Üretim gelişmekte olan bir pin-baskı yöntemi kullanılarak sol-jel türevli protein katkılı mikroarrayler geliştirmek için bir güdümlü malzeme tarama yaklaşımı açıklanmıştır. Bu metodoloji maliyet-etkin küçük moleküllü tarama için kullanılan asetilkolinesteraz ve multikinaz microarrays, geliştirilmesi yoluyla gösterilmiştir.
Mikrodiziler yeni malzemeler ve küçük moleküllü ilaç potansiyel keşfi için yüksek verimli testlerin geliştirilmesinde kullanımı bulduk. Burada üç boyutlu protein mikrodiziler üretimi için uygun olan, sol-jel esaslı malzemelerin belirlenmesine yönelik bir güdümlü malzeme tarama yaklaşımı açıklar. Bu yaklaşım ilk, mikroarray'ler olarak basılabilir malzeme tanımlayan maksimum enzim aktivitesi tutma dayalı belirli bir enzim testi ile uyumlu olanlar, ve sonra en uygun malzeme üzerinde dürüst belirleyerek malzemelerin sayısı daraltır. Bu yaklaşım, kanser dahil dört temel kinazlar bir dizi kullanarak asetilkolinesteraz ve diğer kullanılarak iki farklı enzim deneyleri, tek bir uygun mikrodiziler geliştirmek için uygulanır. Her iki durumda da, bu miktar küçük moleküllü tarama deneyleri ve doza bağımlı bir inhibitörü yanıt eğrileri üretimi için kullanılabilir mikrodiziler üretmek mümkün olmuştur. Önemlisi, yeteneği birçok arkadaşı ekranarials iyi enzim aktivitesi mikroarray üretim ve saklama hem de uygun malzeme türleri hakkında bilgi üretti. Malzemeler veriler uygun, yüksek yoğunluklu sol-jel elde mikroarrayler dikme için gerekli temel malzeme ihtiyaç ilişkin bilgi sağlar.
Mikroarray'ler tahlil hacmi artırmak için bir yöntem olarak bilimsel topluluk içinde popülerlik kazanmıştır. Mikroarray teknolojisinin gelişmesi 1990'ların ortalarında gen 1 değerlendirmek için, mikroarray'ler protein-protein ve protein-küçük molekül etkileşimleri tanımlamak için, ve benzersiz özelliklere sahip yeni malzemeler bulmak için yüksek verimli deneyleri gelişiminde kullanım bulduk. 2-5 Daha yakın zamanlarda, mikrodiziler uygun bir floresan kullanılarak mikrodizi kendisinde enzimatik aktivitesi ve inhibisyon kolay ölçümü sağlayan, özel malzemeler proteinler sürüklenmiş edildiği bir üç boyutlu mikroarray elemanı üreten, fonksiyonel proteinleri immobilize etmek için kullanılan burada geliştirilmiştir substrat ciroya birleştirilmiştir tahlil. 5-10 Önemli olarak, bu tür bir çok paralel mikrodizilerinde olarak birlikte gerekli tüm ekran örnekler için bileşenler ve kontroller için dizayn edilebilir. 5,8 </ P>
Protein microarrays erken örnekleri tipik olarak kovalent bir eki olarak bir katı destek, üzerine protein immobilizasyonu için standart yöntemler kullanılarak hazırlandı, 3 11 afinite yakalama ve fiziksel adsorpsiyon. 12 biyo-immobilizasyonu, bu yöntem için gerekli olan artış Örnek konsantrasyonu ve hızlandırılmış reaksiyon kinetiği için izin verirken testi minyatür, her sakıncaları muzdarip. Genel olarak, her bir yüzeyin kimyasal modifikasyonu nedeniyle yerel biyomolekülün özelliğe azalma, aktif yerleri erişimi engellenmiş ya da spesifik olmayan hareketsizlik nedeniyle düzgün olmayan bir doğrultuda neden olur. Bu nedenle, biyomolekülün depozisyonunda bir artışı, muhtemelen yapay bir yüzeye biyomoleküllerin bağlamak için ihtiyacı nedeniyle ortaya çıkan bir tepki rağmen bütün yöntemleri düşük hassasiyet deneyi ile sonuçlanır.
Fonksiyonel biyomolekülün microarrays üretimi için gelişmekte olan bir yaklaşım protein katkılı pin-baskı geçertipik olarak Fonksiyonlu cam slaytlar veya mikro plakaları tek tek kuyu olan katı destekler üzerine silika soller,. Sol-jel işlemi, kendi başına, oda sıcaklığında bir sulu ortam içinde yer alır, ve bunun içinde 13 yükleme yanı sıra, birden fazla bileşenden tuzak yüksek protein sağlayan, basılmış ve daha sonra 3D matris içinde entrap biyomoleküllerin jeller bu sıvıyı öncüsüdür Aynı mikrodizi elemanı. sol-jel türetilmiş malzeme 13,14 Biçme yanı sıra farklı tamponlar kullanımı (pH, iyonik kuvvet) aracılığıyla sulu bileşen değiştirerek, farklı silis öncülerinin dikkatli seçimi yoluyla yapılır ve kaynaştırma edilebilir optimal bir malzeme elde etmek için, çeşitli katkı maddeleri (polimerler, küçük moleküller), özel doğası sıkışmış bir biyomolekülün bağlıdır. 10
Pin-baskı ile sol-jel türevli protein mikroarrayler geliştirme ile ilgili olası bir sınırlamapin jelleşme olmadan basılı veya kez bir yüzey üzerine basılmış istenmeyen özellikleri (üretilemez nokta boyutları, çatlama, yapışmayı, tahlil bileşenleri ile uyumsuzluk, kötü protein aktivite) gösteren edilebilir sol-jel bazlı kompozit malzemeler tanımlamak için ihtiyaç. 5 Eşzamanlı tüm bu parametrelerin optimizasyonu bir yaklaşım, burada malzeme de novo olarak dizayn edilebilir önleyen ya da seri bir şekilde yavaş yavaş incelenmiştir. Diğer yandan, bir çok bin veya malzeme onbinlerce rastgele tarama ne zaman ne de maliyet-etkindir.
Bu yazıda, rastgele malzemelerin çok sayıda taranması için gerek kalmadan proteinin microarrays üretimi için uygun malzemeler arasında hızla belirlenmesini sağlar yönlendirilmiş bir tarama yaklaşımı açıklar. Bir güdümlü bir yaklaşım kullanarak, mikroarray baskı için uygun malzeme ilk tanımlamak için küçük ölçekli ekranlar bir dizi izledi, tanımlanan sol-jel malzemeler elde en iyiAl kombinasyonları bu çatlama olmadan, yeniden üretilebilir biçimde basılmış ve belirli bir tahlil ile uyumlu olabilir. Son olarak, en uygun malzeme nihai bir küçük moleküllü bir tarama deneyi, enzim aktivitesi ve performans tutma göre tespit edilir. Bu şekilde, en uygun malzeme sadece bir kaç yüz tahlilinde adımları kullanarak birçok bin aday ikinci tespit edilebilir. Biz yüksek yoğunluklu asetilkolinesteraz ve multikinaz mikroarrayler ve küçük moleküllü tarama için bu tür microarrays kullanımı hem de üretim için bu yaklaşım göstermektedir.
Burada anlatılan yöntem hızla malzemelerin çok sayıda ekran zorunda kalmadan uygun malzemeler belirlenmesi için bir zaman ve maliyet-etkin bir üretim yöntemini, bir iletişim yazıcı ile basılabilir sol-jel türetilen maddeler belirlenmesi için en uygun olarak seçilmiştir. ~ 20,000 potansiyel malzemeler toplam kaynaktan, tek başına jelleşme süresi temelinde baskı için uygun olan ~ 200 malzemeleri tespit etmek mümkün olmuştur. Bu durum sonraki baskı denemeleri için hazırlıklı olmak gerekli malzemelerin sayısını azalttı. Bu yazdırılabilir malzeme daha sonra 768 malzeme-slayt kombinasyonları olmak üzere toplam 4 slayt yüzeyler üzerine basıldı. Ortalama olarak, bir malzemenin 50 noktalar / çoğaltır örnek yükleme, nokta birikimi ve pin temizlik dahil olmak üzere ~ 3 dakika, basılabilir. Bunlardan, 155 malzeme, ya da kabaca 20%, çözüm alım başına noktalar en fazla sayıda baskı için izin ve tekrarlanabilir nokta boyutları üretti. Şunu belirtmek gerekir ki bu 4 SLide yüzeyler test, malzeme için daha iyi basılmış: amin> epoksi> aldehit> PMMA; PMMA slaytlar herhangi bir malzeme için yararlı diziler vermedi. Bu büyük olasılıkla yüzey kaplama kutup bağlandı. Sözü edilen kızak yüzeyleri karşılaştırıldığında, daha polar bir amin ve epoksi daha PMMA slaytlar göre sulu soller için uygun. Buna ek olarak, test edilen yüzeylerin, amin kaplı slaytlar bağ anyonik sol yatırılır için potansiyel bir pozitif yüklü yüzey sağlar. Biz şüpheli, silika slayt ve sol yüzeyi boyunca etkileşim arasındaki arayüzü nanopartiküller. Epoksi ve aldehit slayt yüzeyler her ikisi de aynı ilk şarj tabanlı etkileşim eksikliği. En iyi nokta birikimi sağlamak için son derece böyle Arrayit gibi bir tedarikçiden ön kaplı slaytlar kullanılması önerilir. In-house kaplama kötü nokta tekrarlanabilirlik 13 ve yol tutarsız yüzeyler üretir, bazı durumlarda, miktar prob yol açabilirvelilerine. eşit önem Of 18, sıcaklık ve nem malzemelerin "printability" etkiler. Sıcaklık ile ilgili etkileri üzerinde detaylı çalışmalar gerçekleştirilmiştir da, baskı her zaman oda sıcaklığında gerçekleştirilir (23 ± 3 ° C) yıkandı. Nem oranı (% 80'den fazla) da küçük miktarlar birikimi (0,7-2,3 nl) ve buharlaşma nedeniyle düzensiz şekil birikmesini önlemek için baskı odası içinde kontrol edildi.
Malzeme ekran AChE ve kinazlar, protein her iki tip için çalıştı malzemelerin küçük bir set belirlendi baskı için özel olarak en iyi sol-jel türevli malzemeler tespit doğru yönlendirilir iken. Gerçekten de, kinaz mikrodizi imalatı için tespit edilen malzemenin her iki SS + PVA + gliserol dayanmaktadır, ve her iki malzemenin de AChE mikrodizilerinde seçilen malzeme 26 içinde tespit edilmiştir. Bu "iyi" malzeme daha prote geliştirmek için genel bir başlangıç noktası sunabilirBu kompozisyonlar etrafında in-katkılı sol-jel tabanlı mikroarrayler ve küçük ekranlar mikroarray üretim için daha iyi malzeme tespit edebilir. Unutulmaması gereken ikinci bir nokta kullanılan enzim önemidir. AChE (oldukça sağlam bir enzim) durumunda, test uyumlu olarak tanımlanan özgün 66 malzeme 26 (ya da yaklaşık% 40) sıkışmış AChE aktivitesi korunur. Bununla birlikte, daha hassas kinazlar için, tahlil 69 ile uyumlu bir kompozisyon ya da malzeme yaklaşık% 3, sadece 2'si kinazların aktivitesini koruyan başardık. Farklı enzim yeterli sayıda kesin açıklama yapmak incelenmemiştir olsa da, nispeten kararsız enzimler ile bu optimize dizi üretim mutliplexed mikroarray üretim izin proteinlerin geniş bir tuzağa düşürmek için kullanılan malzemelerin belirlenmesi yol açabilir görünür.
Seçilen bir protein bağımsız olarak, yazdırılabilir malzeme belirlenmesi için önemli bir cut-off faktörü uzun için duyulan ihtiyaçmalzeme jelleşme zamanı (> 2.5 saat). SS sol-jel esaslı malzemelerin geliştirilmesi, bu iyon değişimi ve süzme sonrasında, çözeltinin pH değeri yaklaşık 4 olduğu, sağlamak için çok önemlidir. Daha düşük bir başlangıç pH değerine sahip soller enzim aktivitesini etkileyebilir. 19 AYAR SS Dowex (iyon değişimi reçinesi) miktarı Sol nihai pH değiştirebilen bir daha düşük olma, nötr pH ile malzeme ile sonuçlanabilir. Bu reçinenin yeni bir parti hazırlandığı zaman SS reçine oranı protokol bölüm 2'de belirtilen prosedür takip yaklaşık pH 4 olarak soller üretmek için ayarlanabilir olması gerekmektedir.
Benzer şekilde, kristal dsu hazırlık genellikle biyomolekülün yakalanmalarında EGM tabanlı soller kullanılıyorsa malzeme yetmezliği ile ilişkili bir hata kaynağıdır. Burada ayrıntılı olarak rapor edilmemiş olmasına rağmen, büyük bir özen polyglycerated silika üretebilir, özellikle kristalin dsu sentezi, sentez sırasında suyun varlığında önlemek için gerek sırasında alınması gerekiryerine monomerik DGS daha tes. Ayrıca, dsu higroskopik doğası nedeniyle, kristalin örnek kurutulmuş ve sentezden sonra 6 ay içinde kullanılan saklanır gerekmektedir. 6 aydan büyük kristal DGS hatta asidik ortamda sonikasyon ile (nedeniyle kısmen yoğunlaştırılmış poligliseril silikat malzeme) tam çözülür olmayabilir. Eksik DGS çözünme bilinmeyen ve kontrol edilemeyen silis içeriği ve bu nedenle, daha az sağlam malzemelerle soller üretir.
Temas baskı ile Unutulmaması gereken önemli bir nokta işaretçilerine kalitesidir. Hasarlı veya yanlış kullanılmış işaretçilerine (Şekil 9) yazdırılan malzemenin bağımsız tekrarlanabilir dizileri üretmek asla. Bu kırık veya tıkanmış işaretçilerine kullanılmaz sağlamak için bir diseksiyon mikroskobu kullanarak pin kalitesini kontrol etmek için önerilir. Dikkatli kullanım işaretçilerine için uzun ömürlü olmasını sağlar. Piminin serbest hareketi de önemlidir. Nem baş ve pin arasındaki baskı kafası, pin sıkışmış durumdadoğru koltuk ve böylece malzeme birikimi eksikliği sonucu, yüzey ile uygun temas yapmaz olmaz.
Sonuç olarak, yüksek yoğunluklu protein katkılı pin baskılı mikroarrayler geliştirmek için ayrıntılı, çok adımlı tarama yaklaşım sağladı. Tarama daha odaklı tarama takip malzemelerin baskı, belirli bir test ile uyumlu ve enzim aktivitesi muhafaza edebiliyoruz malzemeleri tanımlamak için izin malzeme özelliklerinin optimizasyonu (jelleşme süresi ve printability) içerir. Bu güdümlü malzeme tarama yaklaşımı zaman ve verimli yüksek yoğunluklu mikrodiziler üretimi ile ilgili maliyet düşürmek için ilave mikrodizi biçimleri uygulanabilir.
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar protein microarrays gelişiminde yardım için Maria Monton, Julie Lebert, Jessamyn Küçük, Xin Ge ve Laura Lautens teşekkür ederim. Yazarlar ayrıca bu iş için fon Doğa Bilimleri ve Kanada'nın Mühendislik Araştırma Kurumu (NSERC) teşekkür ederim. Yazarlar ayrıca bu işin destek için Yenilik ve Ontario Yenilik Güven için Kanada Vakfı teşekkür ederim. JDB Biyoanalitik Kimya ve Biointerfaces yılında Kanada Araştırma Başkanı tutar.
Reagent/Material | |||
Poly(vinyl alcohol) (PVA) | Sigma-Alderich | 360627 | 80% hydrolozyed, Mw 600 |
Polyethylene glycol 600 (PEG) | Sigma-Alderich | 87333 | |
Polyethylenimine (PEI) | Sigma-Alderich | 482595 | 50% (w/w) solution in water |
Carboxyethylsilanetriol (Si-COOH) | Gelest, Inc. | SIC2263.0 | 25% in water |
N-(3-triethoxysilylpropyl) gluconamide(GLS) | Gelest, Inc. | SIT8189.0 | 50% in ethanol |
bis[(3-methyldimethoxysilyl)propyl]polypropylene oxide (MDSPPO) | Gelest, Inc. | SIB1660.0 | |
Methyltrimethoxysilane (MTMS) | Gelest, Inc. | SIM6560.1 | |
Bis(triethoxysiyly)ethane (Bis-TEOS) | Gelest, Inc. | SIB1817.0 | |
3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES) | Gelest, Inc. | SIA0610.0 | |
Glycerol | Sigma-Alderich | 49767 | |
D-Sorbitol | Sigma-Alderich | 240850 | |
D-(+)-Trehalose dihydrate | Sigma-Alderich | T9531 | |
Triton X-100 | Sigma-Alderich | X-100 | |
Nε-Acetyl-L-lysine | Sigma-Alderich | A4021 | |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Alderich | 154563 | |
HEPES | Sigma-Alderich | H3375 | |
Sodium hydroxide, 1.0 N | LabChem Inc. | LC24350-2 | |
Hydrochloric Acid, 1.0 N/0.1 N | LabChem Inc. | LC15300-2/LC152220-2 | |
Magnesium chloride | Sigma-Alderich | M8266 | |
Diglycerolsilane (DGS) | Prepared in laboratory | ||
Sodium silicate solution | Fisher Scientific | SS338-1 | |
Dowex 50WX8-100 ion exchance resin | Sigma-Alderich | 217492 | |
Acetylthiocholine iodide | Sigma-Alderich | 1480 | |
Acetylcholinesterase from Electrophorus electricus (electric eel) | Sigma-Alderich | C2888 | |
BODIPY FL L-Cystine | Invitrogen | B-20340 | |
Pro-Q Diamond Phosphoprotein/Phosphopeptide Microarray Stain Kit | Invitrogen | P33706 | |
Adenosine 5'triphosphate disodium salt (ATP) solution | Sigma-Alderich | A6559 | |
MAP Kinase 2 (MAPK2) | EMD Millipore | 454850 | |
p38α/SAPK2a (T106M), active | EMD Millipore | 14-687M | |
Epidermal growth factor (EGFR) | EMD Millipore | Donated by Millipore | |
Glycogen synthase kinase 3β (GSK-3β) | EMD Millipore | 14-306 | |
Myelin basic protein (MBP) | EMD Millipore | Substrate for MAPK2 and p38α, Donated by Millipore | |
GSM | EMD Millipore | 12-533 | Substrate for GSK-3β |
Poly-glu-tyr polypeptide p(E4Y) | EMD Millipore | 12-440 | Substrate for EGFR |
Stealth pin | ArrayIt | SMP3 | |
Stealth pin | ArrayIt | SMP7 | |
Amine coated slides | ArrayIt | SMM2 | |
Aldehyde coated slides | ArrayIt | SMA2 | |
Exposy coated slides | ArrayIt | SME2 | |
Poly(methylmethacrylate) (PMMA) coated slides | Exakt Technologies Inc. | 41500 | |
0.2-μm syringe filter | PALL Life Sciences | 4612 | |
Equipment | |||
Virtek Contact Printer | BioRad | ||
Novaray Fluorescence Slide Imager | Alpha Innotech Corporation | ||
Desktop microarray centrifuge | ArrayIt | MHC110V | |
MilliQ Synthesis A10 | Millipore | Used to filter all water required for experiments |