Summary
हम भड़काऊ चरणों के भेद के लिए एक गैर इनवेसिव इमेजिंग विधि का वर्णन है. Luminol की प्रणालीगत प्रसव neutrophils में MPO गतिविधि पर निर्भर तीव्र सूजन के क्षेत्रों का पता चलता है. इसके विपरीत, lucigenin का इंजेक्शन मैक्रोफेज में Phox गतिविधि पर निर्भर जीर्ण सूजन के दृश्य के लिए अनुमति देता है.
Abstract
सूजन कई मानव रोगों का एक मूलभूत पहलू है. इस वीडियो रिपोर्ट में, हम माउस मॉडल में तीव्र और जीर्ण सूजन भेद कि गैर इनवेसिव bioluminescence इमेजिंग तकनीक का प्रदर्शन. ऊतकों को नुकसान या रोगज़नक़ आक्रमण के साथ, जीवाणुओं तीव्र भड़काऊ प्रतिक्रिया मध्यस्थता में एक प्रमुख भूमिका निभा रहा है, रक्षा की पहली पंक्ति रहे हैं. भड़काऊ प्रतिक्रिया की प्रगति, घूम monocytes धीरे - धीरे चोट की साइट में विस्थापित और जीर्ण सूजन मध्यस्थता और ऊतक मलबे को हटाने और विरोधी भड़काऊ साइटोकिन्स का निर्माण करके ऊतकों की मरम्मत को बढ़ावा देने के जो परिपक्व मैक्रोफेज में अंतर. Luminol की intraperitoneal इंजेक्शन (5 एमिनो 2, 3 Dihydro -1 ,4-phthalazinedione, सोडियम नमक) मोटे तौर पर ऊतक घुसपैठ जीवाणुओं द्वारा मध्यस्थता तीव्र सूजन का पता लगाने में सक्षम बनाता है. Luminol विशेष रूप से एक myeloperoxidase (एम से bioluminescence परिणाम के बाद neutrophils की phagosomes भीतर उत्पन्न सुपरऑक्साइड साथ प्रतिक्रिया करता हैपीओ) मध्यस्थता प्रतिक्रिया. Lucigenin (बीआईएस एन methylacridinium नाइट्रेट) भी bioluminescence उत्पन्न करने के क्रम में superoxide साथ प्रतिक्रिया करता है. हालांकि, lucigenin bioluminescence MPO के स्वतंत्र है और यह पूरी तरह जीर्ण सूजन के दौरान मैक्रोफेज में भक्षककोशिकीय NADPH oxidase (Phox) पर निर्भर करता है. साथ में, luminol और lucigenin गैर इनवेसिव दृश्य और दोनों तीव्र और जीर्ण सूजन चरणों में अलग भक्षककोशिकीय आबादी के अनुदैर्ध्य मूल्यांकन अनुमति देते हैं. मानव रोगों की एक किस्म में सूजन की महत्वपूर्ण भूमिका को देखते हुए, हम इस गैर इनवेसिव इमेजिंग विधि रोग की स्थिति की एक किस्म में neutrophils और मैक्रोफेज के अंतर भूमिकाओं की जांच में मदद कर सकते हैं.
Introduction
सूजन, उपचार 2 घाव, मधुमेह 3, neurodegenerative कैंसर 4, हृदय 5, 6, और autoimmune रोग 7 सूक्ष्म जीवाणु संक्रमण 1 सहित मानव रोगों की एक किस्म में शामिल एक उच्च विनियमित जैविक प्रतिक्रिया है. ऊतक सूजन रोगज़नक़ निकासी, ऊतकों की मरम्मत, और रोग के संकल्प को प्राप्त करने के क्रम में विभिन्न प्रतिरक्षा कोशिकाओं के समुचित समन्वय की आवश्यकता है. Neutrophils और मैक्रोफेज ऊतक सूजन के प्रमुख प्रतिरक्षा मध्यस्थों हैं. सूजन की तीव्र चरण में जीवाणुओं विभिन्न हानिकारक उत्तेजनाओं और ऊतकों को नुकसान 8 से पहले responders हैं. जीवाणुओं तेजी से कोशिकाओं विरोधी माइक्रोबियल कणिकाओं और phagocytosis रिहा द्वारा रोगाणुओं हमलावर निष्क्रिय जहां, प्रचलन से चोट की साइट के लिए बहना. Phagocytosis के दौरान, neutrophils कोशिकाओं superox के उच्च स्तर का उत्पादन जो भीतर, phagosomes में रोगाणुओं हमलावर निगलआईडीई (2 हे · -). Phagosomal सुपरऑक्साइड कई बहाव प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) के प्राथमिक स्रोत है. उदाहरण के लिए, सुपर सहज dismutation द्वारा या superoxide dismutase (वतन) 9, 10 से हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच 2 हे 2) को dismutated किया जा सकता है. Neutrophils में, myeloperoxidase (MPO) आगे विरोधी माइक्रोबियल हाइपोक्लोरस अम्ल (HOCL) 11 से हाइड्रोजन पेरोक्साइड धर्मान्तरित. भड़काऊ प्रतिक्रियाओं जारी, घूम monocytes धीरे - धीरे चोट की साइट में विस्थापित और जिसका phagocytic समारोह निष्क्रिय रोगजनकों और सेल मलबे को हटाने में मदद परिपक्व मैक्रोफेज 2, में अंतर. इसके अलावा, सूजन के बाद के चरण में एक महत्वपूर्ण नियामक के रूप में, बृहतभक्षककोशिका विरोधी भड़काऊ साइटोकिन्स 12 का निर्माण करके और एक निचले स्तर 9 बजे कोशिकी आरओएस उत्पन्न करके ऊतकों की मरम्मत को बढ़ावा देता है. यह बाद में मंच पर उत्पन्न आरओएस ऊतक remodeling, नई वाहिनियों के गठन, और reepithelia विनियमितlization 13.
भक्षककोशिकीय NADPH oxidase (Phox) neutrophils और मैक्रोफेज 9 दोनों में superoxide उत्पादन का प्राथमिक स्रोत है. Phox जिसका विधानसभा कसकर 9 नियंत्रित किया जाता है एक बहु सबयूनिट जटिल है. holoenzyme कई साइटोसोलिक विनियामक सब यूनिटों (P67 phox, p47 phox, P40 phox, और आरएसी) और एक झिल्ली ही सीमित heterodimer के साइटोक्रोम बी 558 (सबयूनिट CYBA और CYBB से मिलकर बनता है) शामिल हैं. साइटोक्रोम बी 558 CYBB सबयूनिट (भी P91 phox और NOX2 के रूप में जाना जाता है) प्राथमिक रेडोक्स श्रृंखला प्रतिक्रिया 9 बाहर किया जाता है, जो भीतर प्रतिक्रिया कोर है. दिलचस्प है, अपने विधानसभा साइटों neutrophils और मैक्रोफेज के बीच अलग हैं. आराम neutrophils में, साइटोक्रोम बी 558 इंट्रासेल्युलर भंडारण कणिकाओं 14 की झिल्ली में ज्यादातर मौजूद है. Phagocytosis के दौरान, जीवाणुओं ज इकट्ठाMPO गतिविधि का उच्च स्तर भी मौजूद हैं, जहां phagosomes 9, पर oloenzymes. न्युट्रोफिल Phox तेजी से ऑक्सीजन की खपत और आरओएस उत्पादन से अपनी microbicidal शक्ति डाल रही है, एक घटना श्वसन फट 11 करार दिया. इसके विपरीत, मैक्रोफेज MPO अभिव्यक्ति का स्तर कम है और ख 558 ज्यादातर प्लाज्मा झिल्ली 15, 16 में पाया जाता है साइटोक्रोम. मैक्रोफेज विनियामक कार्यों 15 के लिए कम सुपरऑक्साइड उत्पन्न करते हुए इस प्रकार जीवाणुओं, विरोधी माइक्रोबियल गतिविधि के लिए सुपरऑक्साइड के उच्च स्तर का उत्पादन.
सूजन विवो प्रक्रिया में एक जटिल है, सूजन के विभिन्न चरणों के लिए विशिष्ट गैर इनवेसिव इमेजिंग तरीकों रोग मॉडल की मात्रात्मक और अनुदैर्ध्य मूल्यांकन की अनुमति होगी. यंत्रवत अध्ययनों का उपयोग करना, हम पहले दो chemiluminescent एजेंटों के उपयोग, luminol (5 एमिनो 2, 3 Dihydro -1 ,4-phthalazinedione) और lucigenin (बीआईएस एन methylacridinium नाइट्रेट) का प्रदर्शन किया, क्रमशः 17 सूजन की तीव्र और देर से (पुरानी) चरणों की गैर इनवेसिव इमेजिंग के लिए. Lucigenin bioluminescence देर चरण या जीर्ण सूजन 17 के सहयोग से बृहतभक्षककोशिका गतिविधि का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जबकि Luminol, सूजन 18-20 की तीव्र चरण में न्युट्रोफिल MPO गतिविधि के दृश्य के लिए सक्षम बनाता है. इस पांडुलिपि में, हम इन इमेजिंग तकनीक का प्रदर्शन करने के लिए दो प्रयोगात्मक सूजन मॉडल (सुप्रीम कोर्ट पीएमए और सुप्रीम कोर्ट LPS) का इस्तेमाल किया.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
नोट: सभी जानवरों के अध्ययन अनुमोदित संस्थागत प्रोटोकॉल और जानवरों की देखभाल के दिशा निर्देशों के तहत प्रदर्शन किया गया.
1. अभिकर्मकों और समाधान
- सुप्रीम कोर्ट टीका के लिए पीएमए समाधान: phorbol 12 myristate 5 मिलीग्राम / DMSO में मिलीग्राम से कम 13-एसीटेट (पीएमए) के एक शेयर समाधान तैयार है. -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टॉक समाधान स्टोर टीका से पहले, शेयर समाधान पिघलना और पीबीएस में 1 मिलीग्राम / एमएल पीएमए को पतला.
- सुप्रीम कोर्ट टीका लिए LPS समाधान: पहले सुप्रीम कोर्ट टीका के लिए 1 मिलीग्राम / एमएल बाँझ पीबीएस में भंग lipopolysaccharide (साल्मोनेला enterica सीरोटाइप enteritidis से LPS).
- तीव्र चरण इमेजिंग के लिए Luminol समाधान: 10 मिलीग्राम / एमएल (0.9% NaCl) बाँझ सामान्य नमक में (5 एमिनो 2, 3 Dihydro -1 ,4-phthalazinedione, सोडियम नमक) luminol भंग. समाधान उपयोग करने से पहले -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है.
- पुरानी चरण इमेजिंग के लिए Lucigenin समाधान: बाँझ सामान्य नमक में lucigenin (बीआईएस एन methylacridinium नाइट्रेट) भंग2.5 मिलीग्राम / एमएल. समाधान उपयोग करने से पहले -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है.
2. चमड़े के नीचे पीएमए सूजन मॉडल
- 1-2% isoflurane के साथ एक प्रेरण कक्ष में एनसीआर नग्न चूहों anesthetize. आंदोलन के नुकसान और एक स्थिर सांस की दर से सामान्य संज्ञाहरण की पुष्टि करें. Isoflurane के मिश्रित गैस की आपूर्ति के साथ एक नाक शंकु के लिए एक जानवर स्थानांतरण और संज्ञाहरण के तहत पशु रहते हैं.
- बायीं ओर पर इंजेक्शन साइट को साफ और शुद्ध करना पोंछ एक isopropyl शराब का प्रयोग करें.
- बाँझ तकनीक का उपयोग करना, बायीं ओर पर चमड़े के नीचे अंतरिक्ष में पीएमए टीका समाधान (पीएमए की 50 ग्राम युक्त) के 50 μl इंजेक्षन. एक isopropyl शराब पैड का उपयोग करके इंजेक्शन साइट से अधिक तरल पदार्थ निकालें. यह भड़काऊ प्रतिक्रियाओं को प्रभावित कर सकता है एनलजेसिया के प्रयोग से बचें.
- आवास पिंजरे में वापस जानवर ले जाएँ और बारीकी से संज्ञाहरण से इसकी वसूली की निगरानी. वसूली में सहायता करने के लिए, पशु गर्म रखने के लिए एक हीटिंग पैड का उपयोग करें.
3. चमड़े के नीचे LPS सूजन मॉडल
- एक प्रेरण कक्ष में isoflurane 1-2% के साथ C57BL/6J चूहों anesthetize. सामान्य संज्ञाहरण की स्थापना एक बार, isoflurane गैस की आपूर्ति के साथ एक नाक शंकु के लिए एक जानवर हस्तांतरण और संज्ञाहरण के तहत पशु रहते हैं.
- बाएं लुटेरा को इंजेक्शन स्थल को साफ करने के लिए पोंछ एक isopropyl शराब का प्रयोग करें.
- बाँझ तकनीक का उपयोग करना, बाएं लुटेरा में LPS टीका समाधान (LPS की 50 ग्राम युक्त) के 50 μl इंजेक्षन. एक isopropyl शराब पैड का उपयोग करके इंजेक्शन साइट से अधिक तरल पदार्थ निकालें. यह भड़काऊ प्रतिक्रियाओं को प्रभावित कर सकता है एनलजेसिया के प्रयोग से बचें.
- आवास पिंजरे में वापस जानवर ले जाएँ और बारीकी से संज्ञाहरण से इसकी वसूली की निगरानी. वसूली के दौरान पशु गर्म रखने के लिए एक हीटिंग पैड का प्रयोग करें.
4. सूजन के bioluminescence इमेजिंग
- 1-2 isoflurane% मिश्रित गैस के साथ एक प्रेरण कक्ष में पशु anesthetize. सहआंदोलन के नुकसान और एक स्थिर सांस की दर से सामान्य संज्ञाहरण nfirm.
- पशु संज्ञाहरण के तहत अब भी है, intraperitoneally (आईपी) क्रमशः तीव्र या जीर्ण सूजन इमेजिंग के लिए luminol समाधान (10 मिलीग्राम / एमएल), या lucigenin समाधान (2.5 मिलीग्राम / एमएल) इंजेक्षन. अंतिम खुराक luminol और lucigenin के लिए 25 मिलीग्राम / किग्रा के लिए 100 मिलीग्राम / किग्रा है. Lucigenin (10-15 मिलीग्राम / किग्रा) के एक कम खुराक कुछ माउस उपभेदों के लिए संभव विषाक्तता से बचने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. विषाक्तता के लक्षण सांस और श्वसन संकट की कमी शामिल हैं. C57BL/6J तनाव एनसीआर नग्न तनाव से कम lucigenin सहनशीलता है.
- एक bioluminescence इमेजिंग प्रणाली का इमेजिंग कक्ष में पशु स्थानांतरण.
- 1 मिनट के अंतराल पर अनुक्रमिक bioluminescence इमेजिंग प्रदर्शन करना. प्रत्येक इमेजिंग चरण 1 मिनट अधिग्रहण के समय के शामिल है, च / बंद = 1, binning = 16 और 0 सेकंड देरी.
- छवि अधिग्रहण पैनल के भीतर, अनुक्रमिक बहु कदम इमेजिंग सक्षम करने के लिए, बू सेटिंग अनुक्रम पर क्लिक करेंtton. अधिक से अधिक luminescence निर्गम (आमतौर पर 15 से एक मिनट के कदम पर्याप्त होगा) निर्धारित करने के लिए अधिग्रहण प्रोफ़ाइल में पर्याप्त इमेजिंग कदम प्रदान करें. 15 मिनट इमेजिंग अनुभाग सब्सट्रेट अवशोषण और प्रणालीगत संचलन के लिए पर्याप्त समय की अनुमति देता है.
- इमेजिंग कक्ष से पशु निकालें और आवास पिंजरे में इसे वापस ले जाते हैं. वसूली में सहायता करने के लिए, पशु गर्म रखने के लिए एक हीटिंग पैड का उपयोग करें.
- अधिग्रहण के बाद के विश्लेषण के दौरान ब्याज की मानकीकृत क्षेत्रों (आरओआई) के माध्यम से शिखर कुल bioluminescent संकेत की गणना करने के लिए इमेजिंग सॉफ्टवेयर पैकेज का उपयोग करें. छवियों / न्यूनतम और अधिकतम सीमा के साथ सेकंड / 2 सेमी / sr संकेत फोटॉनों में चमक के रूप में मौजूद हैं. मात्रात्मक डेटा रॉय प्रति सेकंड प्रति फोटॉनों में कुल प्रवाह के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
हम प्रयोगात्मक सूजन मॉडल में तीव्र और जीर्ण सूजन का आकलन करने के अनुदैर्ध्य bioluminescence इमेजिंग प्रदर्शन किया. Phorbol 12 myristate 13-एसीटेट (पीएमए) superoxide आयनों उत्पादन के लिए Phox सक्रिय है और 21 तीव्र तीव्र भड़काऊ प्रतिक्रियाओं से चलाता है कि एक शक्तिशाली प्रोटीन kinase सी (पीकेसी) agonist है. एनसीआर नग्न चूहों में पीएमए की 50 मिलीग्राम की अनुसूचित जाति इंजेक्शन इंजेक्शन साइटों 18, 22 में तेजी से त्वचा में जलन और तीव्र सूजन, 23 के कारण होता है. हम पीएमए इंजेक्शन के बाद 3 घंटे के रूप में जल्दी के रूप में प्राप्त की पहली छवियों के साथ 4 दिनों के लिए दैनिक इमेजिंग प्रदर्शन किया. चित्रा 1 substrates के रूप में luminol और lucigenin उपयोग कर अनुदैर्ध्य bioluminescence इमेजिंग प्रदर्शन किया. सूजन (3 घंटा) के प्रारंभिक दौर में, हम पीएमए इंजेक्शन के स्थलों पर न्युट्रोफिल MPO गतिविधि का उच्च स्तर का संकेत महत्वपूर्ण luminol bioluminescence मनाया. कोई महत्वपूर्ण lucigenin bioluminescence सूजन के इन प्रारंभिक दौर के दौरान देखा गया था. पर शुरू2 दिन, हम पपड़ी गठन और इसलिए कम luminescence तीव्रता मनाया. घाव भरने (चित्रा 1 ए, दिन 3 और 4) स्पष्ट हो गया है के रूप में, हम lucigenin bioluminescence में लगातार वृद्धि (चित्रा 1 बी) मनाया. इन परिणामों lucigenin bioluminescence बारीकी सूजन की देर चरणों में ऊतकों की मरम्मत के साथ जुड़ा हुआ है, जबकि luminol bioluminescence, सूजन की तीव्र चरण के साथ जुड़ा हुआ है कि उदाहरण देकर स्पष्ट करना.
स्वतंत्र रूप से, हम सुप्रीम कोर्ट जंगली प्रकार C57BL/6J चूहों के पैरों के पंजों में lipopolysaccharide की 50 ग्राम (LPS) इंजेक्शन, और 10 दिन (2A चित्रा) करने के लिए अनुदैर्ध्य bioluminescence इमेजिंग प्रदर्शन किया. LPS के ग्राम नकारात्मक जीवाणुओं की एक झिल्ली घटक है. LPS के अनुसूचित जाति टीका TLR4 रिसेप्टर सक्रियण और बाद में भड़काऊ केमोकाइन / cytokine उत्पादन 24 से मजबूत भड़काऊ प्रतिक्रियाओं ट्रिगर करने में सक्षम है. सीधे सुपरऑक्साइड productio के लिए Phox सक्रिय है जो पीएमए के विपरीतएन LPS, पूरी तरह से ऊतक फ़ैगोसाइट 18 घुसपैठ को सक्रिय करने के लिए समय की एक लंबी अवधि की आवश्यकता है. जीवाणुओं सूक्ष्म जीव के संक्रमण से जल्दी responders के हैं, हम दिन 5 (चित्रा 2 बी) के बाद गिरावट आई है, जो तीव्र सूजन, के पहले 4 दिनों के दौरान ऊंचा luminol bioluminescence मनाया. इसके विपरीत, lucigenin bioluminescence धीरे - धीरे सूजन की देर और पुरानी चरण (चित्रा 2 बी, दिन 5-10) में वृद्धि हुई है.
साथ में, इन परिणामों तीव्र और जीर्ण सूजन चरणों में भेद करने के लिए अंतर सब्सट्रेट विशिष्टता का उपयोग करने की क्षमता प्रदर्शित करता है. महत्वपूर्ण बात है, इमेजिंग प्रतिरक्षा कोशिकाओं की अंतर्जात enzymatic गतिविधियों द्वारा मध्यस्थता, और पत्रकारों के अस्थानिक अभिव्यक्ति की कोई जरूरत नहीं है.
चित्रा 1. सूजन की तीव्र और देर चरणों के vivo अनुदैर्ध्य bioluminescence इमेजिंग में. मजबूत> (एक) हम 50 ग्राम पीएमए के सुप्रीम कोर्ट इंजेक्शन द्वारा स्थानीय ऊतक सूजन प्रेरित किया, और दैनिक luminol (100 मिलीग्राम / किग्रा, आईपी) और lucigenin (25 मिलीग्राम / किग्रा, आईपी) पीएमए इंजेक्शन के बाद 3 घंटे में शुरू bioluminescence इमेजिंग प्रदर्शन किया. कोई महत्वपूर्ण पृष्ठभूमि ऑटो luminescence chemiluminescent एजेंट बिना सूजन की साइटों पर मनाया गया. इंजेक्शन स्थलों पर luminol और lucigenin bioluminescence का (बी) मात्रात्मक प्रतिनिधित्व. सूजन की तीव्र चरण में luminol संकेतों bioluminescence निर्गम (3 घंटा) बोलबाला है. सूजन के बाद के चरणों में, इंजेक्शन की साइटों luminol दिन (4) के साथ तुलना में उच्च lucigenin bioluminescence था. त्रुटि सलाखों प्रत्येक इमेजिंग समय बिंदु पर bioluminescence माप की मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
690fig2.jpg "/>
चित्रा 2. (ए) LPS की 50 ग्राम C57BL/6J चूहों के पैरों के पंजों में सुप्रीम कोर्ट इंजेक्ट किया गया था. Luminol और lucigenin साथ अनुदैर्ध्य bioluminescence इमेजिंग 10 दिनों के लिए दैनिक प्रदर्शन किया गया. LPS के इंजेक्शन स्थलों पर luminol और lucigenin bioluminescence का (बी) मात्रात्मक प्रतिनिधित्व. Luminol bioluminescence तीव्र सूजन के पहले 4 दिनों के दौरान वृद्धि हुई है. हालांकि, सूजन की देर / जीर्ण चरणों में, luminol संकेत तेजी से गिरावट आई और lucigenin bioluminescence धीरे - धीरे वृद्धि हुई है. त्रुटि सलाखों प्रत्येक इमेजिंग समय बिंदु पर bioluminescence माप की मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
इस रिपोर्ट में, हम रहने वाले जानवरों में सूजन की गैर इनवेसिव इमेजिंग के लिए एक bioluminescence विधि का प्रदर्शन. दो luminescent substrates है, luminol और lucigenin का लाभ उठाते हुए, विधि सूजन के विभिन्न चरणों को भेद कर सकते हैं. Lucigenin bioluminescence पुरानी चरण में मैक्रोफेज द्वारा मध्यस्थता है जबकि Luminol bioluminescence, सूजन की तीव्र चरण में जीवाणुओं के साथ जुड़ा हुआ है. अपेक्षाकृत छोटे (मेगावाट = 177.16 छ / mol) और विद्युत uncharged, luminol आसानी प्लाज्मा और phagosomal झिल्ली 25-29 दोनों प्रवेश कर सकते हैं. इसके अलावा, luminol luminescence के जीवाणुओं 9 में intracellular MPO गतिविधि के लिए विशिष्ट है. दूसरी ओर, lucigenin ज्यादातर के कारण अपने बड़े आकार (मेगावाट = 510.5 छ / mol) और दो सकारात्मक शुल्क 25, 27-30. को अभेद्य झिल्ली है
Neutrophils और मैक्रोफेज अलग subcellular स्थानों पर Phox holoenzyme इकट्ठा. हालांकि दोनों अभिकर्मकोंसुपर आयनों (2 हे · -) प्रदान करने के लिए Phox पर निर्भर करती है, सेल पारगम्यता और MPO निर्भरता में असमानता रोग मॉडल में भड़काऊ फ़ैगोसाइट अंतर करने के लिए substrates के लिए सक्षम बनाता है. न्यूट्रोफिल MPO के उच्च स्तर भी मौजूद हैं, जहां इंट्रासेल्युलर पुटिकाओं (phagosomes) 14, की झिल्ली में Phox की सबसे व्यक्त करते हैं. नतीजतन, luminol bioluminescence विशेष रूप से तीव्र सूजन के दौरान सक्रिय neutrophils के साथ जुड़ा हुआ है. वे घुसपैठ और जीर्ण सूजन के दौरान 15 परिपक्व के रूप में इसके विपरीत, मैक्रोफेज प्लाज्मा झिल्ली में Phox इकट्ठा. गैर पारगम्य lucigenin सीधे जीर्ण सूजन bioluminescence निर्माण करने के लिए मैक्रोफेज द्वारा उत्पन्न बाह्य सुपरऑक्साइड के साथ बातचीत कर सकते हैं.
सूजन कई प्रकार की कोशिकाओं और विभिन्न बाह्य संकेतन अणुओं की उचित समन्वय की आवश्यकता है कि इन विवो प्रक्रिया में एक जटिल है. इस वीडियो रिपोर्ट में, हम का प्रदर्शनपशु मॉडल में तीव्र और देर से (पुरानी) चरण सूजन नजर रखने के लिए luminol और lucigenin दोनों के synergistic उपयोग,. इन substrates व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है और अपेक्षाकृत सस्ती कर रहे हैं, हम इस अपेक्षाकृत सरल और मजबूत इमेजिंग विधि आसानी से कई रोग क्षेत्रों में विवो अनुप्रयोगों में अनुवाद किया जा सकता है. ध्यान से, पीईटी, एमआरआई और लगभग अवरक्त (NIR) फ्लोरोसेंट इमेजिंग तकनीक के साथ तुलना में, chemiluminescent विधि substrates के 'नीले उत्सर्जन स्पेक्ट्रा के कारण गहरी ऊतक इमेजिंग के लिए आदर्श नहीं है. ऊतक प्रवेश में सुधार करने के लिए, यह हाल ही में नीले chemiluminescence उत्सर्जन NIR के उत्सर्जन में 31 के लिए सह administrated नैनोकणों को हस्तांतरित किया जा सकता है कि प्रदर्शन किया गया है. उनकी रासायनिक संरचना के आगे संशोधन संभावित मजबूत प्रकाश उत्पादन के लिए उनके क्वांटम दक्षता बढ़ाने और गहरी ऊतक प्रवेश के लिए अपने उत्सर्जन स्पेक्ट्रा निखारने सकता है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
लेखक इस अध्ययन में ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा.
Acknowledgments
इस काम नैन्सी Lurie मार्क्स फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था. हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए डॉ. नैन्सी ई. कोल धन्यवाद. हम इस वीडियो रिपोर्ट तैयार करने में उसकी सहायता के लिए परिजनों लालकृष्ण वाँग धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO | P8139 | |
| Lipopolysaccharide from Salmonella enterica serotype enteritidis | Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO | L2012 | |
| Luminol (5-amino-2,3-dihydro-1,4-phthalazinedione, sodium salt) | Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO | A4685 | |
| Lucigenin (bis-N-methylacridinium nitrate) | Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO | M8010 | |
| IVIS Spectrum imaging system with Living Imaging 4.2 software package | Caliper LS/Perkin Elmer, Hopkinton, MA |
References
- Premack, B. A., Schall, T. J. Chemokine receptors: gateways to inflammation and infection. Nat. Med. 2, 1174-1178 (1996).
- Singer, A. J., Clark, R. A.
- Wellen, K. E., Hotamisligil, G. S.
- Weitzman, S. A., Gordon, L. I. Inflammation and cancer: role of phagocyte-generated oxidants in carcinogenesis. Blood. 76, 655-663 (1990).
- Ridker, P. M., Cushman, M., et al. Inflammation, aspirin, and the risk of cardiovascular disease in apparently healthy men. N. Engl. J. Med. 336, 973-979 (1997).
- Wyss-Coray, T., Mucke, L. Inflammation in neurodegenerative disease--a double-edged sword. Neuron. 35, 419-432 (2002).
- Hamilton, J. A. Colony-stimulating factors in inflammation and autoimmunity. Nat. Rev. Immunol. 8, 533-544 (2008).
- Harlan, J. M.
- Bedard, K., Krause, K. H. The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: physiology and pathophysiology. Physiol. Rev. 87, 245-313 (2007).
- Rest, R. F., Spitznagel, J. K. Subcellular distribution of superoxide dismutases in human neutrophils. Influence of myeloperoxidase on the measurement of superoxide dismutase activity. Biochem. J. 166, 145-153 (1977).
- Hampton, M. B., Kettle, A. J., et al. Inside the neutrophil phagosome: oxidants, myeloperoxidase, and bacterial killing. Blood. 92, 3007-3017 (1998).
- Serhan, C. N., Savill, J. Resolution of inflammation: the beginning programs the end. Nat. Immunol. 6, 1191-1197 (2005).
- Jiang, F., Zhang, Y., et al. NADPH oxidase-mediated redox signaling: roles in cellular stress response, stress tolerance, and tissue repair. Pharmacol. Rev. 63, 218-242 (2011).
- Calafat, J., Kuijpers, T. W., et al. Evidence for small intracellular vesicles in human blood phagocytes containing cytochrome b558 and the adhesion molecule CD11b/CD18. Blood. 81, 3122-3129 (1993).
- Johansson, A., Jesaitis, A. J., et al. Different subcellular localization of cytochrome b and the dormant NADPH-oxidase in neutrophils and macrophages: effect on the production of reactive oxygen species during phagocytosis. Cell. Immunol. 161, 61-71 (1995).
- Kumar, A. P., Piedrafita, F. J., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma ligands regulate myeloperoxidase expression in macrophages by an estrogen-dependent mechanism involving the -463GA promoter polymorphism. J. Biol. Chem. 279, 8300-8315 (2004).
- Tseng, J. C., Kung, A. L. In vivo imaging of inflammatory phagocytes. Chem Biol. 19, 1199-1209 (2012).
- Gross, S., Gammon, S. T., et al. Bioluminescence imaging of myeloperoxidase activity in vivo. Nat. Med. 15, 455-461 (2009).
- Kielland, A., Blom, T., et al. In vivo imaging of reactive oxygen and nitrogen species in inflammation using the luminescent probe L-012. Free Radic. Biol. Med. 47, 760-766 (2009).
- Zhou, J., Tsai, Y. T., et al. Noninvasive assessment of localized inflammatory responses. Free Radic. Biol. Med. 52, 218-226 (2012).
- Karlsson, A., Nixon, J. B., et al. Phorbol myristate acetate induces neutrophil NADPH-oxidase activity by two separate signal transduction pathways: dependent or independent of phosphatidylinositol 3-kinase. J. Leukoc. Biol. 67, 396-404 (2000).
- Taylor, R. G., McCall, C. E., et al. Histopathologic features of phorbol myristate acetate-induced lung injury. Lab Invest. 52, 61-70 (1985).
- Fukaya, S., Matsui, Y., et al. Overexpression of TNF-alpha-converting enzyme in fibroblasts augments dermal fibrosis after inflammation. Lab Invest. 93, 72-80 (2013).
- Lu, Y. C., Yeh, W. C., et al.
- Aitken, R. J., Buckingham, D. W., et al. Reactive oxygen species and human spermatozoa: analysis of the cellular mechanisms involved in luminol- and lucigenin-dependent chemiluminescence. J. Cell. Physiol. 151, 466-477 (1992).
- Allen, R. C., Loose, L. D. Phagocytic activation of a luminol-dependent chemiluminescence in rabbit alveolar and peritoneal macrophages. Biochem. Biophys. Res. Commun. 69, 245-252 (1976).
- Caldefie-Chezet, F., Walrand, S., et al. Is the neutrophil reactive oxygen species production measured by luminol and lucigenin chemiluminescence intra or extracellular? Comparison with DCFH-DA flow cytometry and cytochrome c reduction. Clin. Chim. Acta. 319, 9-17 (2002).
- Dahlgren, C., Aniansson, H., et al. Pattern of formylmethionyl-leucyl-phenylalanine-induced luminol- and lucigenin-dependent chemiluminescence in human neutrophils. Infect. Immun. 47, 326-328 (1985).
- Dahlgren, C., Karlsson, A.
- Aerts, C., Wallaert, B., et al. Release of superoxide anion by alveolar macrophages in pulmonary sarcoidosis. Ann. N.Y. Acad. Sci. 465, 193-200 (1986).
- Zhang, N., Francis, K. P., et al. Enhanced detection of myeloperoxidase activity in deep tissues through luminescent excitation of near-infrared nanoparticles. Nat Med. , (2013).
