating produceert inconsistent oppervlakken die leiden tot slechte reproduceerbaarheid spot 13 en, in sommige gevallen, kan leiden tot problemen kwantificeringblemen. 18 Van even groot belang, temperatuur en vochtigheid van invloed op de "bedrukbaarheid" van de materialen. Hoewel er geen gedetailleerde studies over de effecten die verband houden met temperatuur werden uitgevoerd, werd afdrukken altijd uitgevoerd bij kamertemperatuur (23 ± 3 ° C). Vochtigheid (meer dan 80%) werd gecontroleerd binnen de afdruk kamer om onregelmatige vorm depositie door de kleine hoeveelheden afzetting (0,7-2,3 nl) en verdamping te voorkomen.
Terwijl het materiaal scherm werd geleid naar het identificeren optimale sol-gel afgeleide materialen speciaal voor het afdrukken van AChE en kinasen, een klein aantal materialen geïdentificeerd die werkte voor beide eiwitten. Inderdaad, zowel van de materialen die werden geïdentificeerd kinase microarray fabricage waren gebaseerd op PVA SS + + glycerol en beide materialen werden geïdentificeerd in de 26 materialen geselecteerd AChE microarrays. Deze "optimale" materialen kan een generieke uitgangspunt bieden voor de verdere ontwikkeling van protein gedoteerde sol-gel gebaseerde microarrays en kleine schermen rond deze samenstellingen kunnen identificeren nog betere materialen voor microarray fabricage. Een tweede punt om op te merken is het belang van het gebruikte enzym. Bij AChE (nogal robuust enzym), 26 (of ongeveer 40%) van de oorspronkelijke 66 materialen geïdentificeerd als assay-compatibele behield de activiteit van AChE ingesloten. Voor de meer delicate kinasen, slechts 2 van de 69 assay-compatibele samenstellingen, of ruwweg 3% van het materiaal, konden de activiteit van kinasen behouden. Terwijl voldoende aantallen van verschillende enzymen zijn niet onderzocht om definitieve uitspraken te doen, lijkt het erop dat het optimaliseren scala van constructies met relatief onstabiel enzymen kan leiden tot de identificatie van materialen die een breed scala aan eiwitten te mutliplexed microarray fabricage mogelijk kunnen vangen.
Ongeacht de gekozen eiwit, grote cut-off factor voor het identificeren bedrukbare materiaal was behoefte aan een langemateriaal geleringstijden (> 2,5 uur). Bij het ontwikkelen SS based sol-gel materiaal, is het zeer belangrijk dat, na ionenuitwisseling en filtratie werd het sol is bij ongeveer pH 4. Sols met een lagere initiële pH kan resulteren in materialen met een lager dan neutrale pH hebben een negatieve invloed enzymactiviteit. 19 Afstellen hoeveelheid Dowex (ionenwisselaar) SS kan de uiteindelijke pH van de sol te wijzigen. Wanneer een nieuwe partij van de hars is bereid de verhouding van hars tot SS dient te worden aangepast aan sols produceren bij een pH van ongeveer 4 volgens de procedure van punt 2 van het protocol.
Ook de bereiding van kristallijn DGS is vaak een bron van fouten in verband met materiaal falen bij gebruik van DGS sols voor het biomolecuul beknelling. Hoewel hier niet in detail gerapporteerd, moet grote zorg tijdens de synthese van kristallijne DGS, met name de noodzaak de aanwezigheid van water tijdens de synthese voorkomen dat polyglycerated silica produceren wordentes eerder dan monomere DGS. Ook, vanwege de hygroscopische aard van DGS het kristallijne monster moet bewaard worden gedroogd en binnen 6 maanden na synthese. Kristallijne DGS ouder dan 6 maanden mogen niet volledig oplossen (als gevolg van gedeeltelijk gecondenseerde polyglyceryl silicaat), zelfs met sonicatie in een zure omgeving. Onvolledige DGS ontbinding produceert solen met onbekende en oncontroleerbare silica inhoud en dus, minder robuuste materialen.
Een belangrijk punt om op te merken met de contactpersoon afdrukken is de kwaliteit van de pennen. Beschadigde of onjuiste behandeling kunnen (figuur 9) zal nooit tot reproduceerbare arrays onafhankelijk van het materiaal dat wordt afgedrukt. Het wordt aanbevolen om pin kwaliteit te controleren met behulp van een dissectie microscoop om ervoor te zorgen kapot of verstopt pinnen worden niet gebruikt. Zorgvuldige behandeling verzekert een lange levensduur voor het pinnen. Vrij verkeer van de pen is ook belangrijk. Wanneer vocht wordt opgesloten in de printkop tussen de kop en de pen, de penzal niet stoel correct en zal dus goed contact maken met het oppervlak, wat resulteert in een onvoldoende afzetting van materiaal.
Tot slot hebben we een gedetailleerd uit meerdere screening aanpak voor het ontwikkelen van high-density eiwit gedoteerde pin-gedrukte microarrays. De screening vereist optimalisering van materiaaleigenschappen (geleertijd en bedrukbaarheid) om afdrukken van materialen, gevolgd door meer gerichte screening materialen die compatibel zijn met een gegeven test en kunnen enzymactiviteit behouden te identificeren. Deze geleide materiaal screening aanpak kan worden toegepast om extra microarray formaten om tijd en kosten van een productie efficiënte high-density microarrays verminderen.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs danken Maria Monton, Julie Lebert, Jessamyn Little, Xin Ge en Laura Lautens voor hulp bij de ontwikkeling van eiwit-microarrays. De auteurs van de Natuurwetenschappen en Engineering Research Council of Canada (NSERC) dank ook voor de financiering van deze werkzaamheden. De auteurs ook de Canada Foundation bedanken voor Innovatie en de Ontario Innovation Trust voor ondersteuning van dit werk. JDB houdt de Canada Research Chair in Bioanalytisch Chemie en Biointerfaces.
Reagent/Material | |||
Poly(vinyl alcohol) (PVA) | Sigma-Alderich | 360627 | 80% hydrolozyed, Mw 600 |
Polyethylene glycol 600 (PEG) | Sigma-Alderich | 87333 | |
Polyethylenimine (PEI) | Sigma-Alderich | 482595 | 50% (w/w) solution in water |
Carboxyethylsilanetriol (Si-COOH) | Gelest, Inc. | SIC2263.0 | 25% in water |
N-(3-triethoxysilylpropyl) gluconamide(GLS) | Gelest, Inc. | SIT8189.0 | 50% in ethanol |
bis[(3-methyldimethoxysilyl)propyl]polypropylene oxide (MDSPPO) | Gelest, Inc. | SIB1660.0 | |
Methyltrimethoxysilane (MTMS) | Gelest, Inc. | SIM6560.1 | |
Bis(triethoxysiyly)ethane (Bis-TEOS) | Gelest, Inc. | SIB1817.0 | |
3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES) | Gelest, Inc. | SIA0610.0 | |
Glycerol | Sigma-Alderich | 49767 | |
D-Sorbitol | Sigma-Alderich | 240850 | |
D-(+)-Trehalose dihydrate | Sigma-Alderich | T9531 | |
Triton X-100 | Sigma-Alderich | X-100 | |
Nε-Acetyl-L-lysine | Sigma-Alderich | A4021 | |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Alderich | 154563 | |
HEPES | Sigma-Alderich | H3375 | |
Sodium hydroxide, 1.0 N | LabChem Inc. | LC24350-2 | |
Hydrochloric Acid, 1.0 N/0.1 N | LabChem Inc. | LC15300-2/LC152220-2 | |
Magnesium chloride | Sigma-Alderich | M8266 | |
Diglycerolsilane (DGS) | Prepared in laboratory | ||
Sodium silicate solution | Fisher Scientific | SS338-1 | |
Dowex 50WX8-100 ion exchance resin | Sigma-Alderich | 217492 | |
Acetylthiocholine iodide | Sigma-Alderich | 1480 | |
Acetylcholinesterase from Electrophorus electricus (electric eel) | Sigma-Alderich | C2888 | |
BODIPY FL L-Cystine | Invitrogen | B-20340 | |
Pro-Q Diamond Phosphoprotein/Phosphopeptide Microarray Stain Kit | Invitrogen | P33706 | |
Adenosine 5'triphosphate disodium salt (ATP) solution | Sigma-Alderich | A6559 | |
MAP Kinase 2 (MAPK2) | EMD Millipore | 454850 | |
p38α/SAPK2a (T106M), active | EMD Millipore | 14-687M | |
Epidermal growth factor (EGFR) | EMD Millipore | Donated by Millipore | |
Glycogen synthase kinase 3β (GSK-3β) | EMD Millipore | 14-306 | |
Myelin basic protein (MBP) | EMD Millipore | Substrate for MAPK2 and p38α, Donated by Millipore | |
GSM | EMD Millipore | 12-533 | Substrate for GSK-3β |
Poly-glu-tyr polypeptide p(E4Y) | EMD Millipore | 12-440 | Substrate for EGFR |
Stealth pin | ArrayIt | SMP3 | |
Stealth pin | ArrayIt | SMP7 | |
Amine coated slides | ArrayIt | SMM2 | |
Aldehyde coated slides | ArrayIt | SMA2 | |
Exposy coated slides | ArrayIt | SME2 | |
Poly(methylmethacrylate) (PMMA) coated slides | Exakt Technologies Inc. | 41500 | |
0.2-μm syringe filter | PALL Life Sciences | 4612 | |
Equipment | |||
Virtek Contact Printer | BioRad | ||
Novaray Fluorescence Slide Imager | Alpha Innotech Corporation | ||
Desktop microarray centrifuge | ArrayIt | MHC110V | |
MilliQ Synthesis A10 | Millipore | Used to filter all water required for experiments |