Summary
Nós descrevemos um método de imagem não-invasivo para distinguir as fases inflamatórias. Administração sistêmica de luminol revela áreas de inflamação aguda dependentes atividade da MPO em neutrófilos. Em contraste, a injeção de lucigenina permite a visualização de inflamação crônica dependente de atividade Phox em macrófagos.
Abstract
A inflamação é um dos aspectos fundamentais de muitas doenças humanas. Neste relatório, vídeo, demonstramos técnicas de imagem de bioluminescência não-invasivos que distinguem a inflamação aguda e crônica em modelos do rato. Com o dano tecidual ou invasão do patógeno, os neutrófilos são a primeira linha de defesa, que joga um papel importante na mediação da resposta inflamatória aguda. À medida que a reacção inflamatória progride, monócitos circulantes migrar gradualmente para o local da lesão e diferenciam-se em macrófagos maduros, que medeiam a inflamação crónica e promover a reparação do tecido, removendo detritos do tecido e produzir citocinas anti-inflamatórias. A injecção intraperitoneal de luminol (,4-phthalazinedione, sal de sódio de l ,3-di-hidro-1 5-amino-2) permite a detecção de uma inflamação aguda largamente mediada por neutrófilos infiltrantes de tecidos. Luminol reage especificamente com o superóxido gerado dentro dos phagosomes de neutrófilos pois os resultados de uma bioluminescência mieloperoxidase (MPO) reacção mediada. Lucigenina (bis-N-metilacridinio nitrato) também reage com o superóxido para gerar bioluminescência. No entanto, lucigenina bioluminescência é independente da MPO e só depende de NADPH oxidase de fagócitos (Phox) em macrófagos durante a inflamação crônica. Juntos, luminol e lucigenina permitir a visualização não invasiva e avaliação longitudinal de diferentes populações de fagócitos em todo fases inflamatórias agudas e crônicas. Dado o papel importante da inflamação numa variedade de doenças humanas, acreditamos que este método de imagem não invasiva pode ajudar a investigar os diferentes papéis de neutrófilos e macrófagos, em uma variedade de condições patológicas.
Introduction
A inflamação é uma resposta biológica altamente regulado envolvida numa variedade de doenças humanas, incluindo uma infecção microbiana, a cicatrização de feridas 2, 3 diabetes, câncer 4, 5 cardiovascular, neurodegenerativa, 6, 7 e as doenças auto-imunes. Inflamação de tecidos requer a coordenação adequado de diversas células imunes, a fim de obter a aprovação do patógeno, reparação de tecidos, e a resolução da doença. Neutrófilos e macrófagos são mediadores imunes chaves de inflamação de tecidos. Na fase aguda da inflamação, os neutrófilos são os primeiros socorros para vários estímulos nocivos, e danos no tecido 8. Os neutrófilos extravasar rapidamente da circulação para o local da lesão, onde as células inactivar micróbios invasores, liberando grânulos anti-microbianos e fagocitose. Durante a fagocitose, neutrófilos absorvem micróbios invasores para fagossomas, dentro do qual as células produzem níveis elevados de Superoxide (O 2 · -). Superóxido phagosomal é a principal fonte de muitas espécies reativas de oxigênio a jusante (ROS). Por exemplo, pode ser dismutadas superóxido em peróxido de hidrogénio (H 2 O 2) por dismutação espontânea ou pela superóxido dismutase (SOD), 9, 10. Em neutrófilos, mieloperoxidase (MPO) converte mais de peróxido de hidrogénio em ácido hipocloroso anti-microbiana (HOCl) 11. À medida que as respostas inflamatórias continuar, monócitos circulantes migrar gradualmente para o local da lesão e diferenciam-se em macrófagos maduros 2, cuja função fagocítica ajudar a remover agentes patogénicos inactivadas e restos celulares. Além disso, como um regulador chave na fase tardia da inflamação, macrófagos promove a reparação de tecidos, produzindo citocinas anti-inflamatórias 12 e por meio da geração de ROS extracelular a um nível inferior 9. O ROS gerados nesta fase depois regulam a remodelação do tecido, formação de novos vasos, e reepithelialização 13.
Fagocitário NADPH oxidase (Phox) é a fonte primária de produção de superóxido em neutrófilos e macrófagos 9. Phox é um complexo de múltiplas subunidades, cujo conjunto é fortemente regulada 9. O holoenzyme contém várias subunidades reguladoras citosólicas (phox p67, p47 phox, p40 phox e RAC) e uma ligada à membrana heterodímero citocromo b 558 (composto de subunidade CYBA e CYBB). O citocromo b 558 é o núcleo de reacção dentro do qual a subunidade CYBB (também conhecida como p91 e NOX2 phox) realiza a reacção em cadeia redox primário 9. Curiosamente, os seus locais de montagem são diferentes entre os neutrófilos e macrófagos. Em neutrófilos em repouso, citocromo b 558 é mais presente na membrana dos grânulos de armazenamento intracelular 14. Durante a fagocitose, os neutrófilos montar o holoenzymes em phagosomes 9, onde altos níveis de atividade MPO também estão presentes. O neutrófilo Phox consome rapidamente oxigênio e exerce seu poder microbicida pela produção de ROS, um fenômeno denominado explosão respiratória 11. Em contraste, os macrófagos possuem um nível mais baixo de expressão de MPO e citocromo b 558 é encontrado principalmente na membrana de plasma 15, 16. Assim, os neutrófilos produzir altos níveis de superóxido para a actividade anti-microbiana, ao passo que os macrófagos produzem menos superóxido para as funções de regulação 15.
Uma vez que a inflamação é uma intrincada processo in vivo, métodos de imagem não invasivos específicos para as diferentes fases de inflamação permitiria a avaliação quantitativa e longitudinais de modelos de doenças. Utilizando estudos mecanicistas, já anteriormente demonstrado o uso de dois agentes quimioluminescentes, luminol (5-amino-2 ,3-di-hidro-1 ,4-phthalazinedione) e lucigenina (bis-N-metilacridinio nitrato), Para a imagem não-invasivo de fase aguda e tardia (crônica) de inflamação, respectivamente 17. Luminol permite a visualização da actividade de MPO de neutrófilos durante a fase aguda da inflamação, 18-20, ao passo que a bioluminescência lucigenina pode ser usado para avaliar a actividade dos macrófagos, em associação com a fase tardia da inflamação crónica ou 17. Neste manuscrito, foram utilizados dois modelos de inflamação experimentais (sc sc PMA e LPS) para demonstrar as técnicas de imagem.
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Protocol
Nota: Todos os estudos com animais foram realizados sob protocolos institucionais aprovados e orientações de cuidados com animais.
1. Reagentes e Soluções
- Solução PMA sc para inoculação: Prepara-se uma solução de estoque de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA), a 5 mg / ml em DMSO. Armazene a solução de reserva, a -20 ° C. Antes da inoculação, descongelar a solução estoque e diluir a 1 mg / ml de PMA, em PBS.
- Solução de LPS para inoculação sc: Dissolver lipopolissacarídeo (LPS de Salmonella enterica serotipo enteritidis) em PBS estéril a 1 mg / mL antes da inoculação sc.
- Solução de luminol para imagiologia de fase aguda: Dissolver o luminol (,4-phthalazinedione, sal de sódio de 5-amino-2 ,3-di-hidro-1) em solução salina normal estéril (0,9% de NaCl) a 10 mg / ml. A solução pode ser armazenada a -20 ° C antes da utilização.
- Lucigenina solução para a imagem latente fase crônica: Dissolver lucigenina (bis-N-metilacridinio nitrato) em soro fisiológico estérilde 2,5 mg / ml. A solução pode ser armazenada a -20 ° C antes da utilização.
2. Subcutânea PMA Inflamação Modelo
- Anestesiar NCR camundongos nus em uma câmara de indução com 1-2% de isoflurano. Confirme a anestesia geral pela perda de movimento e uma freqüência respiratória constante. Transferência de um animal a um cone de nariz alimentado com gás isoflurano-misturada e manter o animal sob anestesia.
- Use um álcool isopropílico limpar de limpar e desinfectar o local da injecção no flanco esquerdo.
- Utilizando uma técnica estéril, injecta-se 50 ul da solução de inoculação PMA (contendo 50 ug de PMA) no espaço subcutâneo no flanco esquerdo. Retire o excesso de fluido no local da injeção, usando uma compressa embebida em álcool isopropílico. Evite o uso de analgesia, pois pode afetar respostas inflamatórias.
- Coloque o animal de volta para a jaula habitação e acompanhar de perto a sua recuperação da anestesia. A fim de ajudar na recuperação, utilizar uma almofada de aquecimento para manter o animal quente.
3. Subcutânea LPS Inflamação Modelo
- Anestesiar camundongos C57BL/6J com 1-2% de isoflurano em uma câmara de indução. Uma vez que estabelece a anestesia geral, a transferência de um animal a um cone de nariz alimentado com gás isoflurano e manter o animal sob anestesia.
- Use um álcool isopropílico limpar para limpar o local de injecção na pata esquerda.
- Utilizando uma técnica estéril, injecta-se 50 ul da solução de inoculação de LPS (contendo 50 ug de LPS) na pata traseira esquerda. Retire o excesso de fluido no local da injeção, usando uma compressa embebida em álcool isopropílico. Evite o uso de analgesia, pois pode afetar respostas inflamatórias.
- Coloque o animal de volta para a jaula habitação e acompanhar de perto a sua recuperação da anestesia. Use uma almofada de aquecimento para manter o aquecimento de animais durante a recuperação.
4. Bioluminescência imagem de Inflamação
- Anestesiar o animal em uma câmara de indução com 1-2% de gás isoflurano misturado. Confirm anestesia geral pela perda de movimento e uma freqüência respiratória constante.
- Enquanto o animal está ainda sob anestesia, por via intraperitoneal (ip) injectar a solução de luminol (10 mg / ml), ou a solução de lucigenina (2,5 mg / ml) para a imagem da inflamação aguda ou crónica, respectivamente. A dose final é de 100 mg / kg para o luminol e 25 mg / kg para lucigenina. Uma dose mais baixa de lucigenina (10-15 mg / kg) pode ser usado para evitar a possível toxicidade para algumas estirpes de ratinho. Os sinais de toxicidade incluem falta de ar e desconforto respiratório. A cepa C57BL/6J tem menor lucigenina tolerabilidade do que a cepa nu NCr.
- Transferir o animal na câmara de imagem de um sistema de imagem de bioluminescência.
- Realize imagem de bioluminescência seqüencial em intervalos de 1 min. Cada passo de imagem é composto por um tempo de aquisição min, m / paragem = 1, 16 e binning = 0 seg atraso.
- Dentro do painel de aquisição da imagem, para permitir imagens de várias etapas sequenciais, clique na seqüência de configuração button. Fornecer etapas de imagem suficientes no perfil de aquisição para determinar a saída luminescência máxima (geralmente 15 passos de um minuto será suficiente). A secção de imagem de 15 min permite tempo suficiente para a absorção do substrato e circulação sistémica.
- Remover o animal da câmara de imagem e movê-lo de volta para a jaula habitação. A fim de ajudar na recuperação, utilizar uma almofada de aquecimento para manter o animal quente.
- Durante a análise pós-aquisição, usar o pacote de software de imagem para calcular o pico de sinal bioluminescente total por regiões padronizadas de interesse (ROI). As imagens estão presentes como radiação em fótons / seg / cm 2 / sr com limite mínimo e máximo indicados. Os dados quantitativos são apresentados como fluxo total de fótons por segundo por ROI.
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Representative Results
Realizamos imagem de bioluminescência longitudinal para avaliar a inflamação aguda e crônica em modelos experimentais de inflamação. De forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) é um agonista de quinase C da proteína potente (PKC), que activa Phox para a produção de aniões de superóxido e desencadeia respostas inflamatórias agudas intensas 21. SC injeção de 50 mg de PMA na NCR camundongos nude causou irritação rápido da pele e inflamação aguda no local da injeção 18, 22, 23. Realizou imagiologia por dia durante 4 dias, com as primeiras imagens obtidos tão cedo quanto três horas após a injecção de PMA. Figura 1 demonstraram a imagem de bioluminescência longitudinal, utilizando luminol como substratos e lucigenina. Em estágios iniciais de inflamação (3 h), observou-se a bioluminescência de luminol significativa, indicando níveis elevados de actividade de MPO de neutrófilos nos locais da injecção de PMA. Não foi observada a bioluminescência lucigenina significativa durante estas fases iniciais de inflamação. Começandodia 2, observou-se a formação de crosta e, portanto, reduziram a intensidade da luminescência. A cicatrização da ferida se tornou aparente (Figura 1A, dia 3 e 4), observou-se aumento constante na bioluminescência lucigenina (Figura 1B). Estes resultados ilustram que o luminol bioluminescência é associado com a fase aguda da inflamação, enquanto lucigenina bioluminescência está intimamente associado com a reparação de tecidos nas fases tardias da inflamação.
Independentemente, que injectado sc 50 ug de lipopolissacárido (LPS) na pata de ratinhos C57BL/6J de tipo selvagem, e realizada de imagem de bioluminescência longitudinal de até 10 dias (Figura 2A). LPS é um componente da membrana das bactérias Gram-negativas. SC inoculação de LPS é capaz de desencadear respostas inflamatórias fortes TLR4 por activação do receptor de quimiocina e subsequente / produção de citoquinas inflamatórias 24. Ao contrário de PMA que ativa diretamente Phox para productio superóxidon, LPS requer um longo período de tempo para ativar completamente o tecido infiltrando fagócitos 18. Como os neutrófilos são os primeiros respondedores a infecção micróbio, foi observada elevada bioluminescência luminol durante os primeiros 4 dias de inflamação aguda, que diminuiu após 5 dias (Figura 2B). Em contraste, a bioluminescência lucigenina gradualmente aumentada na fase tardia da inflamação crónica e (Figura 2B, dias 5-10).
Juntos, estes resultados demonstram a capacidade de utilizar a especificidade do substrato diferencial para distinguir as fases inflamatórias agudas e crónicas. Importante, imagiologia é mediado pelas actividades enzimáticas endógenas das células do sistema imunológico, e não há necessidade para a expressão ectópica de repórteres.
Figura 1. In vivo de imagens de bioluminescência longitudinal da fase aguda e tardia da inflamação. strong> (A), foi induzida a inflamação do tecido local, por via subcutânea, de 50 ng de PMA e realizada diariamente de luminol (100 mg / kg, ip) e lucigenina (25 mg / kg, ip), imagiologia bioluminescente começando às 3 horas após a injecção de PMA. Nenhuma fundo significativa auto-luminescência foi observada em locais de inflamação sem agentes quimioluminescentes. (B) representação quantitativa da bioluminescência luminol e lucigenina em locais de injecção. Na fase aguda da inflamação, os sinais de saída do luminol dominado bioluminescência (3 h). Nos estágios mais avançados da inflamação, os locais de injeção teve maior bioluminescência lucigenina comparação com luminol (dia 4). As barras de erro representam os desvios-padrão das medições de bioluminescência em cada ponto de tempo de imagem. Clique aqui para ver a figura maior .
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Figura 2. (A), 50 ug de LPS foi injectado sc em almofadas das patas de ratos C57BL/6J. Imagem de bioluminescência longitudinal com luminol e lucigenina foram realizadas diariamente durante 10 dias. (B) representação quantitativa da bioluminescência luminol e lucigenina em locais de injecção de LPS. Bioluminescência Luminol aumentou durante os primeiros 4 dias de inflamação aguda. No entanto, nas fases tardias / crônico de inflamação, os sinais de luminol rapidamente diminuiu e bioluminescência lucigenina aumentada gradualmente. As barras de erro representam os desvios-padrão das medições de bioluminescência em cada ponto de tempo de imagem. Clique aqui para ver a figura maior .
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Discussion
Neste relatório, nós demonstramos um método de bioluminescência de imagem não invasivo da inflamação em animais vivos. Aproveitando os dois substratos luminescentes, o luminol e lucigenina, o método pode distinguir diferentes fases de inflamação. Bioluminescência luminol está associada com neutrófilos na fase aguda da inflamação, enquanto a bioluminescência lucigenina é mediada pelos macrófagos na fase crónica. Relativamente pequenas (PM = 177,16 g / mol) e electricamente carregadas, o luminol pode facilmente penetrar tanto no plasma como phagosomal membrana 25-29. Além disso, a luminescência luminol é específico para a actividade de MPO em neutrófilos intracelular 9. Por outro lado, é principalmente lucigenina membrana impermeável, devido ao seu maior tamanho (peso molecular = 510,5 g / mol) e duas cargas positivas 25, 27-30.
Neutrófilos e macrófagos montar a holoenzima Phox em diferentes localizações subcelulares. Embora ambos os reagentesdependem Phox para proporcionar o anião superóxido (O2 · -), a disparidade de permeabilidade celular e a MPO-dependência permite que os substratos para diferenciar fagócitos inflamatórias em modelos de doenças. Os neutrófilos expressam mais do Phox na membrana de vesículas intracelulares (phagosomes) 14, onde os altos níveis de MPO também estão presentes. Como resultado, o luminol bioluminescência é especificamente relacionado com neutrófilos activados durante a inflamação aguda. Em contraste, os macrófagos montar Phox na membrana do plasma porque infiltrado e amadurecer durante a inflamação crónica 15. Lucigenina não-permeável pode interagir diretamente com o superóxido extracelular gerado por macrófagos a produzir bioluminescência inflamatória crônica.
A inflamação é um complicado processo in vivo, que requer uma boa coordenação de muitos tipos celulares e várias moléculas de sinalização extracelulares. Neste relatório vídeo, demonstramos osinérgica da utilização tanto de luminol e lucigenina, para monitorizar a inflamação da fase aguda e tardia (crónica) em modelos animais. Dado que estes substratos estão comercialmente disponíveis e relativamente baratos, acreditamos que este método de imagem relativamente simples e robusto pode ser facilmente convertidos para as aplicações in vivo, em muitas áreas de doença. De notar que, em comparação com técnicas de imagem de ressonância magnética e PET do infravermelho próximo (NIR) fluorescentes, o método quimioluminescente não é ideal para imagens de tecidos profundos, devido à emissão de espectro azul substratos. Para melhorar a penetração do tecido, tem sido recentemente demonstrado que a emissão de quimiluminescência azul pode ser transferida para as nanopartículas de co-administrados para NIR de emissão 31. Além disso modificação de suas estruturas químicas potencialmente poderiam melhorar a sua eficiência quântica para a saída de luz mais forte e refinar seus espectros de emissão de penetração nos tecidos mais profundos.
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Disclosures
Os autores declaram que não há conflito de interesse neste estudo.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nancy Lurie Marks. Agradecemos a Dra. Nancy E. Kohl para a leitura crítica do manuscrito. Agradecemos K. Wong Kin por sua ajuda na preparação deste relatório vídeo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO | P8139 | |
| Lipopolysaccharide from Salmonella enterica serotype enteritidis | Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO | L2012 | |
| Luminol (5-amino-2,3-dihydro-1,4-phthalazinedione, sodium salt) | Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO | A4685 | |
| Lucigenin (bis-N-methylacridinium nitrate) | Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO | M8010 | |
| IVIS Spectrum imaging system with Living Imaging 4.2 software package | Caliper LS/Perkin Elmer, Hopkinton, MA |
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