Summary
越来越多地使用斑马鱼作为动物模型的发展需要有效的方法交付已知化合物和解决方案的数量。灌胃下述过程可用于口服给药的精确体积的溶液可靠，安全和有效的成年斑马鱼。
Abstract
斑马鱼已成为一个重要的在体内模型在生物医学研究。有效方法，必须开发和利用提供解决方案，为科研的化合物或试剂。目前管理化合物口服成年斑马鱼的方法是不准确由于变异自愿消费的鱼。一个灌胃的程序开发传染性病原体对斑马鱼的研究在生物医学研究提供精确的数量。超过6个月的年龄的成年斑马鱼麻醉与150 mg / L的缓冲MS-222和，灌胃5微升的解决方案，采用柔性导管植入管连接到一个切割22-G针尖。下降到斑马鱼的口腔直到管子的前端延伸过去鳃（约1厘米）的软管。然后将溶液缓慢注入到肠道内。此方法是有效的88％的时间里，鱼没有事故恢复。这程序也是有效的，作为一个人就可以在一小时内灌胃给药20-30鱼。此方法可以用于精确地管理代理传染病的研究，或成年斑马鱼中的其它化合物的研究。
Introduction
目前管理化合物口服斑马鱼的方法包括管理化合物涂在饲料，混合成明胶的饮食1，盐水虾2 bioencapsulated，混合脂质的封装饮食3，喷蜡珠4，并通过无麸质饮食。限制这些方法包括口服高浸出率和个别鱼不完整或不可预知的化合物消费。这些变量是有问题的，因为在传染性疾病研究，知道鱼的感染剂量可能是学习成功的关键。另外，以前的工作已表明，某些化合物给药水浴引起中毒性病变肠道的影响，可能是所研究的发生之前，斑马鱼鳃。
灌胃是一个标准的方法，用于其他实验室动物物种的精确管理的产品数量AKnown集中研究在生物医学和制药研究。直到最近，在文献中被描述为gavaging斑马鱼的方法。描述的技术之一是两个人的方法，使用24-G连接至2-20微升的移液管，以提供溶液5μl的导管鞘7中所描述的方法的死亡率是8.7％和39％，在第一和第二试验，分别大部分死亡率归因于妊娠女性。第二灌胃描述的技术使用钝头灌胃注射器辖5微升解决medakas的青鳉 。8对死亡率的信息并没有提供，进行灌胃，没有描述的确切过程。根据动物护理和实验室斑马鱼，鱼的身体重量的1％到加拿大会可以通过灌胃给药9,10，我们的目标是开发一个可重复的，安全，高效的方法提供精确的体积COM磅的成年斑马鱼的男女双方口头和再生产的各个阶段。此过程将是适用于任何研究中，需要准确的化合物口服给药。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1。准备麻醉解决方案
- 制备溶液150 mg / L的MS-222系统中的水，无论是从储备溶液或粉末形式。
- 验证的pH值，用pH计。
- 用碳酸氢钠缓冲液根据需要，直到pH值在7-7.5之间。
- 准备从MS-222为鱼恢复英寸恢复时间通常小于1分钟的系统水的罐。
2。准备灌胃装置
- 切清晰的22-G植入管从口腔到肠道灯泡的鱼的长度大约多一点。最初，我们建议每个新组正在使用的估计所需的长度，以获得最佳的麻醉鱼。
- 切清晰的植入到半英寸22-G针管推，直到它是安全的，没有风险分离。如果½22-C针，切针的应用程序长度roximately。
- 当完成时，应该从针尖约1厘米，或较短如果鱼较小延伸导管植入管。
- 22-G针枢纽连接到1毫升luerlok的注射器。
3。准备灌胃
- 切槽成海绵，用手术刀刀片。
- 在系统水浸泡的海绵从MS-222。
- 放置在平坦表面上的湿的海绵。
- 制订了相应的5微升溶液灌胃到22-G导管和1毫升注射器。
4。麻醉和灌胃
- 快餐鱼在手术前至少24小时。
- 将鱼的MS-222溶液中，直到它失去其扶正反射，尾鳍捏不响应，但保持鳃盖运动。这通常需要2-3分钟左右。
- 从麻醉中的解决方案，并将其放入取出鱼与头部略微突出的海绵的海绵中的凹槽，但鳃包括由海绵。
- 将海绵成垂直位置。
- 打开斑马鱼的嘴，使用22-G导管。
- 轻轻插入管，直到提示是过去的鳃（约1厘米或油管的长度）。植入管不应该需要被迫。电阻建议管可能被击中的鳃弓或心脏。
- 如果有阻力，轻轻退出，重新定位，然后再试一次。
- 注入慢慢材料。
- 注射时，请确保该解决方案通过鳃或嘴不退出。
- 从海绵和地方打入回收槽取出鱼。
- 恢复通常发生在不到1分钟，表示鱼直立游泳，保持平衡。
- 通过可视化的积极驱逐米鱼监视鱼返流所示动脉插管从它的嘴，或者没有鳃盖运动。
- 鱼可以返回到他们的正规坦克，一旦他们恢复。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
这两种鱼类，包括妊娠女性两性成功灌胃（ 图1）。一个成功的过程不到一分钟，没有看到退出鳃或口的液体。油管进入容易，没有力量，没有看到血后拔除尿管。这个程序是快速的，需要约10分钟，灌胃给药3〜4的鱼，鱼每30-45秒的平均。
斑马鱼不应该被灌胃超过5μl的任何解决方案。管饲法用10微升的解决方案导致只有50％的成功率（ 图2）。灌胃10微升也完全失败，在妊娠的女性。在这项研究中，成鱼平均体重0.2克。利用廉政公署的建议，这将意味着，4微升的溶液可以管理每个鱼。目前使用的5微升将这些建议一致。这种技术有约10％mortalit的Ÿ率主要归因于妊娠的女性被发现死在第二天。虽然这死亡率明显低于其他报道的管饲法技术，理想情况下，严重的妊娠女性不应该管饲用于研究目的，除非它是必要的。
图1。 ％的成功率的比较用5μl的溶液之间的生殖群体。结合各组的％的成功率为88％。妊娠女性的％的成功率为100％;非妊娠女性90％，男性为82％。
图2。比较总体％的成功率使用5微升与10微升。使用5微升百分之总成功率为88％。共使用10％的成功微升50％。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
意义
这种技术是一种改进，并提供了几个优点，在先前所描述的技术用于gavaging成年斑马鱼。首先，利用海绵抑制鱼，一个人可以执行的程序，而不是先前所描述的技术，需要两个人。7二，比静脉导管，导管植入管更灵活，它可以帮助减少二次创伤所致穿孔同样使用钝头的注射器。7,8三，通过使用透明管，该解决方案可以轻松地进行可视化进入鱼。最后，灌胃装置是稳定的，允许它被快速有效地重复使用许多鱼时，需要以管饲。管饲法一般技术时间看出，在其他化合物口服给药的方法，以斑马鱼的消费量和浓度的变化，因此也可以减少到p所需要的鱼量erform 1-5的一个实验。
关键步骤
同样重要的是快的鱼为至少24小时的时间，禁食12小时并不是所有的斑马鱼有一个空的肠球。 24小时快速，防止返流和损失的解决方案通过嘴和腮由于部分全肠道13。最常见的问题是液体通过口或鳃退出，表明油管没有插入足够远的走在肠道。通过口腔或鳃排出的液体，可避免通过观察油管的正确位置，以及使用油管，其长度足以绕过鳃。更严重的并发症可能包括刺创伤，内部出血，肠穿孔，不全和猝死。这些并发症可能会或可能不会立即观察。通常情况下，会发生猝死小时后，该程序完成，而鱼看起来没有初始复原期间RMAL。
浸泡在漂白剂中，然后在与鱼接触前的硫代硫酸钠溶液的海绵。这消除了任何代理或鱼有害的化学物质，可能已被。在MS-222原液应贮存在黑暗的容器中，相差的光，并在冰箱中5天。如果观察到的褐色色调的解决方案应该被丢弃，因为产品的效能降低。11,12
限制
该协议不需要麻醉的斑马鱼，以确保成功。在某些情况下，这可能是不利的，麻醉剂可能有不利影响的被测量上的研究成果。12目前，斑马鱼没有灌胃协议，不需要麻醉。7,8如果是众所周知的MS-222麻醉影响测得的变量，以及其他麻醉剂可能被使用，或上一个自愿消费方式iously提到的方法可以利用。1-5
与先前描述的技术，此技术是具有挑战性上执行时，妊娠女性。7在这个组中，死亡率高的原因可能导致败血症由于肠道流离失所者在体腔的鸡蛋，可能是肠穿孔。同样，如果的鸡蛋和肠穿孔，急性鸡蛋相关coelomitis可能也会发生。这些事件可能尽量减少产卵妊娠女性才gavaging。另外，一个较小规格的导管可用于执行该程序。
如果使用一个较小的尺寸的斑马鱼，应注意的管子和针的直径和长度，以便将适合他们的口和肠道的大小来调节。
的程序的效率可以进一步增加，如果第二individua升监测麻醉，并确保麻醉的鱼的个人执行管饲法的稳定供应。这种技术是比较容易掌握的，并不需要大量的实践获得熟练度。此外，该过程不需要专门的设备或设施。
故障排除
如果斑马鱼不会成为2-3分钟内麻醉，改变麻醉液，或用新鲜制备的原液。如果管子不走在肠道的斑马鱼容易地滑动，更小直径的管道应该被使用。这可能是有益的练习使用少量，以确保正确的管子的直径和长度，以及，以评估是否是适当的给药体积为斑马鱼的大小同样大小的鱼。管也可以标记理想的穿透深度要注意正在使用的鱼的大小。
一旦掌握了这种技术，它可以被用来提供一个精确的量的各种化合物或传染性病原体有效和一致成年斑马鱼，使其可用于各种研究协议。这种技术也可能需要进行实验的鱼的数目最小化，并允许精确的时间测量各种化合物对鱼的影响。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者宣称，他们有没有竞争经济利益。
Acknowledgments
洛克菲勒大学生物科学中心比较为这个项目提供了支持。我们感谢詹妮尔Monnas的技术援助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| A sponge | |||
| 1-cc luer lock syringe | Becton Dickinson Co | ||
| 22-G Micro-Renathane Implantation tubing (cut) | Braintree Scientific, Inc. | ||
| 1 22-G needle (cut, if needed) | Becton Dickinson Co | ||
| pH meter | Hanna probe | ||
| 1 scalpel blade | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| MS-222 (Finquel) | Argent Laboratories | ||
References
- Royes, J. -A. B., Chapman, F. Preparing Your Own Fish Feeds. , Department of Fisheries and Aquatic Sciences, Florida Cooperative Extension Service, Insitute of Food and Agricultural Sciences, University of Florida. (2009).
- Gomez-Gil, B., Cabanillas-Ramos, J., Paez-Brambila, A., Roque, A. Standardization of the bioencapsulation of enrofloxacin and oxytetracycline in Artemia fransciscana Kellogg. Aquaculture. 196, 1-12 (1906).
- Langdon, C. Microparticle types for delivering nutrients to marine fish larvae. Aquaculture. 227, 259-275 (2003).
- Langdon, C., Nordgreen, A., Hawkyard, M., Hamre, K. Evaluation of wax spray beads for delivery of low-molecular weight, water soluble nutrients and antibiotics to Artemia. Aquaculture. 284, 151-158 (2008).
- Zang, L., Morikane, D., Shimada, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. A Novel Protocol for the Oral Administration of Test Chemicals to Adult Zebrafish. Zebrafish. 8, 203-210 (2011).
- Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think Small: Zebrafish as a Model System of Human pathology. Journal of Biomedicine and Biotechnology. , (2012).
- Tysnes, K. R., Jorgensen, A., Poppe, T., Midtlyng, P. J., Robertson, L. J. Preliminary expermients on use of zebrafish as a laboratory model for Giardia duodenalis infection. Acta Parasitologica. 57, 1-6 (2012).
- Marie, B., Huet, H., et al. Effects of a toxic cyanobacterial bloom (Planktothris agardhii) on fish: Insights from histopathological and quantitative proteomic assessments following the oral exposure of medaka fish (Oryzias latipes). Aquatic Toxicology. 114-115, 39-48 (2012).
- Canadian Council on Animal Care. CCAC guidelines on: the care and use of fish in research, teaching and testing. , CCAC. Ottawa, Ontario, Canada. (2005).
- Harper, C., Lawrence, C. The Laboratory Zebrafish. , CRC Press. Boca Raton, Florida, USA. (2011).
- De Tolla, L. J., Srinivas, S., et al. Guidelines for the Care and Use of Fish in Research. ILAR Journal. 37 (4), (1995).
- Topic Popovic, N., Strunjak-Perovic, I., et al. Tricaine methane-sulfonate (MS-222) application in fish anaesthesia. Journal of Applied Ichthyology. 28, 553-564 (2012).
- Field, H. A., Kelley, K. A., Martell, L., Goldstein, A. M., Serluca, F. C. Analysis of gastrointestinal physiology using a novel intestinal transit assay in zebrafish. Neurogastroenterology & Motility. 21, 304-312 (2009).
