Summary
Se describe un método de imagen no invasiva para distinguir las fases inflamatorias. El suministro sistémico de luminol revela zonas de inflamación aguda que dependen de la actividad MPO en neutrófilos. En contraste, la inyección de lucigenina permite la visualización de la inflamación crónica dependiente de la actividad Phox en los macrófagos.
Abstract
La inflamación es un aspecto fundamental de muchas enfermedades humanas. En este informe de vídeo, se demuestra las técnicas de imagen no invasivas bioluminiscencia que distinguen a la inflamación aguda y crónica en modelos de ratón. Con daños en los tejidos o la invasión de patógenos, los neutrófilos son la primera línea de defensa, jugando un papel importante en la mediación de la respuesta inflamatoria aguda. A medida que avanza la reacción inflamatoria, los monocitos circulantes migran gradualmente en el sitio de la lesión y se diferencian en macrófagos maduros, que median la inflamación crónica y promover la reparación del tejido mediante la eliminación de restos de tejido y la producción de citocinas antiinflamatorias. La inyección intraperitoneal de luminol (,4-ftalazinediona, sal de sodio de 5-amino-2 ,3-dihidro-1) permite la detección de la inflamación aguda en gran parte mediada por neutrófilos infiltrantes de tejidos. Luminol reacciona específicamente con el superóxido generado dentro de los fagosomas de neutrófilos desde bioluminiscencia resulta de una mieloperoxidasa (MPO) reacción mediada. Lucigenin (bis-N-metilacridinio nitrato) también reacciona con el superóxido con el fin de generar bioluminiscencia. Sin embargo, lucigenin bioluminiscencia es independiente de MPO y se basa únicamente en la NADPH oxidasa de fagocitos (Phox) en los macrófagos durante la inflamación crónica. Juntos, el luminol y lucigenina permiten la visualización no invasiva y la evaluación longitudinal de diferentes poblaciones fagocitos a través de fases inflamatorias tanto agudas como crónicas. Teniendo en cuenta el importante papel de la inflamación en una variedad de enfermedades humanas, creemos que este método de formación de imágenes no invasiva puede ayudar a investigar los papeles diferenciales de los neutrófilos y macrófagos en una variedad de condiciones patológicas.
Introduction
La inflamación es una respuesta biológica altamente regulado que participan en una variedad de enfermedades humanas, incluyendo la infección microbiana 1, cicatrización de la herida 2, 3 la diabetes, el cáncer de 4, 5 cardiovasculares, neurodegenerativas 6, 7 y enfermedades autoinmunes. Inflamación de tejidos requiere la coordinación adecuada de diversas células inmunes con el fin de lograr la autorización patógeno, la reparación de tejidos, y la resolución de la enfermedad. Los neutrófilos y los macrófagos son mediadores inmunes clave de la inflamación del tejido. En la fase aguda de la inflamación, los neutrófilos son los primeros en responder a diversos estímulos nocivos y daños en los tejidos 8. Los neutrófilos extravasación rápidamente de la circulación para el sitio de la lesión, donde las células inactivan los microbios invasores mediante la liberación de gránulos anti-microbianos y la fagocitosis. Durante la fagocitosis, neutrófilos fagocitan los microbios invasores en fagosomas, dentro de la cual las células producen niveles elevados de superóxidoide (O 2 · -). Superóxido phagosomal es la fuente principal de muchas especies reactivas de oxígeno (ROS aguas abajo). Por ejemplo, se puede dismutado superóxido a peróxido de hidrógeno (H 2 O 2) por dismutación espontánea o por la superóxido dismutasa (SOD) 9, 10. En los neutrófilos, la mieloperoxidasa (MPO) convierte más peróxido de hidrógeno a ácido hipocloroso antimicrobiana (HOCl) 11. Como las respuestas inflamatorias siguen, los monocitos circulantes migran gradualmente en el sitio de la lesión y se diferencian en macrófagos maduros 2, cuya función fagocítica ayudar a eliminar patógenos inactivados y restos celulares. Además, como un regulador clave en la última fase de la inflamación, los macrófagos promueve la reparación del tejido mediante la producción de citocinas antiinflamatorias y 12 mediante la generación de ROS extracelular a un nivel inferior 9. El ROS generado en esta etapa posterior a regular la remodelación de tejidos, formación de nuevos vasos, y reepithelialización 13.
Fagocito NADPH oxidasa (Phox) es la fuente primaria de la producción de superóxido en neutrófilos y macrófagos 9. Phox es un complejo multi-subunidad cuyo montaje es estrictamente regulados 9. La holoenzima contiene varias subunidades reguladoras citosólicas (p67 phox, p47 phox, p40 phox y RAC) y una membrana heterodímero citocromo b 558 (compuesto por subunidades CYBA y CYBB). Citocromo b 558 es el núcleo de reacción dentro de la cual la subunidad CYBB (también conocido como p91 phox y NOX2) lleva a cabo la reacción en cadena redox primaria 9. Curiosamente, sus lugares de concentración son diferentes entre los neutrófilos y los macrófagos. En los neutrófilos en reposo, el citocromo b 558 es sobre todo presente en la membrana de los gránulos de almacenamiento intracelular 14. Durante la fagocitosis, neutrófilos montar la holoenzymes en fagosomas 9, donde también están presentes altos niveles de actividad de MPO. El neutrófilo Phox consume rápidamente oxígeno y ejerce su poder microbicida por la producción de ROS, un fenómeno denominado el estallido respiratorio 11. En contraste, los macrófagos tienen un nivel más bajo de expresión de MPO y el citocromo b 558 se encuentra principalmente en la membrana de plasma 15, 16. Por lo tanto los neutrófilos producen altos niveles de superóxido para la actividad anti-microbiana, mientras que los macrófagos generan menos superóxido para las funciones de regulación 15.
Dado que la inflamación es un intrincado proceso in vivo, los métodos de imagen no invasivas específicos para las diferentes fases de la inflamación serían permiten la evaluación cuantitativa y longitudinal de modelos de enfermedad. Uso de estudios mecanísticos, hemos demostrado previamente el uso de dos agentes quimioluminiscentes, luminol (5-amino-2 ,3-dihidro-1 ,4-ftalazinediona) y lucigenina (bis-N-metilacridinio nitrato), Para formación de imágenes no invasiva de las etapas agudas y tardías (crónica) de la inflamación, respectivamente 17. Luminol permite la visualización de la actividad de MPO de neutrófilos en la fase aguda de la inflamación 18-20, mientras que la bioluminiscencia lucigenina se puede utilizar para evaluar la actividad de los macrófagos en asociación con la fase tardía o la inflamación crónica 17. En este manuscrito, se utilizaron dos modelos experimentales de inflamación (sc PMA y sc LPS) para demostrar estas técnicas de imagen.
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Protocol
Nota: Todos los estudios con animales se realizaron de acuerdo con protocolos institucionales aprobados y las directrices de cuidado de animales.
1. Reactivos y Soluciones
- Solución de PMA para la inoculación sc: Preparar una solución madre de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) a 5 mg / ml en DMSO. Guarde la solución madre a -20 ° C. Antes de la inoculación, descongelar la solución madre y se diluye hasta 1 mg / ml de PMA en PBS.
- Solución de LPS para la inoculación sc: Disolver lipopolisacárido (LPS de Salmonella enterica serotipo enteritidis) en PBS estéril a 1 mg / ml antes de la inoculación sc.
- Solución de luminol para obtener imágenes de fase aguda: Disolver luminol (,4-ftalazinediona, sal de sodio de 5-amino-2 ,3-dihidro-1) en solución salina normal estéril (0,9% NaCl) a 10 mg / ml. La solución puede ser almacenada a -20 ° C antes de su uso.
- Solución Lucigenin para obtener imágenes de la fase crónica: Disolver lucigenin (bis-N-metilacridinio nitrato) en solución salina normal estérila 2,5 mg / ml. La solución puede ser almacenada a -20 ° C antes de su uso.
2. Subcutánea PMA inflamación Modelo
- Anestesie NCr ratones desnudos en una cámara de inducción con isoflurano 1-2%. Confirmar anestesia general por la pérdida de movimiento y un ritmo respiratorio constante. Transferir a un animal a un cono de nariz suministrado con gas isoflurano-mezclado y mantener al animal bajo anestesia.
- Utilice un alcohol isopropílico limpiar para limpiar y desinfectar el lugar de la inyección en el flanco izquierdo.
- Utilizando una técnica estéril, inyectar 50 l de la solución de inoculación PMA (que contiene 50 g de PMA) en el espacio subcutáneo en el flanco izquierdo. Retire el exceso de líquido del sitio de la inyección con un algodón con alcohol isopropílico. Evite el uso de analgesia, ya que puede afectar a las respuestas inflamatorias.
- Mueva el animal de nuevo a la jaula de la vivienda y seguir de cerca su recuperación de la anestesia. A fin de ayudar en la recuperación, use una almohadilla térmica para mantener el calor del animal.
3. Subcutánea LPS inflamación Modelo
- Anestesie ratones C57BL/6J con 1-2% isoflurano en una cámara de inducción. Una vez que se establece la anestesia general, la transferencia de un animal a un cono de la nariz suministrado con gas isoflurano y mantener al animal bajo anestesia.
- Utilice un alcohol isopropílico para limpiar la zona de la inyección en la pata izquierda.
- Utilizando una técnica estéril, inyectar 50 l de la solución de inoculación de LPS (que contiene 50 g de LPS) en la almohadilla de la pata izquierda. Retire el exceso de líquido del sitio de la inyección con un algodón con alcohol isopropílico. Evite el uso de analgesia, ya que puede afectar a las respuestas inflamatorias.
- Mueva el animal de nuevo a la jaula de la vivienda y seguir de cerca su recuperación de la anestesia. Use una almohadilla térmica para mantener caliente el animal durante la recuperación.
4. Bioluminiscencia de imágenes de la inflamación
- Se anestesia al animal en una cámara de inducción con isoflurano 1-2% de gas mezclado. Confirm anestesia general por la pérdida de movimiento y un ritmo respiratorio constante.
- Mientras que el animal es todavía bajo anestesia, por vía intraperitoneal (ip) inyectar la solución de luminol (10 mg / ml), o la solución de lucigenina (2,5 mg / ml) para obtener imágenes de la inflamación aguda o crónica, respectivamente. La dosis final es 100 mg / kg para el luminol y 25 mg / kg para lucigenina. Una dosis más baja de lucigenina (10-15 mg / kg) se puede utilizar para evitar la posible toxicidad de algunas cepas de ratón. Los signos de toxicidad incluyen falta de aliento y dificultad respiratoria. La cepa C57BL/6J tiene menor lucigenin tolerabilidad que la cepa nude NCR.
- Transferir el animal en la cámara de formación de imágenes de un sistema de imágenes de bioluminiscencia.
- Realizar imágenes de bioluminiscencia secuencial a intervalos de 1 min. Cada paso de imagen está compuesto por 1 min tiempo de adquisición, f / stop = 1, hurgar en la basura = 16 y 0 segundos de retardo.
- En el panel de adquisición de imágenes, para permitir secuencial de imágenes de varios pasos, haga clic en la secuencia de la creación button. Proporcionar suficientes medidas de imagen en el perfil de adquisición para determinar la producción de luminiscencia máxima (normalmente 15 pasos de un minuto será suficiente). La sección de formación de imágenes 15-min permite tiempo suficiente para la absorción de sustrato y la circulación sistémica.
- Retire el animal de la cámara de imágenes y moverlo de nuevo a la jaula de la vivienda. A fin de ayudar en la recuperación, use una almohadilla térmica para mantener el calor del animal.
- Durante el análisis post-adquisición, utilizar el paquete de software de imágenes para el cálculo de pico de la señal bioluminiscente total a través de las regiones estandarizados de interés (ROI). Las imágenes se presentan como resplandor en fotones / s / cm 2 / sr con un umbral mínimo y máximo indicados. Los datos cuantitativos se presentan como flujo total de fotones por segundo por ROI.
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Representative Results
Se realizó imágenes de bioluminiscencia longitudinal para evaluar la inflamación aguda y crónica en modelos experimentales de inflamación. Forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) es un agonista de la proteína quinasa C potente (PKC) que activa Phox para la producción de anión superóxido y desencadena intensas respuestas inflamatorias agudas 21. Inyección subcutánea de 50 mg de PMA en ratones desnudos NCr causó irritación de la piel rápido y la inflamación aguda en los sitios de inyección 18, 22, 23. Se realizó formación de imágenes al día durante 4 días con las primeras imágenes obtenidas tan pronto como 3 horas después de la inyección de PMA. Figura 1 demuestra la formación de imágenes de bioluminiscencia longitudinal utilizando luminol y lucigenina como sustratos. En las primeras fases de la inflamación (3 h), se observó la bioluminiscencia luminol significativa que indica altos niveles de actividad de MPO de neutrófilos en los sitios de inyección de PMA. No se observó una significativa bioluminiscencia lucigenina durante estas primeras etapas de la inflamación. A partir deldía 2, se observó la formación de costras y por lo tanto reduce la intensidad de la luminiscencia. Como la curación de heridas se hizo evidente (Figura 1A, días 3 y 4), se observó aumento constante de la bioluminiscencia lucigenina (Figura 1B). Estos resultados ilustran que la bioluminiscencia luminol se asocia con la fase aguda de la inflamación, mientras que lucigenina bioluminiscencia está estrechamente asociado con la reparación de tejidos en las fases tardías de la inflamación.
Independientemente, se inyectó sc 50 g de lipopolisacárido (LPS) en las almohadillas de las patas de ratones C57BL/6J de tipo salvaje, y realizamos imágenes de bioluminiscencia longitudinal de hasta 10 días (Figura 2A). LPS es un componente de la membrana de las bacterias Gram-negativas. SC inoculación de LPS es capaz de desencadenar fuertes respuestas inflamatorias por la activación del receptor TLR4 y posterior quimioquinas / producción de citoquinas inflamatorias 24. A diferencia de PMA que activa directamente Phox para productio superóxidon, LPS requiere un período más largo de tiempo para activar completamente el tejido infiltración de fagocitos 18. Como los neutrófilos son los primeros en responder a la infección por microbios, se observó elevada bioluminiscencia luminol durante los primeros 4 días de la inflamación aguda, que se redujo después de 5 días (Figura 2B). En contraste, la bioluminiscencia lucigenina aumentó gradualmente en la fase tardía y crónica de la inflamación (Figura 2B, 5-10 días).
En conjunto, estos resultados demuestran la capacidad de utilizar diferencial especificidad de sustrato para distinguir las etapas inflamatorias agudas y crónicas. Es importante destacar que, formación de imágenes está mediada por las actividades enzimáticas endógenas de las células inmunes, y no hay necesidad de que la expresión ectópica de la prensa.
Figura 1. En vivo de imágenes de bioluminiscencia longitudinal de las fases aguda y tardía de la inflamación. fuerte> (A) indujo la inflamación del tejido local mediante inyección subcutánea de 50 mg de PMA, y llevado a cabo todos los días de luminol (100 mg / kg, ip) y lucigenina (25 mg / kg, ip) imágenes de bioluminiscencia a partir de las 3 horas después de la inyección de PMA. No se observó ningún fondo significativo de auto-luminiscencia a los sitios de inflamación y sin agentes quimioluminiscentes. (B) la representación cuantitativa de la bioluminiscencia luminol y lucigenina en los sitios de inyección. En la fase aguda de la inflamación, las señales de luminol dominados la salida de bioluminiscencia (3 h). En las últimas etapas de la inflamación, los sitios de inyección tuvieron mayor bioluminiscencia lucigenina en comparación con luminol (día 4). Las barras de error representan la desviación estándar de las mediciones de bioluminiscencia en cada punto temporal de imágenes. Haz clic aquí para ver más grande la figura .
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Figura 2. (A) 50 g de LPS se inyectó sc en las almohadillas de las patas de los ratones C57BL/6J. Imágenes de bioluminiscencia longitudinal con luminol y lucigenina se realizaron al día durante 10 días. (B) la representación cuantitativa de la bioluminiscencia luminol y lucigenina en los sitios de la inyección de LPS. Bioluminiscencia Luminol aumentó durante los primeros 4 días de la inflamación aguda. Sin embargo, a finales de los / las fases de la inflamación crónica, las señales de luminol disminuyeron rápidamente y bioluminiscencia lucigenina aumentaron gradualmente. Las barras de error representan la desviación estándar de las mediciones de bioluminiscencia en cada punto temporal de imágenes. Haz clic aquí para ver más grande la figura .
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Discussion
En este informe, se demuestra un método para obtener imágenes de bioluminiscencia no invasivo de la inflamación en los animales vivos. Tomando ventaja de dos sustratos luminiscente, el luminol y lucigenina, el método puede distinguir diferentes fases de la inflamación. Bioluminiscencia Luminol se asocia con los neutrófilos en la fase aguda de la inflamación, mientras que la bioluminiscencia lucigenina está mediada por los macrófagos en la fase crónica. Relativamente pequeño (PM = 177,16 g / mol) y no cargado eléctricamente, el luminol puede penetrar fácilmente tanto en el plasma y la membrana phagosomal 25-29. Además, la luminiscencia de luminol es específico de la actividad de MPO intracelular de los neutrófilos 9. Por otra parte, es sobre todo lucigenina membrana impermeable debido a su tamaño más grande (PM = 510,5 g / mol) y dos cargas positivas 25, 27-30.
Los neutrófilos y macrófagos montar la holoenzima Phox en diferentes localizaciones subcelulares. Aunque ambos reactivosdependen de Phox para proporcionar el anión superóxido (O2 · -), la disparidad en la permeabilidad celular y MPO-dependencia permite a los sustratos para diferenciar los fagocitos inflamatorios en modelos de enfermedad. Los neutrófilos expresan la mayor parte de la Phox en la membrana de las vesículas intracelulares (fagosomas) 14, donde también están presentes altos niveles de MPO. Como resultado, el luminol bioluminiscencia se asocia específicamente con los neutrófilos activados durante la inflamación aguda. En contraste, los macrófagos Phox ensamblan en la membrana plasmática mientras se infiltran y maduran durante la inflamación crónica 15. Lucigenina No permeable puede interactuar directamente con el superóxido extracelular generado por los macrófagos para producir bioluminiscencia inflamatoria crónica.
La inflamación es un complicado proceso in vivo que requiere una coordinación adecuada de muchos tipos de células y diversas moléculas de señalización extracelular. En este informe de vídeo, se demuestra lauso sinérgico de ambos luminol y lucigenina, para controlar la inflamación de fase aguda y tardía (crónica) en modelos animales. Dado que estos sustratos están disponibles comercialmente y relativamente barato, creemos que este método de imagen relativamente simple y robusto puede ser fácilmente traducido a aplicaciones in vivo en muchas áreas de la enfermedad. De nota, en comparación con las técnicas de imagen fluorescentes, PET y MRI de infrarrojo cercano (NIR), el método quimioluminiscente no es ideal para la formación de imágenes de tejido profundo debido a espectros de emisión azul los sustratos '. Para mejorar la penetración en el tejido, se ha demostrado recientemente que la emisión de quimioluminiscencia azul puede ser transferido a las nanopartículas co-administrados para NIR de emisión 31. Además la modificación de sus estructuras químicas potencialmente podría mejorar su rendimiento cuántico para la salida de luz más fuerte y refinar sus espectros de emisión de penetración en los tejidos más profundos.
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Disclosures
Los autores declaran no tener ningún conflicto de interés en este estudio.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nancy Lurie Marcas. Damos las gracias a la Dra. Nancy E. Kohl para la lectura crítica del manuscrito. Agradecemos Kin K. Wong por su ayuda en la preparación de este informe en video.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO | P8139 | |
| Lipopolysaccharide from Salmonella enterica serotype enteritidis | Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO | L2012 | |
| Luminol (5-amino-2,3-dihydro-1,4-phthalazinedione, sodium salt) | Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO | A4685 | |
| Lucigenin (bis-N-methylacridinium nitrate) | Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO | M8010 | |
| IVIS Spectrum imaging system with Living Imaging 4.2 software package | Caliper LS/Perkin Elmer, Hopkinton, MA |
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