Summary
Bir hayvan modeli olarak zebrabalıkları artan kullanımı bileşikler ve çözeltiler bilinen miktarlarda teslimat için etkili yöntemlerin geliştirilmesini gerektirmektedir. Aşağıda açıklanan sonda prosedür yetişkin zebrafish için güvenli ve verimli bir şekilde, güvenilir bir çözüm hassas hacimleri sözlü teslimat için izin verir.
Abstract
Zebra balığı biyomedikal araştırma in vivo modelde önemli bir hale gelmiştir. Etkili yöntemler geliştirilmiş ve bilimsel araştırma için çözümler bileşikler veya acenteleri sunmak için kullanılmalıdır. Yetişkin zebrafish için sözlü bileşikler yönetmek için mevcut yöntemler balık gönüllü tüketimi değişkenlik nedeniyle yanlış. Bir sonda prosedürü biyomedikal araştırmalarda çalışma için Zebra balığı için enfeksiyöz ajanların hassas miktarlarda sunmak için geliştirilmiştir. Yaş 6 ay içinde Yetişkin Zebra balığı 150 mg / L ile anestezi edildi MS-222 tamponlu ve bir kesim 22-G iğne ucu bağlı esnek kateter implantasyonu boru kullanarak çözüm 5 ul zorla ağız yolundan verilmiştir. Borunun ucu solungaçları (yaklaşık 1 cm) uzamasına kadar esnek boru zebrabalıkları ağız boşluğu içine düşürülmüştür. Bu çözelti daha sonra yavaş yavaş bağırsak içine enjekte edildi. Bu yöntem, balık sorunsuz kurtarma ile, zamanın% 88 etkili olmuştur. Bubir kişi bir saat içinde 20-30 balık sonda gibi prosedürü de etkilidir. Bu yöntem, tam olarak yetişkin zebrabalıkları bulaşıcı hastalıklar çalışmalar ya da diğer bileşikler çalışmaları için ajanlar yönetmek için kullanılabilir.
Introduction
Zebra balığı için sözlü bileşikler yönetmek için mevcut yöntemler yönetmek bileşikler besleme üzerine üst kaplı, jelatin diyetler 1 karışık, tuzlu su karidesi 2 içine bioencapsulated, lipid kapsüllü diyetler 3, mum sprey boncuk 4 ve gluten tabanlı diyetler ile karışık içerir. 5 Sınırlamalar oral bu yöntemler yüksek yıkama oranları ve bireysel balık tarafından eksik veya öngörülemeyen bileşik tüketimi içerir. Bulaşıcı hastalık çalışmalarında, balık uygulanan enfektif doz çalışmasında başarı için kritik olabilir bilerek çünkü bu değişkenler sorunludur. Ayrıca, önceki çalışma su banyoları uygulanan bazı bileşikler çalışılan olabilir bağırsak etkileri ortaya çıkmadan önce solungaçları Zebra balığı için toksik lezyon neden olduğunu göstermiştir. 6
Sonda ak ile bir ürünün kesin miktarda yönetmek için diğer laboratuvar hayvan türlerinde kullanılan standart bir yöntemdirbiyomedikal ve ilaç araştırma çalışma için nown konsantrasyon. Ancak son zamanlarda literatürde tarif edilmiştir zebrabalıkları gavaging için yöntemler vardır. Açıklanan bir teknik çözüm 5 ul teslim etmek için bir 2-20 ul pipet bağlanmış bir 24 G kateter kılıf kullanılarak, iki kişilik bir yöntemdir. Tarif 7 yöntem, birinci ve ikinci bir mortalite oranı% 8.7 ve% 39 oldu sırasıyla deneme; mortalitenin en gebe kadın bağlandı. İkinci sonda tekniği 5 medakas çözüm ul (Oryzias latipes). Mortalite 8 bilgiler bulunmuyordu ve sonda tarif değildi yerine tam süreci yönetmek için kullanılan künt uçlu sonda şırınga nitelendirdi. Kadar balığın vücut ağırlığının% 1 Hayvan Bakım ve Laboratuar Zebra balığı, günü Kanada Konseyi'ne göre sonda ile verilebilir. 9,10 Amacımız com hassas cilt teslim bir tekrarlanabilir, güvenli ve etkili bir yöntem geliştirmektikilo sözlü her iki cinsten yetişkin zebrafish ve üreme her aşamasında. Bu prosedür, bir bileşiğin doğru oral dozlama gerekli olduğu herhangi bir çalışma için geçerli olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Anestezik sıvısının hazırlanması
- , Bir stok çözeltisinden veya toz şeklinde ya da ikinci sistem su içinde 150 mg / MS-222, L içinde bir çözeltisi hazırlandı.
- Bir pH metre kullanarak pH doğrulayın.
- PH 7-7.5 arasında olana kadar sodyum bikarbonat tampon olarak gerekli.
- Iyileşme süresi içeri kurtarmak için balık genellikle 1 dakikadan daha az olduğu için MS-222 ücretsiz sistem su tankı hazırlayın.
2. Gavaj Aparatı hazırlanması
- Ağzından balık bağırsak ampul yaklaşık uzunluğu biraz daha fazla açık 22-G implantasyon boru kesin. Başlangıçta, gerekli uzunluğu en iyi tahmin almak için kullanılan her yeni grup için bir balık anestezi öneririz.
- Bu güvenli ve ayırma riski yoktur kadar ½ inç 22-G iğne üzerine kesme açık implantasyon boru itin. Bir ½ 22-C iğne mevcut değilse, uygulama için daha uzun bir iğne kestiroximately bu uzunluğu.
- Tamamlandığında, kateter implantasyon boru 1 iğne ucundan cm, ya da balık küçük ise daha kısa uzanmalıdır.
- 1-cc luerlok şırıngaya 22-G iğne hub takın.
3. Gavaj için hazırlanıyor
- Bir neşter bıçak ile bir süngeri bir oluk kesin.
- MS-222 ücretsiz sistemi su sünger bekletin.
- Düz bir yüzeye nemlendirilmiş sünger yerleştirin.
- 22-G kateter tüp ve 1-cc şırınga içine sonda için uygun 5 ul çözüm hazırlayın.
4. Anestezi ve Gavaj
- Hızlı işlem öncesi en az 24 saat balık.
- Onun düzeltilmesi refleks kaybeder ve bir kuyruk yüzgeci tutam yanıt vermiyor, ama operküler hareket tutar kadar MS-222 çözüm balık yerleştirin. Bu genellikle 2-3 dakika sürer.
- Anestezi çözüm balık çıkarın ve içine yerleştirinBaş hafifçe sünger çıkıntılı ile sünger oluk, ama solungaçları sünger ile kaplı.
- Dikey pozisyona sünger taşıyın.
- 22-G kateter boru kullanarak Zebra balığı ağzına açın.
- Ucu solungaçları (yaklaşık 1 cm ya da boru uzunluğu) Son kadar yavaşça boru takın. Implantasyon boru zorunda olması gerekmez. Direnç tüp solungaç kemer veya kalp isabet olabilir göstermektedir.
- Direnç varsa, yavaşça, geri yeniden konumlandırmak ve yeniden deneyin.
- Yavaş yavaş malzeme enjekte edilir.
- Enjekte ederken, çözüm solungaçları veya ağız yoluyla çıkmak olmadığından emin olun.
- Alım deposunun içine sünger ve yerden balık çıkarın.
- Kurtarma tipik olarak en az 1 dakika içinde meydana gelir ve dik yüzme ve dengenin muhafaza balık tarafından belirtilir.
- Aktif m kovma balık görselleştirme tarafından gösterildiği gibi yetersizliği için balık Monitörağzında, ya da hiç operküler hareketinden aterial.
- Onlar iyileşti kez balık düzenli tanka iade edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Gebe kadın dahil olmak üzere balık, her iki cinste başarıyla (Şekil 1) zorla ağız yolundan verilmiştir edildi. Başarılı bir prosedür solungaçlar veya ağız çıkarken görülen herhangi bir sıvı ile bir dakikadan az sürer. Boru kateter çıkarıldıktan görülen kan ile, kuvvet olmadan, kolayca girer. Prosedür yaklaşık 10 dakika balık başına 30-45 saniye bir ortalama ile, 3 ile 4 balık sonda gerektiren, hızlıdır.
Balığı herhangi bir çözümün en fazla 5 ul zorla ağız yolundan verilmiştir olmamalıdır. 10 ul çözümleri ile sonda sadece en az% 50 başarı oranı (Şekil 2) ile sonuçlanmıştır. 10 ul Gavaj hamile kadınlarda, aynı zamanda tamamen başarısız oldu. Bu çalışmada, yetişkin balık 0.2 gr her biri ortalama tartılır. CCAC tavsiyesi kullanarak, bu çözüm 4 ul her balık için uygulanan olabilir anlamına gelir. 5 ul mevcut kullanımı bu önerilerle de uyumludur olacaktır. Bu teknik, yaklaşık% 10 oldu mortalitertesi gün ölü bulundu gebe kadın için çok atfedilebilecek y oranı. Bu ölüm oranı diğer rapor sonda teknikleri daha düşük olsa da bu çalışma amaçları için gerekli olmadıkça, ideal, fena halde gebe kadın zorla ağız yolundan verilmiştir edilmemelidir.
Şekil 1. Solüsyonu 5 ul kullanarak farklı üreme gruplar arasında oranında başarı ile karşılaştırılması. Kombine tüm gruplar oranında başarı% 88 idi. Gebe kadınlarda yüzde başarı% 100 vardı; olmayan gebe kadınlarda% 90 ve erkeklerde% 82 için.
Şekil 2. 10 ul karşı 5 ul kullanarak genel yüzde başarı karşılaştırılması. 5 ul kullanarak toplam yüzde başarısı% 88 idi. 10 ile toplam yüzde başarıul% 50 oldu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Önem
Bu teknik bir gelişmedir ve yetişkin zebrafish gavaging için iki daha önce açıklanan teknikleri üzerinde çeşitli avantajlar sağlamaktadır. İlk olarak, balık tutmaya bir sünger kullanımı iki kişi gerektiren bir önce açıklanan teknik aksine bir kişi, yordamı gerçekleştirmek için izin verir. 7 İkincisi, kateter implantasyon tüp nedeniyle ikincil travma en aza indirmek yardımcı olabilir, IV kateterler daha esnektir benzer künt uçlu şırınga kullanarak delinmesi. 7,8 Üçüncü olarak, açık bir boru kullanarak, çözüm kolayca balık giren görüntülenebilir. Ve son olarak, sonda cihaz pek çok balık zorla ağız yolundan verilmiştir edilmesi gerektiğinde, hızlı ve verimli bir şekilde tekrar kullanılabilir sağlayan stabildir. Genel olarak sonda tekniği tüketimi ve zebrabalıkları oral bileşiğin diğer uygulama yöntemlerinden görülen konsantrasyon varyasyonu azaltır ve bu nedenle de p için gerekli balık miktarını azaltabilirbir deney erform. 1-5
Kritik Adımlar
Ayrıca hızlı tüm Zebra balığı boş bir bağırsak ampul olmayan bir 12 saat ile bu yana en az 24 saat hızlı balık önemlidir. 24 saat hızlı bir şekilde ağız yoluyla yetersizliği ve çözelti kaybını önlemek ve kısmen dolu bağırsak 13 solungaçları yüzünden olur. En yaygın sorun sıvı boru bağırsak aşağı yeterince takılmamış belirten, ağız ya da solungaçları ile çıkılıyor. Ağızdan ya da solungaçları yoluyla çıkan sıvı, borunun doğru yerleştirme gözlem yanı sıra solungaçları bypass etmek için yeterli uzunlukta bir boru kullanılarak önlenebilir. Daha ciddi komplikasyonlar solungaç travma, iç kanama, bağırsak delinmesi, yetersizliği ve ani ölüm içerebilir. Bu komplikasyonlar ya da hemen görülebilir olmayabilir. Işlem tamamlandıktan sonra balık hiçbir baktı ise genellikle, ani ölüm, saat oluşurİlk kurtarma sırasında rmal.
Süngerler ağartıcı ve daha sonra, önceki balık ile temas durumuna gelen sodyum tiosülfat çözeltisi içinde ıslatılmıştır. Bu balık için zararlı olabilir herhangi bir ajan veya kimyasal kaldırıldı. MS-222 stok solüsyonu ışıktan uzakta ve en buzdolabında 5 gün için, karanlık bir kap içinde muhafaza edilmelidir. Kahverengimsi bir renk gözlenirse etkinliği azalır, çözelti, atılmalıdır. 11,12
Sınırlamalar
Bu protokol başarı sağlamak için zebrafish anestezi gerektirir. Anestezik ajan ölçülen araştırma sonuçları üzerinde olumsuz bir etkisi olabilir burada bazı durumlarda dezavantajlı olabilir. 12. Şu anda, anestezi gerektirmez Zebra balığı için bir sonda protokol yoktur. 7,8 MS-222 anesteziye biliniyorsa ölçülen değişkenleri etkileyen, diğer anestezik kullanılan, ya da önceki biri olabilirgönüllü tüketim yöntemleri iously belirtilen yöntemler kullanılabilir. 1-5
Gebe kadın üzerinde yapılan bu teknik, daha önce açıklanan teknikleri olduğu gibi zor. 7 bu grupta yüksek mortalite olası bir nedeni coelom içinde yumurta tarafından yerinden olan bağırsak nedeniyle sepsis yol açan bağırsak delinmesi olabilir. Yumurta yanı sıra bağırsak deliklidir Benzer şekilde, eğer, daha sonra bir akut yumurta ilişkili coelomitis da oluşabilir. Bu tür olaylar gavaging önce yumurtlama gebe kadın tarafından en aza indirilebilir. Alternatif olarak, daha küçük bir göstergesi kateter işlemi gerçekleştirmek için kullanılabilir.
Daha küçük bir boyutta zebrabalıkları kullanıldığında bakım çapı ve uzunluğu, ağız ve bağırsak içine uyacak şekilde, boru ve iğne boyutunu ayarlamak için önlem alınmalıdır.
Prosedürünün verimliliğini daha da arttırılabilir, ikinci bir individual anestezi izlemek ve sonda performans bireye anestezi balık sabit bir kaynağı sağlamak için vardı. Bu teknik usta nispeten kolaydır ve yeterlilik kazanmak için geniş uygulama gerektirmez. Buna ek olarak, bu prosedür özel ekipman veya tesisleri gerektirmez.
Sorun giderme
Zebra balığı 2-3 dakika içinde anestezi olmak yoksa, anestezi çözüm değiştirebilir veya taze hazırlanmış bir stok solüsyonu kullanın. Boru zebrafish bağırsak kolayca aşağı kaymamakta, daha küçük çaplı bir tüp kullanılmalıdır. Bu doğru çapı ve uzunluğu borunun hem de tatbik hacmi zebrabalıkları boyutu için uygun olup olmadığını değerlendirmek için sağlamak amacıyla benzer boyuttaki bir balık az sayıda kullanarak uygulama için yararlı olabilir. Boru da balık kullanılmaktadır büyüklüğü için ideal bir derinlik dikkat işaretlenebilir.
Bu teknik hakim sonra, çeşitli araştırma protokolleri için yararlıdır, etkin ve tutarlı bir yetişkin zebrabalıkları için çeşitli bileşiklerin veya bulaşıcı ajanların kesin bir miktar vermek için kullanılabilir. Bu teknik aynı zamanda deney gerçekleştirmek için gerekli balık sayısını en aza indirmek ve balık çeşitli bileşiklerin etkilerinin kesin bir zaman ölçüm izin verebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Rockefeller Üniversitesi Karşılaştırmalı Biyobilim Merkezi bu projeye destek sağladı. Teknik yardım için Janelle Monnas teşekkür ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| A sponge | |||
| 1-cc luer lock syringe | Becton Dickinson Co | ||
| 22-G Micro-Renathane Implantation tubing (cut) | Braintree Scientific, Inc. | ||
| 1 22-G needle (cut, if needed) | Becton Dickinson Co | ||
| pH meter | Hanna probe | ||
| 1 scalpel blade | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| MS-222 (Finquel) | Argent Laboratories | ||
References
- Royes, J. -A. B., Chapman, F. Preparing Your Own Fish Feeds. , Department of Fisheries and Aquatic Sciences, Florida Cooperative Extension Service, Insitute of Food and Agricultural Sciences, University of Florida. (2009).
- Gomez-Gil, B., Cabanillas-Ramos, J., Paez-Brambila, A., Roque, A. Standardization of the bioencapsulation of enrofloxacin and oxytetracycline in Artemia fransciscana Kellogg. Aquaculture. 196, 1-12 (1906).
- Langdon, C. Microparticle types for delivering nutrients to marine fish larvae. Aquaculture. 227, 259-275 (2003).
- Langdon, C., Nordgreen, A., Hawkyard, M., Hamre, K. Evaluation of wax spray beads for delivery of low-molecular weight, water soluble nutrients and antibiotics to Artemia. Aquaculture. 284, 151-158 (2008).
- Zang, L., Morikane, D., Shimada, Y., Tanaka, T., Nishimura, N. A Novel Protocol for the Oral Administration of Test Chemicals to Adult Zebrafish. Zebrafish. 8, 203-210 (2011).
- Goldsmith, J. R., Jobin, C. Think Small: Zebrafish as a Model System of Human pathology. Journal of Biomedicine and Biotechnology. , (2012).
- Tysnes, K. R., Jorgensen, A., Poppe, T., Midtlyng, P. J., Robertson, L. J. Preliminary expermients on use of zebrafish as a laboratory model for Giardia duodenalis infection. Acta Parasitologica. 57, 1-6 (2012).
- Marie, B., Huet, H., et al. Effects of a toxic cyanobacterial bloom (Planktothris agardhii) on fish: Insights from histopathological and quantitative proteomic assessments following the oral exposure of medaka fish (Oryzias latipes). Aquatic Toxicology. 114-115, 39-48 (2012).
- Canadian Council on Animal Care. CCAC guidelines on: the care and use of fish in research, teaching and testing. , CCAC. Ottawa, Ontario, Canada. (2005).
- Harper, C., Lawrence, C. The Laboratory Zebrafish. , CRC Press. Boca Raton, Florida, USA. (2011).
- De Tolla, L. J., Srinivas, S., et al. Guidelines for the Care and Use of Fish in Research. ILAR Journal. 37 (4), (1995).
- Topic Popovic, N., Strunjak-Perovic, I., et al. Tricaine methane-sulfonate (MS-222) application in fish anaesthesia. Journal of Applied Ichthyology. 28, 553-564 (2012).
- Field, H. A., Kelley, K. A., Martell, L., Goldstein, A. M., Serluca, F. C. Analysis of gastrointestinal physiology using a novel intestinal transit assay in zebrafish. Neurogastroenterology & Motility. 21, 304-312 (2009).
