Summary
Descriviamo un metodo di imaging non invasivo per distinguere le fasi infiammatorie. Consegna sistemica di luminol rivela le aree di infiammazione acuta che dipendono dalle attività MPO nei neutrofili. Al contrario, l'iniezione di lucigenina permette la visualizzazione di infiammazione cronica dipende attività Phox in macrofagi.
Abstract
L'infiammazione è un aspetto fondamentale di molte malattie umane. In questo rapporto il video, dimostriamo tecniche di imaging bioluminescenza non invasive che contraddistinguono l'infiammazione acuta e cronica in modelli murini. Con danni ai tessuti o invasione patogeno, neutrofili sono la prima linea di difesa, giocando un ruolo importante nel mediare la risposta infiammatoria acuta. Come la reazione infiammatoria progredisce, monociti circolanti gradualmente migrano nel sito di lesione e differenziarsi in macrofagi maturi, che mediano l'infiammazione cronica e promuovere la riparazione tissutale rimuovendo detriti tissutali e producendo citochine anti-infiammatorie. Iniezione intraperitoneale di luminol (5-ammino-2 ,3-diidro-1 ,4-phthalazinedione, sale di sodio) consente il rilevamento di infiammazione acuta largamente mediata da tessuto-infiltranti neutrofili. Luminol reagisce specificamente con il superossido generato all'interno delle fagosomi di neutrofili dal risultato bioluminescenza da una mieloperossidasi (MPO) reazione mediata. Lucigenina (bis-N-metilacridinio nitrati) reagisce anche con superossido per generare bioluminescenza. Tuttavia, lucigenina bioluminescenza è indipendente MPO e si basa esclusivamente su fagociti NADPH ossidasi (Phox) nei macrofagi durante l'infiammazione cronica. Insieme, luminol e lucigenina consentono la visualizzazione non invasiva e la valutazione longitudinale di diverse popolazioni fagocita tutto fasi infiammatorie acute e croniche. Dato il ruolo importante di infiammazione in una varietà di malattie umane, crediamo che questo metodo di imaging non invasivo può aiutare ad indagare i ruoli differenziali di neutrofili e macrofagi in una varietà di condizioni patologiche.
Introduction
Infiammazione è una risposta biologica altamente regolato coinvolti in una varietà di malattie umane, comprese infezione microbica 1, guarigione delle ferite 2, 3 diabete, cancro 4, 5 cardiovascolari, neurodegenerative 6, 7 e malattie autoimmuni. Infiammazione dei tessuti richiede un buon coordinamento delle varie cellule immunitarie al fine di ottenere l'autorizzazione patogeno, la riparazione dei tessuti, e risoluzione malattia. Neutrofili e macrofagi sono importanti mediatori immunitari di infiammazione dei tessuti. Nella fase acuta di infiammazione, i neutrofili sono i primi soccorritori a diversi stimoli nocivi e danni ai tessuti 8. I neutrofili stravaso rapidamente dalla circolazione al sito della lesione, dove le cellule inattivano i microbi invasori rilasciando granuli anti-microbiche e fagocitosi. Durante la fagocitosi, neutrofili fagocitare i microbi invasori in fagosomi, entro il quale le cellule producono alti livelli di superoxide (O 2 · -). Superossido phagosomal è la fonte primaria di molte specie reattive dell'ossigeno (ROS a valle). Per esempio, può essere dismutated superossido in perossido di idrogeno (H 2 O 2) mediante dismutazione spontanea o da superossido dismutasi (SOD) 9, 10. In neutrofili, la mieloperossidasi (MPO) converte ulteriormente il perossido di idrogeno in acido ipocloroso antimicrobica (HOCl) 11. Mentre le risposte infiammatorie continuano, monociti circolanti gradualmente migrano nel sito di lesione e di differenziarsi in macrofagi maturi 2, la cui funzione fagocitaria contribuire a rimuovere gli agenti patogeni inattivati e detriti cellulari. Inoltre, come un regolatore chiave nella fase successiva di infiammazione, macrofagi promuove la riparazione tissutale producendo citochine antinfiammatorie 12 e generando extracellulare ROS a un livello inferiore 9. Il ROS generato in questa fase successiva regolano il rimodellamento tissutale, formazione di nuovi vasi, e reepitheliazazione 13.
Fagociti NADPH ossidasi (Phox) è la principale fonte di produzione di superossido in entrambi i neutrofili e macrofagi 9. Phox è un complesso multi-subunità cui assemblaggio è strettamente regolata 9. Il oloenzima contiene diverse subunità regolatorie citosoliche (p67 phox, p47 phox, p40 phox e RAC) e una legata alla membrana eterodimero citocromo b 558 (costituiti da subunità CYBA e CYBB). Citocromo b 558 è il nucleo di reazione entro il quale la subunità CYBB (noto anche come p91 phox e NOX2) esegue la reazione primaria catena redox 9. È interessante notare, i suoi siti di assemblaggio sono differenti tra neutrofili e macrofagi. In neutrofili riposo, citocromo b 558 è presente soprattutto nella membrana dei granuli intracellulari di stoccaggio 14. Durante la fagocitosi, neutrofili assemblano il holoenzymes phagosomes a 9, dove sono presenti anche alti livelli di attività MPO. Il neutrofili Phox consuma rapidamente l'ossigeno ed esercita il suo potere microbicida per la produzione di ROS, un fenomeno chiamato il burst respiratorio 11. In contrasto, i macrofagi hanno un livello di espressione MPO e citocromo b 558 si trova soprattutto nella membrana plasmatica 15, 16. Così neutrofili producono alti livelli di superossido per attività anti-microbica, mentre i macrofagi producono meno superossido per funzioni di regolamentazione 15.
Dal momento che l'infiammazione è un processo complicato in vivo, metodi di imaging non invasive specifiche per le diverse fasi di infiammazione sarebbero consentono la valutazione quantitativa e longitudinale modelli di malattia. Utilizzando studi meccanicistici, abbiamo precedentemente dimostrato l'utilizzo di due agenti chemiluminescenti, luminol (5-ammino-2 ,3-diidro-1 ,4-phthalazinedione) e lucigenina (bis-N-metilacridinio nitrato), Per l'imaging non invasivo (cronica) fasi acute e tardive di infiammazione, rispettivamente 17. Luminol permette la visualizzazione dei neutrofili attività MPO nella fase acuta dell'infiammazione 18-20, mentre lucigenina bioluminescenza può essere utilizzato per valutare l'attività dei macrofagi in associazione con fase tardiva o infiammazione cronica 17. In questo manoscritto, abbiamo utilizzato due modelli sperimentali di infiammazione (sc PMA e sc LPS) per dimostrare queste tecniche di imaging.
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Protocol
Nota: Tutti gli studi sugli animali sono stati eseguiti secondo protocolli istituzionali approvate e linee guida per la cura degli animali.
1. Reagenti e soluzioni
- Soluzione PMA per sc inoculazione: Preparare una soluzione stock di phorbol 12-miristato 13-acetato (PMA) a 5 mg / ml in DMSO. Conservare la soluzione di riserva a -20 ° C. Prima di inoculazione, scongelare la soluzione di riserva e portare a 1 mg / ml di PMA in PBS.
- LPS soluzione per sc inoculazione: Sciogliere lipopolisaccaride (LPS da Salmonella enterica sierotipo Enteritidis) in PBS sterile a 1 mg / ml prima sc inoculazione.
- Soluzione luminol per l'imaging di fase acuta: Sciogliere luminol (5-ammino-2 ,3-diidro-1 ,4-phthalazinedione, sale di sodio) in soluzione fisiologica sterile (NaCl 0,9%) a 10 mg / ml. La soluzione può essere conservata a -20 ° C prima dell'uso.
- Lucigenina soluzione per l'imaging in fase cronica: Sciogliere lucigenina (bis-N-metilacridinio nitrati) in soluzione fisiologica sterilea 2,5 mg / ml. La soluzione può essere conservata a -20 ° C prima dell'uso.
2. Sottocutaneo PMA Infiammazione Modello
- Anestetizzare NCR topi nudi in una camera di induzione con il 1-2% isoflurano. Confermare l'anestesia generale per la perdita di movimento e una frequenza respiratoria costante. Trasferire un animale ad un cono in dotazione con gas isoflurano-mista e tenere l'animale in anestesia.
- Utilizzare un alcool isopropilico pulire da pulire e disinfettare il sito di iniezione sul fianco sinistro.
- Usando una tecnica sterile, iniettare 50 microlitri della soluzione di inoculazione PMA (contenente 50 mg di PMA) nello spazio sottocutaneo sul fianco sinistro. Rimuovere il liquido in eccesso dal sito di iniezione, utilizzando un tampone di alcool isopropilico. Evitare l'uso di analgesia in quanto può influenzare le risposte infiammatorie.
- Spostare l'animale torna alla gabbia abitazioni e monitorare attentamente il suo recupero dall'anestesia. Al fine di assistere nel recupero, utilizzare una piastra elettrica per mantenere l'animale caldo.
3. Sottocutaneo LPS Infiammazione Modello
- Anestetizzare C57BL/6J topi con il 1-2% isoflurano in una camera di induzione. Una volta che stabilisce l'anestesia generale, il trasferimento di un animale ad un cono in dotazione con gas isoflurano e tenere l'animale in anestesia.
- Usare un alcool isopropilico pulire per pulire il sito di iniezione sulla zampa sinistra.
- Usando una tecnica sterile, iniettare 50 microlitri della soluzione di inoculazione LPS (contenente 50 mg di LPS) nella zampa sinistra. Rimuovere il liquido in eccesso dal sito di iniezione, utilizzando un tampone di alcool isopropilico. Evitare l'uso di analgesia in quanto può influenzare le risposte infiammatorie.
- Spostare l'animale torna alla gabbia abitazioni e monitorare attentamente il suo recupero dall'anestesia. Utilizzare una piastra elettrica per mantenere il caldo degli animali durante il recupero.
4. Bioluminescenza di infiammazione
- Anestetizzare l'animale in una camera di induzione con 1-2% di gas isoflurano-mista. Confirm anestesia generale da perdita di movimento e una frequenza respiratoria costante.
- Mentre l'animale è ancora sotto anestesia, per via intraperitoneale (ip) iniettare la soluzione di luminol (10 mg / ml), oppure la soluzione lucigenina (2,5 mg / ml) per l'imaging infiammazione acuta o cronica, rispettivamente. Il dosaggio finale è 100 mg / kg per luminol e 25 mg / kg per lucigenina. Una dose inferiore di lucigenina (10-15 mg / kg) può essere utilizzata per evitare possibili tossicità per alcuni ceppi di topi. I segni di tossicità comprendono respiro corto e difficoltà respiratoria. Il ceppo C57BL/6J è inferiore lucigenina tollerabilità rispetto al ceppo nudo NCR.
- Trasferire l'animale nella camera di imaging di un sistema di imaging bioluminescenza.
- Eseguire l'imaging bioluminescenza sequenziale ad intervalli di 1 minuto. Ogni passo di imaging comprende 1 tempo di acquisizione min, f / stop = 1, binning = 16 e 0 secondi di ritardo.
- All'interno del pannello di acquisizione delle immagini, per consentire sequenziale di imaging multi-step, fare clic sulla sequenza di impostazione button. Fornire fasi di imaging sufficienti nel profilo di acquisizione per determinare l'uscita luminescenza massima (di solito 15 passi di un minuto sarà sufficiente). La sezione di imaging 15-min permette di tempo sufficiente per l'assorbimento del substrato e circolazione sistemica.
- Rimuovere l'animale dalla camera di imaging e spostarlo di nuovo la gabbia dell'alloggiamento. Al fine di assistere nel recupero, utilizzare una piastra elettrica per mantenere l'animale caldo.
- Durante l'analisi post-acquisizione, utilizzare il software di imaging per il calcolo del segnale bioluminescente totale di picco attraverso le regioni standardizzati di interesse (ROI). Le immagini sono presenti come radianza in fotoni / sec / cm 2 / sr con soglia minima e massima indicati. I dati quantitativi sono presentati come flusso totale di fotoni al secondo per il ROI.
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Representative Results
Abbiamo eseguito l'imaging bioluminescenza longitudinale per valutare l'infiammazione acuta e cronica in modelli sperimentali di infiammazione. Forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA) è una proteina potente chinasi C (PKC) agonista che attiva Phox per la produzione di anione superossido e innesca risposte infiammatorie acute intense 21. SC iniezione di 50 mg di PMA in NCR topi nudi ha causato una rapida irritazione e infiammazione acuta in siti di iniezione 18, 22, 23. Abbiamo eseguito l'imaging giorno per 4 giorni con le prime immagini ottenute già 3 ore dopo l'iniezione di PMA. Figura 1 ha dimostrato di imaging bioluminescenza longitudinale utilizzando luminol e lucigenina come substrati. Alle prime fasi di infiammazione (3 ore), abbiamo osservato significative bioluminescenza luminol che indica livelli elevati di attività MPO neutrofili nei siti di iniezione PMA. Nessun significativo bioluminescenza lucigenina è stata osservata durante queste prime fasi di infiammazione. A partire dalgiorno 2, si osserva formazione di crosta e l'intensità di luminescenza quindi ridotto. Come cicatrizzazione diventato evidente (Figura 1A, giorno 3 e 4), abbiamo osservato costante aumento bioluminescenza lucigenina (Figura 1B). Questi risultati illustrano che bioluminescenza luminol è associato con la fase acuta dell'infiammazione, mentre lucigenina bioluminescenza è strettamente associato con la riparazione tissutale nel tardo fasi di infiammazione.
Indipendentemente, abbiamo iniettato sc 50 mcg di lipopolisaccaride (LPS) nei cuscinetti plantari di tipo selvatico mice C57BL/6J, ed eseguito l'imaging bioluminescenza longitudinale per un massimo di 10 giorni (Figura 2A). LPS è un componente membrana dei batteri Gram-negativi. SC inoculazione di LPS è in grado di innescare risposte infiammatorie forti da attivazione del recettore TLR4 e successiva chemochine / citochine infiammatorie produzione 24. A differenza di PMA che attiva direttamente Phox per superossido production, LPS richiede un periodo di tempo più lungo per attivare completamente il tessuto infiltrante fagociti 18. I neutrofili sono i primi responders alla infezione microbo, abbiamo osservato elevata bioluminescenza luminol durante i primi 4 giorni di infiammazione acuta, che è diminuita dopo giorno 5 (Figura 2B). In contrasto, lucigenina bioluminescenza gradualmente aumentata nella fase tardiva e cronica di infiammazione (Figura 2B, giorni 5-10).
Insieme, questi risultati dimostrano la capacità di utilizzare differenziale specificità di substrato per distinguere le fasi infiammatorie acute e croniche. Soprattutto, l'imaging è mediata dalle attività enzimatiche endogene delle cellule immunitarie, e non vi è alcuna necessità di espressione ectopica di reporter.
Figura 1. In vivo bioluminescenza longitudinale fasi acute e tardive di infiammazione. strong> (A), abbiamo indotto l'infiammazione del tessuto locale da iniezione sottocutanea di 50 mg PMA, ed eseguito quotidianamente luminol (100 mg / kg, ip) e lucigenina (25 mg / kg, ip) bioluminescenza a partire da 3 ore dopo l'iniezione di PMA. Nessun significativo background auto-luminescenza è stata osservata nei siti di infiammazione senza agenti chemioluminescenti. (B) rappresentazione quantitativa della bioluminescenza luminol e lucigenina in siti di iniezione. Nella fase acuta dell'infiammazione, segnali luminol dominato l'uscita bioluminescenza (3 ore). Nelle fasi successive di infiammazione, i siti di iniezione erano superiori bioluminescenza lucigenina rispetto luminol (giorno 4). Le barre di errore rappresentano le deviazioni standard di misurazione bioluminescenza ad ogni tempo di imaging. Clicca qui per ingrandire la figura .
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Figura 2. (A) 50 mcg di LPS è stato iniettato sc nei briganti di topi C57BL/6J. Longitudinale di imaging bioluminescenza con il luminol e lucigenina sono stati eseguiti al giorno per 10 giorni. (B) rappresentazione quantitativa della bioluminescenza luminol e lucigenina in siti di iniezione LPS. Bioluminescenza Luminol è aumentato durante i primi 4 giorni di infiammazione acuta. Tuttavia, nelle fasi tardo / cronico di infiammazione, segnali luminol rapidamente ridotto e lucigenina bioluminescenza gradualmente aumentata. Le barre di errore rappresentano le deviazioni standard di misurazione bioluminescenza ad ogni tempo di imaging. Clicca qui per ingrandire la figura .
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Discussion
In questo rapporto, si dimostra un metodo bioluminescenza per l'imaging non invasivo di infiammazione negli animali viventi. Uso di due substrati luminescenti, luminol e lucigenina, il metodo può distinguere diverse fasi di infiammazione. Bioluminescenza luminol è associato neutrofili nella fase acuta dell'infiammazione, mentre lucigenina bioluminescenza è mediata dai macrofagi nella fase cronica. Relativamente piccolo (PM = 177.16 g / mol) e senza carica elettricamente, luminol può facilmente penetrare sia nel plasma e la membrana phagosomal 25-29. Inoltre, luminescenza luminol è specifico per l'attività MPO intracellulare in neutrofili 9. D'altra parte, lucigenina è principalmente membrana impermeabile a causa della sua maggiore dimensione (PM = 510.5 g / mol) e due cariche positive 25, 27-30.
Neutrofili e macrofagi assemblare il oloenzima Phox in diverse sedi subcellulari. Anche se entrambi i reagentidipenderà Phox fornire anione superossido (O 2 · -), la disparità nella permeabilità cellulare e MPO-dipendenza consente di differenziare i substrati fagociti infiammatorie in modelli di malattia. Neutrofili esprimono la maggior parte del Phox nella membrana di vescicole intracellulari (phagosomes) 14, in cui sono presenti anche alti livelli di MPO. Come risultato, luminol bioluminescenza è specificamente associata con neutrofili attivati durante l'infiammazione acuta. In contrasto, i macrofagi assemblano Phox nella membrana plasmatica come si infiltrano e maturano durante l'infiammazione cronica 15. Lucigenina non-permeabile può interagire direttamente con il superossido extracellulare generata dai macrofagi per produrre bioluminescenza infiammatoria cronica.
L'infiammazione è un processo complicato in vivo che richiede un adeguato coordinamento di molti tipi di cellule e varie molecole di segnalazione extracellulare. In questo rapporto il video, dimostriamo lauso sinergico di entrambi luminol e lucigenina, per monitorare (cronica) infiammazione fase acuta e tardiva in modelli animali. Poiché questi substrati sono commercialmente disponibili e relativamente poco costoso, crediamo che questo metodo di imaging relativamente semplice e robusta può essere facilmente tradotto in applicazioni in vivo in molte aree di malattia. Di nota, rispetto alle tecniche di imaging PET, MRI e nel vicino infrarosso (NIR) fluorescenti, il metodo chemiluminescente non è ideale per l'imaging dei tessuti profondi causa spettri di emissione blu substrati '. Per migliorare la penetrazione nei tessuti, è stato recentemente dimostrato che l'emissione chemiluminescenza blu può essere trasferito a nanoparticelle co-amministrati per NIR emissione 31. Ulteriore modifica delle loro strutture chimiche potenzialmente potrebbe migliorare la loro efficienza quantica di emissione di luce più forte e perfezionare il loro spettro di emissione per una più profonda penetrazione nei tessuti.
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Disclosures
Gli autori dichiarano assenza di conflitto di interesse in questo studio.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dal Nancy Lurie Marks Foundation. Ringraziamo il Dott. Nancy E. Kohl per la lettura critica del manoscritto. Ringraziamo Kin K. Wong per il suo aiuto nella preparazione di questo video report.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO | P8139 | |
| Lipopolysaccharide from Salmonella enterica serotype enteritidis | Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO | L2012 | |
| Luminol (5-amino-2,3-dihydro-1,4-phthalazinedione, sodium salt) | Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO | A4685 | |
| Lucigenin (bis-N-methylacridinium nitrate) | Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO | M8010 | |
| IVIS Spectrum imaging system with Living Imaging 4.2 software package | Caliper LS/Perkin Elmer, Hopkinton, MA |
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