Summary
Vi beskriver en icke-invasiv imaging metod för att särskilja inflammatoriska stadier. Systemisk tillförsel av luminol avslöjar områden med akut inflammation beroende av MPO-aktivitet i neutrofiler. Däremot tillåter injektion av lucigenin för visualisering av kronisk inflammation beroende Phox aktivitet i makrofager.
Abstract
Inflammation är en grundläggande aspekt av många mänskliga sjukdomar. I den här videon rapporten visar vi icke-invasiva tekniker mareld avbildning som särskiljer akut och kronisk inflammation i musmodeller. Med vävnadsskada eller patogen invasion, neutrofiler är den första försvarslinjen, spelar en viktig roll i att medla det akuta inflammatoriska svaret. Som den inflammatoriska reaktionen fortskrider, cirkulerande monocyter vandrar gradvis i stället för skada och differentiera till mogna makrofager, som förmedlar kronisk inflammation och främja vävnadsreparation genom att ta bort vävnad skräp och producera anti-inflammatoriska cytokiner. Intraperitoneal injektion av luminol (5-amino-2 ,3-dihydro-1 ,4-ftalazindion, natriumsalt) möjliggör detektering av akut inflammation i stor utsträckning medieras av vävnadsspecifika infiltrerande neutrofiler. Luminol reagerar specifikt med superoxid genereras inom phagosomes av neutrofiler sedan mareld resultat från en myeloperoxidas (MPO)-medierad reaktion. Lucigenin (bis-N-metylakridinium nitrat) reagerar också med superoxid för att generera bioluminiscens. Dock är lucigenin mareld oberoende av MPO och det enbart förlitar sig på fagocytsystemet NADPH oxidas (Phox) i makrofager under kronisk inflammation. Tillsammans luminol och lucigenin tillåta icke-invasiv visualisering och longitudinell utvärdering av olika phagocyte befolkningar över både akuta och kroniska inflammatoriska faser. Tanke på den viktiga rollen av inflammation i en mängd olika humana sjukdomar, tror vi att denna icke-invasiv imaging metod kan hjälpa undersöka de differentiella roller neutrofiler och makrofager i en mängd olika patologiska tillstånd.
Introduction
Inflammation är en starkt reglerad biologiskt svar inblandad i en mängd humana sjukdomar, inklusive mikrobiell infektion 1, sårläkning 2, diabetes 3, cancer 4, hjärt-5, neurodegenerativa 6, och autoimmuna sjukdomar 7. Vävnadsinflammation kräver samordning av olika immunceller för att uppnå patogen clearance, vävnadsreparation och sjukdom upplösning. Neutrofiler och makrofager är viktiga immunmediatorer av vävnad inflammation. I den akuta fasen av inflammation, neutrofiler är de första som svarade till olika skadliga stimuli och vävnadsskada 8. De neutrofiler extravasera snabbt från cirkulationen till platsen av skadan, där cellerna inaktivera invaderande mikrober genom att släppa anti-mikrobiella granulat och fagocytos. Under fagocytos, uppsluka neutrofiler invaderande mikrober in phagosomes, inom vilken cellerna producerar höga nivåer av SuperoxIDE (O 2 · -). Phagosomal superoxid är den primära källan till många nedströms reaktiva syreradikaler (ROS). Exempelvis kan superoxid vara dehydrerat till väteperoxid (H 2 O 2) genom spontan dismutation eller genom superoxiddismutas (SOD) 9, 10. I neutrofiler, omvandlar myeloperoxidas (MPO) ytterligare väteperoxid till anti-mikrobiella hypoklorsyra (HOCl) 11. Eftersom de inflammatoriska svar fortsätter, cirkulerande monocyter vandrar gradvis i stället för skada och differentiera till mogna makrofager 2, vars fagocytos bidra till att undanröja inaktiverade patogener och cellrester. Dessutom, som en viktig regulator i den senare fasen av inflammation, främjar makrofag vävnadsreparation genom att producera anti-inflammatoriska cytokiner 12 och genom att generera extracellulära ROS på en lägre nivå 9. Den ROS genereras vid detta senare skede reglera vävnadsombildning, kärlnybildning och reepitheliasering 13.
Phagocyte NADPH oxidas (Phox) är den primära källan av superoxid produktion i både neutrofiler och makrofager 9. Phox är en multi-subenhet komplex vars montering är hårt reglerad 9. Holoenzymet innehåller flera cytosoliska regulatoriska subenheter (P67 phox, P47 phox, p40 phox och RAC) och ett membranbundet heterodimer cytokrom b 558 (består av subenhet CYBA och CYBB). Cytokrom B 558 är reaktionen kärnan inom vilken CYBB subenheten (även känd som P91 phox och NOX2) utför den primära redox kedjereaktion 9. Intressant, dess montering sajter är olika mellan neutrofiler och makrofager. I vilande neutrofiler, är cytokrom b 558 mestadels närvarande i membranet av intracellulära lagring granulat 14. Under fagocytos, neutrofiler montera holoenzymes at phagosomes 9, där höga nivåer av MPO-aktivitet är också närvarande. Den neutrofila Phox snabbt förbrukar syre och utövar sin microbicidal makt genom ROS produktion, kallas ett fenomen den respiratory burst 11. Däremot makrofager har en lägre nivå av MPO uttryck och cytokrom b 558 mest anträffas i plasmamembranet 15, 16. Således neutrofiler producerar höga nivåer av superoxid för anti-mikrobiell aktivitet, medan makrofager genererar mindre superoxid för reglerande funktioner 15.
Eftersom inflammationen är en invecklad in vivo-processen, skulle icke-invasiv imaging metoder specifika för olika faser av inflammation tillåter kvantitativ och longitudinell utvärdering av sjukdomstillstånd modeller. Använda mekanistiska studier har vi visat tidigare användningen av två kemiluminiscenta medel, luminol (5-amino-2 ,3-dihydro-1 ,4-ftalazindion) och lucigenin (bis-N-metylakridinium nitrat), För icke-invasiv avbildning av akuta och sena (kronisk) stadier av inflammation, respektive 17. Luminol möjliggör visualisering av neutrofil MPO-aktivitet i den akuta fasen av inflammation 18-20, medan lucigenin bioluminescens kan användas för att bedöma makrofagaktiviteten i association med den sena fasen eller kronisk inflammation 17. I detta manuskript, använde vi två experimentella inflammation modeller (SC PMA och SC LPS) för att visa dessa avbildningstekniker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Anmärkning: Samtliga djurstudier utfördes under godkända institutionella protokoll och djur riktlinjer vård.
Ett. Reagens och lösningar
- PMA-lösning för SC ympning: Bered en stamlösning av forbol 12-myristat 13-acetat (PMA) vid 5 mg / ml i DMSO. Förvara stamlösning vid -20 ° C. Före ympning, tina beståndet och späd till 1 mg / ml PMA i PBS.
- LPS-lösning för SC ympning: Lös lipopolysackarid (LPS från Salmonella enterica serotyp enteritidis) i steril PBS vid 1 mg / ml före SC ympning.
- Luminol lösning för akuta fasen avbildning: Lös luminol (5-amino-2 ,3-dihydro-1 ,4-ftalazindion, natriumsalt) i steril normal saltlösning (0,9% NaCl) vid 10 mg / ml. Lösningen kan lagras vid -20 ° C före användning.
- Lucigenin lösning för kronisk fas avbildning: Lös lucigenin (bis-N-metylakridinium nitrat) i steril fysiologisk koksaltlösningpå 2,5 mg / ml. Lösningen kan lagras vid -20 ° C före användning.
2. Subkutan PMA inflammationsmodell
- Söva NCR nakna möss i en induktionskammare med 1-2% isofluran. Bekräfta narkos genom förlust av rörelse och en konstant andningsfrekvens. Överför ett djur till en noskon levereras med isofluran-blandad gas och hålla djuret under anestesi.
- Använd en isopropylalkohol torka för att rengöra och desinficera injektionsstället på den vänstra flanken.
- Använd steril teknik, injicera 50 ìl av PMA ympning lösning (innehållande 50 ng PMA) i den subkutana utrymmet på vänstra flanken. Ta bort överflödig vätska från injektionsstället med en isopropylalkohol. Undvik att använda smärtlindring eftersom det kan påverka inflammatoriska svar.
- Flytta djuret tillbaka till huset buren och noga övervaka dess återhämtning från anestesi. För att bistå vid återvinning, använda en värmedyna för att hålla djuret varm.
Tre. Subkutan LPS inflammationsmodell
- Söva C57BL/6J-möss med 1-2% isofluran i en induktion kammare. När inrättande narkos, överföra ett djur till en noskon levereras med isofluran gas och hålla djuret under anestesi.
- Använd en isopropylalkohol torka att rengöra injektionsstället på den vänstra trampdynan.
- Använd steril teknik, injicera 50 ìl av LPS ympning lösning (innehållande 50 pg LPS) i den vänstra trampdynan. Ta bort överflödig vätska från injektionsstället med en isopropylalkohol. Undvik att använda smärtlindring eftersom det kan påverka inflammatoriska svar.
- Flytta djuret tillbaka till huset buren och noga övervaka dess återhämtning från anestesi. Använd en värmedyna för att hålla djuret varmt under återhämtning.
4. Bioluminescence Avbildning av inflammation
- Söva djuret i en induktion kammare med 1-2% isofluran-blandad gas. Confirm narkos genom förlust av rörelse och en konstant andningsfrekvens.
- Medan djuret fortfarande under anestesi, intraperitonealt (ip) injicera luminol-lösning (10 mg / ml), eller den lucigenin lösning (2,5 mg / ml) för akut eller kronisk inflammation avbildning, respektive. Den slutliga doseringsformen är 100 mg / kg för luminol och 25 mg / kg för lucigenin. En lägre dos av lucigenin (10-15 mg / kg) kan användas för att undvika eventuell toxicitet för vissa musstammar. Tecken på toxicitet är andfåddhet och andnöd. Den C57BL/6J stammen har lägre lucigenin tolerabilitet än NCR naken stam.
- Överför djuret in i bildbehandling kammaren av ett mareld bildsystem.
- Utför sekventiell mareld avbildning med 1 min intervaller. Varje avbildning steg består av 1 min förvärvet tid, f / stop = 1, binning = 16 och 0 sek fördröjning.
- Inom bilden förvärvet panelen, för att möjliggöra sekventiell multi-steg bildbehandling, klicka på sekvensen inställning buTTON. Ge tillräckliga imaging steg i förvärvet profil för att bestämma maximal luminiscens utgång (vanligen 15 en-minuters steg räcker). Den 15-min imaging avsnitt ger tillräckligt med tid för substrat absorption och systemiska cirkulationen.
- Ta bort djuret från avbildning kammaren och flytta den tillbaka till huset buren. För att bistå vid återvinning, använda en värmedyna för att hålla djuret varm.
- Vid uppföljning efter förvärvsanalysen, använda paketet bildbehandlingsprogram för att beräkna maximal total självlysande signalen genom standardiserade områden av intresse (ROI). Bilderna är närvarande som utstrålning i fotoner / sek / cm 2 / sr med minimal och maximal gräns anges. Kvantitativa data presenteras som totala flödet i fotoner per sekund per ROI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi spelade längsgående mareld avbildning att bedöma akut och kronisk inflammation i experimentella inflammation modeller. Phorbol 12-myristat 13-acetat (PMA) är en potent proteinkinas C (PKC)-agonist som aktiverar Phox för superoxidanjon produktion och utlöser intensiva akuta inflammatoriska svar 21. SC-injektion av 50 mg av PMA i NCR nakna möss orsakade snabb hudirritation och akut inflammation vid injektionsstället 18, 22, 23. Vi utförs dagligen avbildning i 4 dagar med de första bilderna som erhållits så tidigt som 3 h efter PMA injektion. Figur 1 visar den längsgående mareld avbildning med luminol och lucigenin som substrat. Vid tidiga stadier av inflammation (3 tim), observerade vi betydande luminol mareld indikerar höga nivåer av neutrofiler MPO aktivitet vid de platser som av PMA injektion. Ingen signifikant lucigenin mareld observerades under dessa tidiga stadier av inflammation. Börjar pådag 2, observerade vi sårskorpa bildas och därmed minskad luminescensintensiteten. Som sårläkning blev uppenbar (Figur 1A, dag 3 och 4), observerade vi stadig ökning lucigenin mareld (Figur 1B). Dessa resultat visar att luminol mareld är associerad med den akuta fasen av inflammation, medan lucigenin mareld är nära förknippad med vävnadsreparation i de sena faserna av inflammation.
Oberoende, injicerade vi SC 50 ng lipopolysackarid (LPS) i trampdynorna av vildtyp C57BL/6J-möss, och utfört längsgående mareld avbildning i upp till 10 dagar (Figur 2A). LPS är ett membran komponent i gramnegativa bakterier. SC ympning av LPS kan utlösa kraftiga inflammatoriska svar från TLR4 receptor aktivering och efterföljande inflammatoriska kemokiner / cytokineproduktion 24. Till skillnad från PMA som direkt aktiverar Phox för superoxid production, LPS kräver en längre tid för att fullt ut aktivera vävnad infiltrera fagocyter 18. Eftersom neutrofiler är de tidiga responders till mikrob infektion, observerade vi höjt luminol mareld under de första 4 dagarna av akut inflammation, som sjönk efter dag 5 (Figur 2B). Däremot lucigenin mareld ökade gradvis i slutet och kroniska fasen av inflammation (Figur 2B, dagar 5-10).
Tillsammans visar dessa resultat att förmågan att använda specificitet differential substrat att skilja akuta och kroniska inflammatoriska stadier. Viktigt är avbildning medieras av de endogena enzymatiska aktiviteter av de immuna cellerna, och det finns inget behov av ektopiskt uttryck av reporter.
Figur 1. In vivo longitudinell mareld avbildning av akuta och sena faser av inflammation. strong> (A) Vi inducerade lokala vävnadsinflammation genom subkutan injektion av 50 mikrogram PMA, och utförs dagligen luminol (100 mg / kg, ip) och lucigenin (25 mg / kg, ip) mareld avbildning börjar vid 3 h efter PMA injektion. Ingen signifikant bakgrund auto-luminiscens observerades vid ställen för inflammation utan kemiluminiscerande medel. (B) Kvantitativ representation av luminol och lucigenin bioluminescens vid injektionsställen. I den akuta fasen av inflammation, dominerade luminol signalerar mareld utgång (3 tim). I de senare stadierna av inflammation, hade injektionsställena högre lucigenin mareld jämfört med luminol (dag 4). Felstaplar representerar standardavvikelserna för mareld mätningar vid varje avbildning tidpunkt. Klicka här för att visa en större bild .
690fig2.jpg "/>
Figur 2. (A) 50 ^ g LPS injicerades SC i trampdynorna hos C57BL/6J-möss. Längsgående bioluminescens avbildning med luminol och lucigenin utfördes dagligen under 10 dagar. (B) Kvantitativ representation av luminol och lucigenin bioluminescens vid LPS injektionsställen. Luminol bioluminiscens ökade under de första 4 dagarna av akut inflammation. Men i slutet / kroniska faser av inflammation, sjönk luminol signaler snabbt och lucigenin mareld successivt ökat. Felstaplar representerar standardavvikelserna för mareld mätningar vid varje avbildning tidpunkt. Klicka här för att visa en större bild .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna rapport visar vi en mareld metod för icke-invasiv avbildning av inflammation i levande djur. Med utnyttjande av två självlysande substrat, luminol och lucigenin, kan metoden urskilja olika faser av inflammation. Luminol bioluminiscens är förknippat med neutrofiler i den akuta fasen av inflammation, medan lucigenin bioluminescens förmedlas av makrofager i den kroniska fasen. Relativt liten (molekylvikt = 177,16 g / mol) och elektriskt oladdade kan luminol lätt tränga både plasma och phagosomal membran 25-29. Dessutom är luminol luminiscens specifik för den intracellulära MPO-aktivitet i neutrofiler 9. Å andra sidan, är lucigenin mestadels membran ogenomträngligt på grund av dess större storlek (molekylvikt = 510,5 g / mol) och två positiva laddningar 25, 27-30.
Neutrofiler och makrofager montera Phox holoenzym vid olika subcellulära ställen. Även om båda reagensenberoende Phox att ge superoxidanjon (O 2 · -), gör skillnaderna i cell permeabilitet och MPO-beroendet substraten att differentiera inflammatoriska fagocyter i sjukdomsmodeller. Neutrofiler uttrycker det mesta av Phox i membranet av intracellulära vesiklar (phagosomes) 14, där höga nivåer av MPO är också närvarande. Som ett resultat, är luminol mareld specifikt förknippas med aktiverade neutrofiler under akut inflammation. Däremot makrofager montera Phox i plasmamembranet som de infiltrerar och mognar under kronisk inflammation 15. Icke-permeabel lucigenin kan interagera direkt med den extracellulära superoxid genereras av makrofager att producera kronisk inflammatorisk mareld.
Inflammation är en komplicerad in vivo process som kräver samordning av många celltyper och olika extracellulära signalmolekyler. I den här videon rapporten, visar visynergistisk användning av både luminol och lucigenin, övervaka akut och sent (kronisk) fas inflammation i djurmodeller. Eftersom dessa substrat är kommersiellt tillgängliga och relativt billiga, tror vi denna relativt enkel och robust avbildningsmetod lätt kan översättas till in vivo-tillämpningar inom många sjukdomsområden. Av notera, jämfört med PET, MRI och nära infraröda (NIR) fluorescerande avbildningstekniker, är den kemiluminiscenta metoden inte idealisk för djup vävnad avbildning grund av substraten "blå emissionsspektra. Att förbättra vävnadspenetration, har det nyligen visats att den blå kemiluminescens utsläppen kan överföras till co-administrerade nanopartiklar för NIR emission 31. Ytterligare modifiering av deras kemiska strukturer skulle kunna förbättra deras DQE för starkare ljusflöde och förfina sina emissionsspektra för djupare vävnadspenetration.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar ingen intressekonflikt i denna studie.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Nancy Lurie Marks Foundation. Vi tackar Dr Nancy E. Kohl för kritisk läsning av manuskriptet. Vi tackar Kin K. Wong för hans hjälp med att förbereda den här videon rapport.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO | P8139 | |
| Lipopolysaccharide from Salmonella enterica serotype enteritidis | Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO | L2012 | |
| Luminol (5-amino-2,3-dihydro-1,4-phthalazinedione, sodium salt) | Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO | A4685 | |
| Lucigenin (bis-N-methylacridinium nitrate) | Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO | M8010 | |
| IVIS Spectrum imaging system with Living Imaging 4.2 software package | Caliper LS/Perkin Elmer, Hopkinton, MA |
References
- Premack, B. A., Schall, T. J. Chemokine receptors: gateways to inflammation and infection. Nat. Med. 2, 1174-1178 (1996).
- Singer, A. J., Clark, R. A.
- Wellen, K. E., Hotamisligil, G. S.
- Weitzman, S. A., Gordon, L. I. Inflammation and cancer: role of phagocyte-generated oxidants in carcinogenesis. Blood. 76, 655-663 (1990).
- Ridker, P. M., Cushman, M., et al. Inflammation, aspirin, and the risk of cardiovascular disease in apparently healthy men. N. Engl. J. Med. 336, 973-979 (1997).
- Wyss-Coray, T., Mucke, L. Inflammation in neurodegenerative disease--a double-edged sword. Neuron. 35, 419-432 (2002).
- Hamilton, J. A. Colony-stimulating factors in inflammation and autoimmunity. Nat. Rev. Immunol. 8, 533-544 (2008).
- Harlan, J. M.
- Bedard, K., Krause, K. H. The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: physiology and pathophysiology. Physiol. Rev. 87, 245-313 (2007).
- Rest, R. F., Spitznagel, J. K. Subcellular distribution of superoxide dismutases in human neutrophils. Influence of myeloperoxidase on the measurement of superoxide dismutase activity. Biochem. J. 166, 145-153 (1977).
- Hampton, M. B., Kettle, A. J., et al. Inside the neutrophil phagosome: oxidants, myeloperoxidase, and bacterial killing. Blood. 92, 3007-3017 (1998).
- Serhan, C. N., Savill, J. Resolution of inflammation: the beginning programs the end. Nat. Immunol. 6, 1191-1197 (2005).
- Jiang, F., Zhang, Y., et al. NADPH oxidase-mediated redox signaling: roles in cellular stress response, stress tolerance, and tissue repair. Pharmacol. Rev. 63, 218-242 (2011).
- Calafat, J., Kuijpers, T. W., et al. Evidence for small intracellular vesicles in human blood phagocytes containing cytochrome b558 and the adhesion molecule CD11b/CD18. Blood. 81, 3122-3129 (1993).
- Johansson, A., Jesaitis, A. J., et al. Different subcellular localization of cytochrome b and the dormant NADPH-oxidase in neutrophils and macrophages: effect on the production of reactive oxygen species during phagocytosis. Cell. Immunol. 161, 61-71 (1995).
- Kumar, A. P., Piedrafita, F. J., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor gamma ligands regulate myeloperoxidase expression in macrophages by an estrogen-dependent mechanism involving the -463GA promoter polymorphism. J. Biol. Chem. 279, 8300-8315 (2004).
- Tseng, J. C., Kung, A. L. In vivo imaging of inflammatory phagocytes. Chem Biol. 19, 1199-1209 (2012).
- Gross, S., Gammon, S. T., et al. Bioluminescence imaging of myeloperoxidase activity in vivo. Nat. Med. 15, 455-461 (2009).
- Kielland, A., Blom, T., et al. In vivo imaging of reactive oxygen and nitrogen species in inflammation using the luminescent probe L-012. Free Radic. Biol. Med. 47, 760-766 (2009).
- Zhou, J., Tsai, Y. T., et al. Noninvasive assessment of localized inflammatory responses. Free Radic. Biol. Med. 52, 218-226 (2012).
- Karlsson, A., Nixon, J. B., et al. Phorbol myristate acetate induces neutrophil NADPH-oxidase activity by two separate signal transduction pathways: dependent or independent of phosphatidylinositol 3-kinase. J. Leukoc. Biol. 67, 396-404 (2000).
- Taylor, R. G., McCall, C. E., et al. Histopathologic features of phorbol myristate acetate-induced lung injury. Lab Invest. 52, 61-70 (1985).
- Fukaya, S., Matsui, Y., et al. Overexpression of TNF-alpha-converting enzyme in fibroblasts augments dermal fibrosis after inflammation. Lab Invest. 93, 72-80 (2013).
- Lu, Y. C., Yeh, W. C., et al.
- Aitken, R. J., Buckingham, D. W., et al. Reactive oxygen species and human spermatozoa: analysis of the cellular mechanisms involved in luminol- and lucigenin-dependent chemiluminescence. J. Cell. Physiol. 151, 466-477 (1992).
- Allen, R. C., Loose, L. D. Phagocytic activation of a luminol-dependent chemiluminescence in rabbit alveolar and peritoneal macrophages. Biochem. Biophys. Res. Commun. 69, 245-252 (1976).
- Caldefie-Chezet, F., Walrand, S., et al. Is the neutrophil reactive oxygen species production measured by luminol and lucigenin chemiluminescence intra or extracellular? Comparison with DCFH-DA flow cytometry and cytochrome c reduction. Clin. Chim. Acta. 319, 9-17 (2002).
- Dahlgren, C., Aniansson, H., et al. Pattern of formylmethionyl-leucyl-phenylalanine-induced luminol- and lucigenin-dependent chemiluminescence in human neutrophils. Infect. Immun. 47, 326-328 (1985).
- Dahlgren, C., Karlsson, A.
- Aerts, C., Wallaert, B., et al. Release of superoxide anion by alveolar macrophages in pulmonary sarcoidosis. Ann. N.Y. Acad. Sci. 465, 193-200 (1986).
- Zhang, N., Francis, K. P., et al. Enhanced detection of myeloperoxidase activity in deep tissues through luminescent excitation of near-infrared nanoparticles. Nat Med. , (2013).
