Summary
Die zunehmende Verwendung von Zebrafisch als Tiermodell erfordert die Entwicklung effektiver Methoden für die Lieferung von bekannten Mengen von Verbindungen und Lösungen. Die Magensonde unten beschriebene Verfahren ermöglicht die orale Verabreichung von genauen Volumina der Lösung zuverlässig, sicher und effizient zu erwachsenen Zebrafisch.
Abstract
Der Zebrafisch ist zu einem wichtigen in vivo-Modell in der biomedizinischen Forschung. Effektive Methoden müssen entwickelt und verwendet werden, um Verbindungen oder Mittel in Lösungen für die wissenschaftliche Forschung zu liefern. Aktuelle Methoden zur Verabreichung von Verbindungen oral erwachsenen Zebrafisch sind ungenau wegen Variabilität in freiwilligen Verbrauch von den Fischen. Eine Magensonde Verfahren wurde entwickelt, um präzise Mengen von Infektionserregern zu liefern für das Studium in der biomedizinischen Forschung Zebrafisch. Adult Zebrafisch über 6 Monate alt waren betäubt mit 150 mg / l gepuffert MS-222 und eine Sonde mit 5 ul-Lösung mit flexiblen Katheter-Implantation Schlauch an einem Schnitt 22-G-Nadel Spitze. Der Schlauch wurde in die Mundhöhle des Zebrafisch abgesenkt, bis die Spitze des Schlauches verlängert an den Kiemen (etwa 1 cm). Die Lösung wurde anschließend langsam in den Darmtrakt injiziert. Diese Methode wirksam war 88% der Zeit, mit Fisch erholt ereignislos. DieseVerfahren ist auch effizient, wie eine Person 20-30 Fisch in einer Stunde eine Magensonde. Diese Methode kann verwendet werden, um genau zu verwalten Agenten für Infektionskrankheiten Untersuchungen oder aus Untersuchungen von anderen Verbindungen in erwachsenen Zebrafisch werden.
Introduction
Aktuelle Methoden zur Verabreichung von Verbindungen oral Zebrafisch umfassen Verabreichung von Verbindungen top-Beschichtung auf Futtermittel, gemischt in Gelatine Diäten 1. bioencapsulated in Salzlösunggarnele 2, gemischt mit Lipid verkapselten Diäten 3, Wachs Spray Perlen 4 und über Gluten-basierte Ernährung. 5 Einschränkungen der diese Methoden der oralen Verabreichung umfassen hohe Auslaugraten und unvollständiger oder unvorhersehbare Verbindung Verbrauch für die einzelnen Fische. Diese Variablen sind problematisch, weil im Bereich der Infektionskrankheiten Studien, wohl wissend, die infektiöse Dosis verabreicht, um den Fisch kann entscheidend sein für das Studium Erfolg. Auch hat früheren Arbeiten gezeigt, dass bestimmte Verbindungen in Wasser Bäder verabreicht toxisch Läsion führen zu Kiemen, bevor die intestinale Wirkungen, die unter Studie sein kann auftreten Zebrafisch. 6
Gavage ist ein Standard-Verfahren in anderen Labor Tierarten verwendet werden, um präzise Mengen eines Produktes mit ak verwaltennown Konzentration für das Studium in der biomedizinischen und pharmazeutischen Forschung. Erst vor kurzem haben Methoden zur gavaging Zebrafisch wurde in der Literatur beschrieben. Eine Technik beschrieben ist ein Zwei-Personen-Verfahren unter Verwendung einer 24-G Katheterhülle an einem 2-20 ul Pipette bis 5 ul Lösung zu liefern. 7 Das beschriebene Verfahren hatte eine Sterblichkeitsrate von 8,7% und 39% auf dem ersten und zweiten Studie sind; die meisten der Sterblichkeit wurde trächtige Weibchen zugeschrieben. Die zweite Sonde beschriebene Technik verwendet stumpfen Sonde Spritzen bis 5 ul Lösung Medakas (Oryzias latipes). 8 Informationen zu Sterblichkeit wurde nicht zur Verfügung gestellt und den genauen Prozess der Durchführung der Magensonde wurde nicht beschrieben verwalten. Nach Angaben der kanadischen Rates über Animal Care und dem Labor Zebrafisch, bis zu 1% des Fisches Körpergewicht kann über eine Magensonde verabreicht werden. 9,10 Unser Ziel war es, eine reproduzierbare, sichere und effiziente Methode der Bereitstellung von genauen Volumina von com entwickelnPfund oral erwachsenen Zebrafisch von beiden Geschlechtern und in allen Phasen der Reproduktion. Dieses Verfahren anwendbar wäre für jede Studie, in der genaue oraler Gabe einer Verbindung erforderlich ist.
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Protocol
1. Vorbereiten des Betäubungsmittel-Lösung
- Bereiten Sie eine Lösung von 150 mg / L von MS-222 in System Wasser entweder aus einer Stammlösung oder aus der Pulverform.
- Überprüfen Sie den pH-Wert mit einem pH-Meter.
- Puffer mit Natriumbicarbonat wie nötig, bis der pH-Wert zwischen 7-7,5.
- Bereiten Sie einen Behälter des Systems Wasser frei von MS-222 für die Fische zu erholen in. die Recovery-Zeit ist in der Regel weniger als 1 min.
2. Vorbereiten des Gavage Vorrichtung
- Schneiden Sie die klaren 22-G Implantation Schlauch an ein wenig mehr als ungefähre Länge von der Mündung bis zur Darm-Glühlampe der Fische. Zunächst empfehlen wir anesthetizing einen Fisch für jede neue Gruppe genutzt, um die bestmögliche Schätzung der Länge brauchte.
- Stecken Sie das abgeschnittene klare Implantation Schlauch auf der ½-Zoll 22-G-Nadel bis es sicher ist und es besteht keine Gefahr des Abnehmens. Wenn ein 22 ½-C Nadel nicht verfügbar ist, schneiden eine längere Nadel Approximately dass Länge.
- Wenn Sie fertig sind, sollte der Katheter-Implantation Schlauch etwa 1 cm von der Spitze der Nadel, oder kürzer, wenn die Fische kleiner sind verlängern.
- Bringen Sie die 22-G-Nadel-Hub zu einem 1-cc luerlok Spritze.
3. Vorbereitung für Gavage
- Schneiden Sie eine Nut in einem Schwamm mit einem Skalpell.
- Genießen Sie den Schwamm in Wasser-System frei von MS-222.
- Setzen Sie den angefeuchteten Schwamm auf einer ebenen Fläche.
- Erarbeiten die geeigneten 5 ul Lösung für eine Magensonde in den 22-G-Katheter-Schlauch und einer 1-ml-Spritze.
4. Anästhesie und Gavage
- Schnell die Fische mindestens 24 Stunden vor dem Eingriff.
- Den Fisch in der MS-222-Lösung, bis es seine Aufrichtungsreflexes verliert und nicht zu einer Schwanzflosse Prise reagieren, sondern unterhält opercular Bewegung. Dies dauert in der Regel ca. 2-3 min.
- Entfernen Sie den Fisch aus der Narkose Lösung und legen Sie sie indie Nut in der Schwamm mit dem Kopf ein wenig vor dem Schwamm, aber die Kiemen der Schwamm bedeckt.
- Bewegen Sie den Schwamm in eine vertikale Position.
- Öffnen Sie den Zebrafisch Mund mit der 22-G-Katheter-Schlauch.
- Schieben Sie den Schlauch, bis die Spitze ist an den Kiemen (ca. 1 cm oder die Länge der Schläuche). Die Implantation Schläuche sollten nicht gezwungen werden. Widerstand schlägt die Röhre kann das Drücken der Kiemenbogens oder Herz.
- Wenn es Widerstand gibt, vorsichtig zurückziehen, neu und versuchen Sie es erneut.
- Injizieren Sie das Material langsam.
- Während Injektion, stellen Sie sicher, dass die Lösung nicht über die Kiemen oder den Mund verlassen.
- Entfernen Sie den Fisch aus dem Schwamm und Ort in den Schmutzwassertank.
- Wiederherstellung tritt typischerweise in weniger als 1 min und wird durch die Fische schwimmen aufrecht und Erhalt des Gleichgewichts angegeben.
- Überwachen Sie Fisch für Aufstoßen durch Visualisierung der Fisch aktiv vertreiben m gezeigtaterial aus seinem Mund, oder ohne opercular Bewegung.
- Fische können wieder zu ihrem regulären Tank zurückgegeben werden, sobald sie sich erholt haben.
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Representative Results
Beide Geschlechter von Fischen, darunter trächtige Weibchen wurden erfolgreich eine Sonde (Abbildung 1). Eine erfolgreiche Vorgang dauert weniger als eine Minute ohne Flüssigkeit gesehen Verlassen der Kiemen oder den Mund. Der Schlauch tritt leicht, ohne Gewalt, ohne Blut auf Katheterentfernung gesehen. Das Verfahren ist schnell, erfordert etwa 10 min auf 3 bis 4 Fisch Magensonde, mit einem Durchschnitt von 30-45 sec pro Fisch.
Zebrafisch sollte nicht mit mehr als 5 ul jeder Lösung zwangsernährt werden. Gavage mit 10 ul Lösungen resultierte in nur einer 50% Erfolgsquote (Abbildung 2). Gavage von 10 ul war auch völlig erfolglos in trächtige Weibchen. In dieser Studie, wog der erwachsenen Fische einen Durchschnitt von 0,2 g je. Mit der CCAC die Empfehlung, würde dies bedeuten, dass 4 ul Lösung für jeden Fisch verabreicht werden könnte. Die aktuelle Verwendung von 5 ul stünde im Einklang mit diesen Empfehlungen. Diese Technik hatte etwa 10% mortality-Rate vor allem auf eine trächtige Weibchen, die am nächsten Tag tot gefunden wurden. Während diese Sterblichkeit ist deutlich geringer als bei anderen Techniken berichtet Magensonde sollte idealerweise grob trächtige Weibchen nicht zwangsernährt, wenn es notwendig ist für Studienzwecke werden.
Abbildung 1. Vergleich Prozent Erfolgsquote zwischen verschiedenen Gruppen mit reproduktiven 5 ul Lösung. Die prozentuale Erfolg aller Gruppen zusammengefasst betrug 88%. Die prozentuale Erfolg für trächtige Weibchen lag bei 100%, für nicht-trächtige Weibchen 90% und bei den Männern 82%.
Abbildung 2. Vergleich der Gesamt-Prozent Erfolg mit 5 ul ul versus 10. Insgesamt Prozent Erfolg mit 5 ul betrug 88%. Die insgesamt 10 Prozent Erfolg mitul betrug 50%.
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Discussion
Bedeutung
Diese Technik ist eine Verbesserung und bietet mehrere Vorteile gegenüber den beiden zuvor beschriebenen Techniken für gavaging erwachsenen Zebrafisch. Zunächst ermöglicht die Verwendung eines Schwamms, um die Fische zurückzuhalten einer Person, das Verfahren durchzuführen, wie in einem zuvor beschriebenen Technik, die zwei Personen gegenüber. 7 Zweitens ist Katheterimplantation Schlauch flexibler als Venenkatheter, die helfen können, minimiert die durch Trauma zu einer Perforation ähnlich wie mit stumpfen Spritzen. 7,8 Drittens, indem eine klare Schläuche, die Lösung ist ganz einfach visualisiert werden in die Fische. Und schließlich ist das Gerät stabil Magensonde ermöglicht es, schnell und effizient wiederverwendet werden, wenn viele Fische zu zwangsernährt werden müssen. Die Magensonde Technik im allgemeinen verringert die Schwankung des Verbrauchs und der Konzentration anderer Methoden der oralen Verabreichung der Verbindung an Zebrafisch gesehen, und als solche kann auch die Menge der Fische erforderlichen perform ein Experiment. 1-5
Kritische Schritte
Es ist auch wichtig, um schnell die Fische für mindestens 24 Stunden seit mit einem 12 Stunden fasten nicht alle Zebrafisch einen leeren Darm-Glühbirne. Die 24 Stunden schnell wird Aufstoßen und Verlust der Lösung durch den Mund zu verhindern und Kiemen aufgrund einer teilweise gefüllten Darm-Trakt 13. Das häufigste Problem ist austretende Flüssigkeit durch den Mund oder die Kiemen, die anzeigt, dass der Schlauch nicht weit genug nach unten Darmtrakt eingesetzt. Flüssigkeit, die über den Mund oder Kiemen durch die Beobachtung der korrekten Platzierung des Rohres sowie mit einem Rohr mit ausreichender Länge, um die Kiemen umgehen vermieden werden. Weitere schwere Komplikationen können gill Trauma, innere Blutung, Darmperforation, Aufstoßen und plötzlicher Tod. Diese Komplikationen können oder nicht unmittelbar beobachtet werden. Typischerweise tritt plötzlichen Tod Stunden nach der Vorgang abgeschlossen ist, während der Fisch sah keinermal während der anfänglichen Erholung.
Die Schwämme wurden dann in Bleich-und Natriumthiosulfat-Lösung vor der in Kontakt mit dem Fisch getränkt. Diese entfernt alle Agenten oder Chemikalien, die schädlich für die Fische haben. Die MS-222 Stammlösung sollte in einem dunklen Behälter gelagert werden, weg vom Licht und für bis zu 5 Tage im Kühlschrank. Wenn eine bräunliche Färbung beobachtet wird die Lösung sollte verworfen werden, da die Wirksamkeit reduziert. 11,12
Einschränkungen
Dieses Protokoll erfordert keine Anästhesie des Zebrafisch um den Erfolg sicherzustellen. Dies kann unter Umständen nachteilig, wo das Anästhetikum einen nachteiligen Effekt auf die Forschungsergebnisse gemessen haben. 12 Derzeit gibt es keine Schlundsonde Protokoll für Zebrafisch, der keine Anästhesie. 7,8 Wenn MS-222 Anästhesie bekannt ist, beeinflussen Messgrößen können auch andere Anästhetika verwendet werden, oder eine der previously genannten Verfahren der freiwilligen Verbrauch Methoden können genutzt werden. 1-5
Diese Technik, die als mit den zuvor beschriebenen Techniken ist eine Herausforderung, wenn sie auf trächtige Weibchen durchgeführt. 7 Eine mögliche Ursache der hohen Sterblichkeit in dieser Gruppe kann Darmperforation führt zu einer Sepsis aufgrund der Darm durch die Eier in den coelom verschoben werden. In ähnlicher Weise, wenn die Eier sowie Darm perforiert sind, dann eine akute Ei-assoziierten coelomitis können ebenfalls auftreten. Solche Ereignisse können beim Laichen die trächtige Weibchen vor gavaging minimiert werden. Alternativ kann eine Reduzierung der Blechdicke Katheter verwendet, um den Vorgang auszuführen.
Wenn Zebrafisch einer kleineren Größe verwendet werden, sollte darauf geachtet werden, um die Größe des Schlauchs und der Nadel so einzustellen, dass der Durchmesser und die Länge in den Mund und Verdauungstrakt passen wird.
Die Effizienz des Verfahrens kann weiter erhöht werden, wenn eine zweite individual waren auf die Anästhesie zu überwachen und gewährleisten eine konstante Versorgung mit betäubten Fische in den einzelnen Durchführung der Magensonde. Diese Technik ist relativ einfach zu beherrschen und erfordert keine umfangreiche Praxis, Kenntnisse zu gewinnen. Darüber hinaus wird das Verfahren nicht erfordern spezielle Ausrüstungen oder Einrichtungen.
Fehlersuche
Wenn der Zebrafisch nicht geworden in 2-3 min narkotisiert, ändern Sie die Narkose Lösung oder verwenden Sie einen frisch zubereiteten Stammlösung. Wenn das Rohr nicht leicht gleiten Darmtrakt des Zebrafisch sollte kleineren Rohrdurchmesser verwendet werden. Es kann vorteilhaft sein, den Umgang mit einer kleinen Anzahl von ähnlich großen Fisch, um den richtigen Durchmesser und die Länge des Schlauchs sowie zu bewerten, ob die verabreichte Volumen geeignet für die zebrafishs Größe zu gewährleisten. Der Schlauch kann auch markiert, um die ideale Eindringtiefe für die Größe der Fische, die genutzt werden, beachten.
Sobald diese Technik beherrscht, kann es verwendet werden, um eine exakte Menge an verschiedenen Verbindungen oder Infektionserregern erwachsenen Zebrafisch effizient und konsequent zu liefern, so dass es nützlich für verschiedene Forschungs-Protokolle. Diese Technik kann auch minimiert die Anzahl der Fische erforderlichen Experimente durchzuführen, und eine präzise Messungen der Wirkungen verschiedener Verbindungen auf die Fische.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Die Rockefeller University Vergleichende Bioscience Center geliefert Unterstützung für dieses Projekt. Wir danken Janelle Monnas für technische Unterstützung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| A sponge | |||
| 1-cc luer lock syringe | Becton Dickinson Co | ||
| 22-G Micro-Renathane Implantation tubing (cut) | Braintree Scientific, Inc. | ||
| 1 22-G needle (cut, if needed) | Becton Dickinson Co | ||
| pH meter | Hanna probe | ||
| 1 scalpel blade | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| MS-222 (Finquel) | Argent Laboratories | ||
References
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