Summary
Мы описываем неинвазивного метода визуализации для различения воспалительных стадиях. Системной доставки люминолом показывает областях острого воспаления зависит от активности МПО в нейтрофилах. В противоположность этому, инъекция люцигенином позволяет выводить хронического воспаления зависит от Phox активность макрофагов.
Abstract
Воспаление является фундаментальным аспектом многих заболеваний человека. В этом видео отчет, мы демонстрируем неинвазивных методов визуализации биолюминесценции, которые отличают острого и хронического воспаления в мышиных моделях. С повреждением ткани или патогена вторжения, нейтрофилы являются первой линией обороны, играют важную роль в посредничестве острой воспалительной реакции. Как воспалительная реакция прогрессирует, циркулирующих моноцитов постепенно мигрируют в место повреждения и дифференцироваться в зрелые макрофаги, являющиеся посредниками хроническое воспаление и способствовать восстановлению тканей, удаляя ткани мусора и производство противовоспалительных цитокинов. Внутрибрюшинной инъекции люминол (5-амино-2 ,3-дигидро-1 ,4-фталазиндион, натриевой соли) позволяет обнаруживать острого воспаления в значительной степени опосредованы ткани проникновения нейтрофилов. Люминол специфически реагирует с супероксид генерируется в фагосомами нейтрофилов с биолюминесценции результаты миелопероксидазы (МPO) опосредованной реакции. Люцигенином (бис-N-methylacridinium нитрат) также вступает в реакцию с супероксид для того, чтобы генерировать биолюминесценции. Тем не менее, люцигенин биолюминесценции не зависит от МПО и это исключительно зависит от фагоцитарной NADPH оксидазы (Phox) в макрофагах при хроническом воспалении. Вместе люминол и люцигенином позволяет неинвазивной визуализации и продольный оценки различных популяций на фагоцитарную как острых, так и хронических воспалительных фаз. С учетом важной роли воспаления в различных заболеваний человека, мы считаем, что это неинвазивный метод визуализации может помочь исследовать дифференциальные роли нейтрофилов и макрофагов в различных патологических состояниях.
Introduction
Воспаление является строго регулируется биологической реакции участвуют в различных заболеваний человека, в том числе микробной инфекции 1, заживление ран 2, диабет 3, 4 рак, сердечно-сосудистые 5, 6 нейродегенеративных и аутоиммунных заболеваний 7. Воспаление тканей требует надлежащей координации различных иммунных клеток в целях достижения возбудителя оформление, восстановления тканей, и болезнь разрешение. Нейтрофилы и макрофаги являются ключевыми медиаторами иммунного воспаления тканей. В острой фазе воспаления, нейтрофилы первыми отвечают различным вредным воздействиям и повреждение тканей 8. Нейтрофилов быстро вытекать из сосудов в ткань из обращения в месте повреждения, где клетки инактивировать вторжения микробов путем освобождения антимикробные гранул и фагоцитоза. Во фагоцитоз, нейтрофилы поглотить вторжения микробов в фагосомами, в течение которой клетки продуцируют высокие уровни СуперОксIDE (O 2 · -). Phagosomal супероксид является основным источником многих вниз по течению активных форм кислорода (АФК). Например, супероксид может быть dismutated в перекись водорода (H 2 O 2) спонтанное дисмутация или супероксиддисмутаза (SOD), 9, 10. В нейтрофилы, миелопероксидазы (MPO) дальнейшее преобразует перекиси водорода к антимикробным хлорноватистой кислоты (HOCl) 11. Как воспалительные реакции продолжаются, циркулирующих моноцитов постепенно мигрируют в место повреждения и дифференцироваться в зрелые макрофаги 2, чья фагоцитарной функции помогают удалить инактивированных патогенных микроорганизмов и клеточных обломков. Кроме того, в качестве ключевого регулятора в поздней фазе воспаления, макрофагов способствует восстановлению тканей, производя противовоспалительных цитокинов и 12, генерируя внеклеточный ROS на более низком уровне 9. АФК образуются в этой поздней стадии регулируют ремоделирования ткани, образование новых кровеносных и reepitheliaлизации 13.
НАДФН-оксидазы фагоцитов (Phox) является основным источником супероксида в обоих нейтрофилов и макрофагов 9. Phox является мульти-субъединицы комплекса, сборка жестко регулируется 9. Холоферментом содержит несколько цитозольные регуляторных субъединиц (P67 Phox, Phox p47, p40 Phox и RAC) и связанный с мембраной гетеродимером цитохрома Ь 558 (состоит из субъединицы CYBA и CYBB). Цитохром б 558 является реакция ядро, в которой субъединицы CYBB (также известный как p91 Phox и NOX2) осуществляет первичный окислительно-восстановительной реакции цепи 9. Интересно, что свои сайты сборки отличаются между нейтрофилов и макрофагов. В состоянии покоя нейтрофилы, цитохрома Ь 558, в основном, присутствующего в мембране внутриклеточных гранул хранения 14. В процессе фагоцитоза, нейтрофилы собрать чoloenzymes в фагосомами 9, где высокий уровень активности МПО также присутствуют. Нейтрофилов Phox быстро потребляет кислород и оказывает свое бактерицидное власти продукции АФК, явление называется респираторный взрыв 11. Напротив, макрофаги, имеют более низкий уровень экспрессии и MPO цитохрома б 558 встречается в основном в плазматической мембране 15, 16. Таким образом нейтрофилы продуцируют высокие уровни супероксид на антимикробную активность, в то время как макрофаги вырабатывают меньше супероксид для регулирующих функций 15.
Поскольку воспаление является сложной в процессе естественных условиях, неинвазивные методы визуализации специфичны для разных фаз воспаления позволит количественных и продольной оценки модели заболеваний. Использование механистических исследований, ранее мы показали, использование двух хемилюминесцентного вещества, люминол (5-амино-2 ,3-дигидро-1 ,4-фталазиндион) и люцигенином (бис-N-methylacridinium нитрат), Для неинвазивной визуализации острых и поздних (хронических) стадиях воспаления, соответственно 17. Люминол позволяет визуализировать нейтрофилов активности МПО в острой фазе воспаления 18-20, в то время как люцигенин биолюминесценции может быть использован для оценки активности макрофагов в связи с поздней стадии хронического воспаления или 17. В этой рукописи, мы использовали два экспериментальных моделей воспаления (PMA SC и SC LPS), чтобы продемонстрировать эти методы визуализации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Примечание: Все исследования на животных проводились в рамках утвержденных институциональных протоколов и руководств по уходу за животными.
1. Реагенты и растворы
- PMA решение для подкожно прививки: Подготовка исходного раствора форбол-12-миристат-13-ацетатом (РМА) в дозе 5 мг / мл в ДМСО. Хранить раствор при -20 ° C. Перед посевом таять исходного раствора и разбавляют до 1 мг / мл в PBS PMA.
- LPS решение для подкожно прививки: растворите липополисахарида (LPS из Salmonella enterica серотипа Enteritidis) в стерильном PBS при концентрации 1 мг / мл до подкожно прививки.
- Люминол решение для острой фазы изображения: растворите люминол (5-амино-2 ,3-дигидро-1 ,4-фталазиндион, натриевая соль) в стерильном физиологическом растворе (0,9% NaCl) при концентрации 10 мг / мл. Раствор можно хранить при -20 ° C перед использованием.
- Люцигенин решение для визуализации хронической фазе: Растворите люцигенин (бис-N-methylacridinium нитратов) в стерильном физиологическом растворепри дозе 2,5 мг / мл. Раствор можно хранить при -20 ° C перед использованием.
2. Подкожный PMA Воспаление модели
- Обезболить NCr голым мышам в индукционной камера с 1-2% изофлурана. Подтвердите общей анестезии потеря движения и постоянная частота дыхания. Передача животного на носовой конус поставляется изофлураном перемешанные газ и держать животных под наркозом.
- Используйте изопропиловый спирт протрите чистить и дезинфицировать место инъекции на левом фланге.
- С помощью стерильной техники, вводят 50 мкл раствора PMA прививки (содержащей 50 мкг PMA) в подкожное пространство на левом боку. Удалить избыток жидкости из места инъекции с использованием изопропилового спирта площадку. Избегать использования обезболивание, как это может влиять на воспалительные реакции.
- Переместить животное обратно к корпусу клетку и внимательно следить его выхода из наркоза. В целях оказания помощи в восстановлении, использовать грелку держать животное тепло.
3. Подкожный LPS Воспаление модели
- Обезболить C57BL/6J мышей с 1-2% изофлурана в индукционной камере. После создания общей анестезии, передать животному носовой конус поставляется изофлураном газа и держать животное под наркозом.
- Используйте изопропиловый спирт для очистки протрите место инъекции на левой лапы.
- С помощью стерильной техники, вводят 50 мкл раствора LPS прививки (содержащей 50 мкг ЛПС) в левую лапу. Удалить избыток жидкости из места инъекции с использованием изопропилового спирта площадку. Избегать использования обезболивание, как это может влиять на воспалительные реакции.
- Переместить животное обратно к корпусу клетку и внимательно следить его выхода из наркоза. Используйте грелку держать животное теплой во время восстановления.
4. Биолюминесценции изображений воспаления
- Анестезию животных в индукционной камере с 1-2% изофлуран смешанного газа. Confirm общей анестезии потеря движения и постоянная частота дыхания.
- В то время как животное все еще находится под анестезией, интраперитонеально (внутрибрюшинно) вводят люминол раствора (10 мг / мл), либо люцигенином раствор (2,5 мг / мл) в течение острое или хроническое воспаление изображений, соответственно. Конечный доза 100 мг / кг в течение люминол и 25 мг / кг в течение люцигенином. Низкие дозы люцигенином (10-15 мг / кг) может быть использован, чтобы избежать возможной токсичности некоторых линий мышей. Признаки токсичности включают одышку и дыхательной недостаточности. Штамм C57BL/6J имеет более низкую, чем переносимость люцигенин NCr обнаженной напряжения.
- Передача животных в изображения камеры системы визуализации биолюминесценции.
- Выполнять последовательные изображений биолюминесценции с интервалом в 1 мин. Каждый шаг визуализации состоит из 1 раз приобретении мин, F / стоп = 1, биннинге = 16 и 0 сек задержки.
- В панели захвата изображений, с тем чтобы последовательного многоступенчатого изображений, нажмите на последовательность установки BUTton. Обеспечить достаточный шаги изображений в приобретении профилем для определения максимальным выходным люминесценции (обычно 15 одну минуту шагов будет достаточно). 15 мин изображений раздел позволяет достаточно времени для поглощения подложки и системный кровоток.
- Удалить животное от изображения камеры и переместить его обратно в корпус клетке. В целях оказания помощи в восстановлении, использовать грелку держать животное тепло.
- Во время после приобретения анализа, используйте пакет изображений программное обеспечение для расчета пика Всего биолюминесцентными сигнал через стандартизированные области интереса (ROI). Изображения присутствуют в виде сияния в фотон / сек / см 2 / SR с минимальным и максимальным порогом указано. Количественные данные представлены в виде общего потока в фотонов в секунду на ROI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы провели продольное изображение биолюминесценции для оценки острых и хронических воспалений в экспериментальных моделях воспаления. Форбола 12-миристат-13-ацетатом (РМА) является сильнодействующим протеинкиназы С (РКС), агонист, который активирует Phox для супероксида аниона и вызывает интенсивный острой воспалительной реакции 21. SC инъекции 50 мг PMA в NCr голых мышей привело к быстрому раздражению кожи и острое воспаление в местах инъекций 18, 22, 23. Мы проводили ежедневно изображений течение 4 дней с первого изображения, полученные в начале 3 ч после инъекции PMA. Рисунок 1 продемонстрированы продольной изображений биолюминесценции использованием люминол и люцигенином в качестве субстратов. На ранних стадиях воспаления (3 ч) наблюдались значительные люминол биолюминесценции указывает высокий уровень активности нейтрофилов МРО в местах инъекций PMA. Никаких значительных биолюминесценции люцигенином не наблюдалось в течение этих ранних стадиях воспаления. Начиная с2-й день мы наблюдали образование парши и, следовательно, уменьшить интенсивность люминесценции. Как заживление ран стала очевидной (рис. 1А, день 3 и 4), мы наблюдали устойчивый рост люцигенин биолюминесценции (рис. 1В). Эти результаты показывают, что люминол биолюминесценции связан с острой фазы воспаления, тогда как люцигенином биолюминесценции тесно связано с восстановление ткани в конце фазы воспаления.
Независимо от этого, мы подкожно вводили 50 мкг липополисахарида (ЛПС) в подушечки лап дикого типа мышей C57BL/6J и выполнены продольные изображений биолюминесценции в течение 10 дней (фиг. 2А). LPS представляет собой мембранный компонент грамотрицательных бактерий. SC инокуляции ЛПС способны вызвать сильную воспалительную реакцию путем активации рецептора TLR4 и последующего воспалительного хемокина / продукции цитокинов 24. В отличие от PMA который непосредственно активирует Phox для супероксид Производство ип ЛПС требует более длительного периода времени, чтобы полностью активировать ткань проникают фагоцитов 18. Как нейтрофилы начале реагирующих на микроб инфекции мы наблюдали повышенный люминол биолюминесценции в течение первых 4-х дней острого воспаления, которые снизились после 5-й день (фиг. 2В). В противоположность этому, люцигенин биолюминесценции постепенно увеличивается в конце и хронической фазе воспаления (рис. 2В, 5-10 дней).
В совокупности эти результаты демонстрируют способность использовать специфичность субстрата дифференциальный различать острые и хронические воспалительные стадии. Важно отметить, что изображение опосредуется эндогенными ферментативной активности клеток иммунной, и нет никакой необходимости в эктопической экспрессии репортеров.
Рисунок 1. В естественных изображений биолюминесценции продольной острой и поздней фазы воспаления. сильная> (А) Мы индуцированного местное воспаление ткани подкожной инъекции 50 мкг PMA, и проводили ежедневно люминол (100 мг / кг, внутрибрюшинно) и люцигенина (25 мг / кг, внутрибрюшинно) биолюминесценции изображения, начиная с 3 ч после инъекции PMA. Никаких существенных фоне авто-люминесценция не наблюдается на участках воспаления хемилюминесцентными без агентов. (B) Количественное представление люминолом и люцигенин биолюминесценции местах инъекций. В острой фазе воспаления, люминолом преобладают сигналы биолюминесценции выход (3 ч). На более поздних стадиях воспаления, сайты инъекции были выше люцигенином биолюминесценции по сравнению с люминол (день 4). Столбики ошибок обозначают стандартные отклонения биолюминесценции измерений в каждой точке времени изображения. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
690fig2.jpg "/>
Рисунок 2. (A) 50 мкг ЛПС вводили подкожно в подушечки лап мышей C57BL/6J. Продольные изображений биолюминесценции с люминол и люцигенином проводили ежедневно в течение 10 дней. (B) Количественный представление люминол и люцигенином биолюминесценции на участках инъекции LPS. Люминол биолюминесценции увеличилось в течение первых 4 дней острого воспаления. Тем не менее, в конце / хронической фазе воспаления, люминолом сигналы быстро снизились и люцигенин биолюминесценции постепенно увеличивается. Столбики ошибок обозначают стандартные отклонения биолюминесценции измерений в каждой точке времени изображения. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом докладе мы демонстрируем биолюминесценции метод неинвазивной визуализации воспаления в живых животных. Преимущества двух люминесцентные субстраты, люминол и люцигенином, способ может различать различные фазы воспаления. Люминол биолюминесценции связан с нейтрофилов в острой фазе воспаления, тогда как люцигенин биолюминесценции опосредовано макрофагов в хроническую фазу. Относительно небольшие (М = 177,16 г / моль) и электрически незаряженных, люминол может легко проникать как в плазме и phagosomal мембрана 25-29. Кроме того, люминол люминесценции является специфичным для внутриклеточная активность МРО в нейтрофилах 9. С другой стороны, люцигенином в основном непроницаемой мембраны из-за его больших размеров (MW = 510,5 г / моль) и двумя положительными зарядами 25, 27-30.
Нейтрофилы и макрофаги собрать Phox холофермент в различных субклеточных местах. Хотя оба реагентовзависит от Phox обеспечить супероксид анион (О 2 · -), различия в клеточной проницаемости и MPO-зависимость позволяет субстратов дифференцировать воспалительные заболевания фагоцитов в моделях. Нейтрофилы выражают большую часть Phox в мембране внутриклеточной везикулы (фагосомами) 14, где высокие уровни MPO также присутствуют. В результате люминол биолюминесценции конкретно связанные с активированными нейтрофилами при острых воспалений. Напротив, макрофаги собрать Phox в плазматической мембране, как они проникают и созревания при хроническом воспалении 15. Непроницаемыми люцигенин могут непосредственно взаимодействовать с внеклеточной супероксид порожденных макрофагов производить хронические воспалительные биолюминесценции.
Воспаление является сложным в естественных условиях процесс, который требует должной координации многих типах клеток и различных внеклеточных сигнальных молекул. В этом видео отчет, мы демонстрируемсинергического использования и люминол и люцигенином, следить за острой и поздней (хроническое) фазы воспаления на животных моделях. Так как эти субстраты являются коммерчески доступными и относительно недороги, мы считаем, что это относительно простой и надежный метод визуализации может быть легко переведен в естественных применение во многих областях медицины. Следует отметить, что по сравнению с ПЭТ, МРТ и ближнем инфракрасном (NIR) флуоресцентные методы визуализации, хемилюминесцентными метод не подходит для глубокого изображения ткани из-за синего спектров излучения подложки. Для улучшения проникновения в ткани, недавно было показано, что синее излучение хемилюминесценции могут быть переданы совместно вводимого наночастиц для ближней ИК излучение 31. Дальнейшие изменения их химической структуры потенциально повышает их квантовую эффективность для более сильного светового потока и совершенствовать свои спектры излучения для более глубокого проникновения в ткани.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют никакого конфликта интересов в данном исследовании.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Нэнси Лурье Marks Foundation. Мы благодарим доктора Нэнси Е. Коль за критическое прочтение рукописи. Мы благодарим К. Кин Вонг за помощь в подготовке этого видео отчет.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO | P8139 | |
| Lipopolysaccharide from Salmonella enterica serotype enteritidis | Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO | L2012 | |
| Luminol (5-amino-2,3-dihydro-1,4-phthalazinedione, sodium salt) | Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO | A4685 | |
| Lucigenin (bis-N-methylacridinium nitrate) | Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO | M8010 | |
| IVIS Spectrum imaging system with Living Imaging 4.2 software package | Caliper LS/Perkin Elmer, Hopkinton, MA |
References
- Premack, B. A., Schall, T. J. Chemokine receptors: gateways to inflammation and infection. Nat. Med. 2, 1174-1178 (1996).
- Singer, A. J., Clark, R. A.
- Wellen, K. E., Hotamisligil, G. S.
- Weitzman, S. A., Gordon, L. I. Inflammation and cancer: role of phagocyte-generated oxidants in carcinogenesis. Blood. 76, 655-663 (1990).
- Ridker, P. M., Cushman, M., et al. Inflammation, aspirin, and the risk of cardiovascular disease in apparently healthy men. N. Engl. J. Med. 336, 973-979 (1997).
- Wyss-Coray, T., Mucke, L. Inflammation in neurodegenerative disease--a double-edged sword. Neuron. 35, 419-432 (2002).
- Hamilton, J. A. Colony-stimulating factors in inflammation and autoimmunity. Nat. Rev. Immunol. 8, 533-544 (2008).
- Harlan, J. M.
- Bedard, K., Krause, K. H. The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: physiology and pathophysiology. Physiol. Rev. 87, 245-313 (2007).
- Rest, R. F., Spitznagel, J. K. Subcellular distribution of superoxide dismutases in human neutrophils. Influence of myeloperoxidase on the measurement of superoxide dismutase activity. Biochem. J. 166, 145-153 (1977).
- Hampton, M. B., Kettle, A. J., et al. Inside the neutrophil phagosome: oxidants, myeloperoxidase, and bacterial killing. Blood. 92, 3007-3017 (1998).
- Serhan, C. N., Savill, J. Resolution of inflammation: the beginning programs the end. Nat. Immunol. 6, 1191-1197 (2005).
- Jiang, F., Zhang, Y., et al. NADPH oxidase-mediated redox signaling: roles in cellular stress response, stress tolerance, and tissue repair. Pharmacol. Rev. 63, 218-242 (2011).
- Calafat, J., Kuijpers, T. W., et al. Evidence for small intracellular vesicles in human blood phagocytes containing cytochrome b558 and the adhesion molecule CD11b/CD18. Blood. 81, 3122-3129 (1993).
- Johansson, A., Jesaitis, A. J., et al. Different subcellular localization of cytochrome b and the dormant NADPH-oxidase in neutrophils and macrophages: effect on the production of reactive oxygen species during phagocytosis. Cell. Immunol. 161, 61-71 (1995).
- Kumar, A. P., Piedrafita, F. J., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma ligands regulate myeloperoxidase expression in macrophages by an estrogen-dependent mechanism involving the -463GA promoter polymorphism. J. Biol. Chem. 279, 8300-8315 (2004).
- Tseng, J. C., Kung, A. L. In vivo imaging of inflammatory phagocytes. Chem Biol. 19, 1199-1209 (2012).
- Gross, S., Gammon, S. T., et al. Bioluminescence imaging of myeloperoxidase activity in vivo. Nat. Med. 15, 455-461 (2009).
- Kielland, A., Blom, T., et al. In vivo imaging of reactive oxygen and nitrogen species in inflammation using the luminescent probe L-012. Free Radic. Biol. Med. 47, 760-766 (2009).
- Zhou, J., Tsai, Y. T., et al. Noninvasive assessment of localized inflammatory responses. Free Radic. Biol. Med. 52, 218-226 (2012).
- Karlsson, A., Nixon, J. B., et al. Phorbol myristate acetate induces neutrophil NADPH-oxidase activity by two separate signal transduction pathways: dependent or independent of phosphatidylinositol 3-kinase. J. Leukoc. Biol. 67, 396-404 (2000).
- Taylor, R. G., McCall, C. E., et al. Histopathologic features of phorbol myristate acetate-induced lung injury. Lab Invest. 52, 61-70 (1985).
- Fukaya, S., Matsui, Y., et al. Overexpression of TNF-alpha-converting enzyme in fibroblasts augments dermal fibrosis after inflammation. Lab Invest. 93, 72-80 (2013).
- Lu, Y. C., Yeh, W. C., et al.
- Aitken, R. J., Buckingham, D. W., et al. Reactive oxygen species and human spermatozoa: analysis of the cellular mechanisms involved in luminol- and lucigenin-dependent chemiluminescence. J. Cell. Physiol. 151, 466-477 (1992).
- Allen, R. C., Loose, L. D. Phagocytic activation of a luminol-dependent chemiluminescence in rabbit alveolar and peritoneal macrophages. Biochem. Biophys. Res. Commun. 69, 245-252 (1976).
- Caldefie-Chezet, F., Walrand, S., et al. Is the neutrophil reactive oxygen species production measured by luminol and lucigenin chemiluminescence intra or extracellular? Comparison with DCFH-DA flow cytometry and cytochrome c reduction. Clin. Chim. Acta. 319, 9-17 (2002).
- Dahlgren, C., Aniansson, H., et al. Pattern of formylmethionyl-leucyl-phenylalanine-induced luminol- and lucigenin-dependent chemiluminescence in human neutrophils. Infect. Immun. 47, 326-328 (1985).
- Dahlgren, C., Karlsson, A.
- Aerts, C., Wallaert, B., et al. Release of superoxide anion by alveolar macrophages in pulmonary sarcoidosis. Ann. N.Y. Acad. Sci. 465, 193-200 (1986).
- Zhang, N., Francis, K. P., et al. Enhanced detection of myeloperoxidase activity in deep tissues through luminescent excitation of near-infrared nanoparticles. Nat Med. , (2013).
