Summary
この記事では、高分解能、蛍光標識したマウスの脳の微細脳解剖と、再構築するための完全な実験手順について説明します。説明されたプロトコルは、試料調製及び清算、画像化、データ後処理およびマルチスケール視覚化のための取付片を備えている。
Abstract
単一セルの解像度で、哺乳類の脳のアーキテクチャを理解することは、神経科学の重要な課題の一つである。しかし、脳全体を通して神経細胞の細胞体および突起部をマッピングすること、まだ画像およびデータ管理テクノロジの挑戦である。確かに、巨視的ボリュームはテラバイトの範囲内のデータセットを生成する、妥当な時間で高解像度とコントラストで再構築される必要がある。我々は最近、強化緑色蛍光タンパク質（EGFP）で標識したマウスの脳全体のミクロンスケールの再構成を得ることが可能な光学的方法（共焦点光シート顕微鏡、CLSM）を示した。シート光照明と共焦点検出を組み合わせ、CLSMは、高コントラスト、高速で巨視的クリア標本の奥深くイメージングを可能にする。ここでは、蛍光タンパク質で標識された全体のマウスの脳の包括的かつ人間が読める画像を得るために、完全な実験的なパイプラインを説明します。清算および取付けProceduresは、一緒に多くの並列隣接するスタックを取得することにより、その全体積に光トモグラフィを実行するための手順を記載されている。我々は、複数のスタックとマルチ解像度データナビゲーションのステッチングを可能にするオープンソースのカスタムメイドのソフトウェアツールの使用法を示した。すべてのプルキンエ細胞が選択的に標識されたL7-GFPトランスジェニックマウス、および不規則スパース神経細胞を標識することを特徴とTHY1-GFP-Mマウスからの全脳から小脳：最後に、我々は脳のマップのいくつかの例を示す。
Introduction
脳機能の基礎となる分子·細胞メカニズムの理解と比較すると、細かい神経解剖学の知識は、まだ初期段階1のままに見えます。実際に、我々はまだ、脳全体のニューロン細胞体または長距離突起の位置の包括的なマップを欠いている。実際に、多くの技術的努力が、顕微鏡の分解能でマウスの脳を再構築するために専念している。ナイフエッジ走査顕微鏡（KESM）2、マイクロ光学切片トモグラフィー（MOST）3および蛍光一番（fMOST）4等の樹脂包埋サンプルの連続切片に基づいて光学的方法は、サブミクロン3次元分解能を提供することができます全体マウス脳のイメージング。しかし、単一の試料の調製およびイメージングのために必要な総時間は、このような方法の実用化を制限する、数週間程度である。連続切片に基づいて別の技術（ただし、樹脂包埋なし）、連続2フォトン断層撮影（STP）5は 、高3次元分解能イメージングを可能にします。しかし、この技術は、1セクションごとに50ミクロン5を集め、非常にまばらなサンプリングに全マウスの脳で実証されており、我々の知る限り、STPはまだネズミの脳のフルサンプリング復興を生産していない。
高速で3次元で全体の標本を再構築する最先端の光学的な方法は、光シート顕微鏡6である。この光方式では、サンプルは、光の薄いシートで照射され、蛍光発光は、照明平面に垂直な軸に沿って収集される。このようにして唯一の合焦フルオロフォアは励起され、高いフレームレートを保証し、広視野構成の光学切片を実現することができる。屈折率整合液7と水との置換に基づくプロトコルをクリアに結合されたときに、光シート顕微鏡に適用されている全マウスの脳8などの巨視的な標本。しかし、クリア標本に影響を与えた試料に誘導される光の散乱は、取得した画像にぼかし総合追加ピンボケ蛍光体の励起につながる光シートを劣化させる。
のみを選択的焦点の合った光子を収集するために、我々は最近、共焦点検出スキーム9にシート光照明を結合さ。共焦点光シート顕微鏡（CLSM）で、アウト·オブ·フォーカスと散乱光子は検出前に、線形空間フィルタ（スリット）（ 図1）によって拒否されます。光シートアーキテクチャの共焦点動作を達成するために、照明を走査線によって生成され、検出経路における脱走査システムは、スリットの位置で励起走査線の静止画像が作成される。第3走査システムは、カメラセンサ上の二次元画像を再構成する。 CLSMはクリアマウスでは100％のコントラスト強調を与える従来の光シート顕微鏡に対して脳、10Hzのフレームレートを維持する。 CLSMで、それはZがX-Yでの2ミクロンと9ミクロンの分解能で全体のマウスの脳を再構築するために、単一の蛍光標識された神経細胞を識別するのに十分なコントラストで可能です。
この記事では、CLSMでマウス脳を再構築するための実験のパイプラインについて説明します。アルデヒドで固定し、マウス脳は過酸化物を含まテトラヒドロフラン一連の段階的に脱水し、その後Becker ら。10クリア試料によって開発されたプロトコルに従って、過酸化物を含まないジベンジルエーテル（ 図2）をクリアする慎重な先端に取り付けられているプレートとカスタムメイドの共焦点光シート顕微鏡のイメージングチャンバー内に配置。試料を直接プレート（図3a）の先端上に沈めることによって取り付けることができる、あるいは、それがクリアアガロースゲル（ 図の円板上に接着することができる図3（b））またはクリアアガロースゲル（ 図3c）で作られたビーカーのキャビティ内に配置。多くの平行に隣接するスタックは、すべての脳容積（ 図4）を覆うように取得されるように、脳全体の光断層画像は、その後、実行される。試料位置及び形状の大まかなマップを生成するプリトモサンプリングは、撮像のみ試料が占める体積で行われることを保証する。トモ·スタックは、その後、カスタムメイドのソフトウェアによって縫合し、多重解像度の階層スキーム11に保存されます。マウスの脳では、最終的には原型多重解像度Googleマップのような視覚化ソフトウェアを使用して検討することができます。これらの両方のソフトウェア·インストゥルメントは、オープンソースのプラットフォームVaa3D 12内のプラグインとして統合されています。
我々は最終的に細かいマウスneuroanatomを研究に記載された実験のパイプラインの能力を実証するために、マウスの脳の代表的な画像を表示するY。
Protocol
1。組織調製および保管
- 0.01MのPBS中ホルムアルデヒドの100ミリリットル4％に続いて20ミリリットルの0.01Mリン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液で標準経心灌流13を通してマウスの脳を固定します。慎重に7.6に、両溶液のpHを調整してpHのわずかに低い値がEGFPの蛍光を消光することができる。
- 4℃でホルムアルデヒド中で一晩、4％を切除した脳をポスト修正
- 4℃で0.01MのPBSに0.01 MのPBSおよびストアに2回（各30分）をすすぐ
2。脱水とクリア
注意：脱水するためのプロトコルと密接にクリアはベッカーらが記載したものを、次の10。
- 強く彩度を使用して基本的な活性化した酸化アルミニウム（アクティビティグレードブロックマンI、THFを約250グラム/ L）で、XFP蛍光フィルターTHFをクエンチ脱水溶媒（テトラヒドロフラン、THF）から過酸化物を除去するには列をtography。過酸化物の除去を減らすであろうと、列の割れは避けてください。
- THFを既に濾過前の安定したとしても、最終的な解決に安定剤（ブチル化ヒドロキシ、250 mg / Lの）を追加します。安定剤は、酸化アルミニウムが保持するという事実にあります。安定剤を含まないTHFが過酸化物を大量に開発することがあり、爆発し、危険なことができます。
- 純水中のTHFの段階的に直列に全マウス脳を脱水：50％、70％、80％、90％、96％、100％、1時間毎、次いで100％を一晩。回転ホイール上のサンプルでバイアルを置きます。光の露出を避けるために、アルミホイルでバイアルを包む。
- 濾過漏斗を用いて酸化アルミニウム（塩基性活性化、活性グレードブロックマンI、DBEの約250g / L）でクリア溶媒（ジベンジルエーテル、DBE）を絞り込む。
- 100％のDBEでサンプルをオフにします。 3および6時間後にソリューションを変更します。
3。試料載
- 脳は目で透明に見えたとき（典型第DBE変更後的に1時間）は、次のいずれかの方法により傾いてイメージングプレートの上にマウントします。
- 直接取付 -そっとチップ（ 図3a）のいずれかのサンプルを急落。
- アガロースディスク -先端には6％アガロースゲルで作られたディスク飛び込み。優しくアクリル接着剤でアガロースディスク上のサンプルを修正しました。（ 図3b）。硬化のために約1分待ちます。
- アガロースビーカー -先端に3％アガロースゲルからなるビーカー飛び込み。静かにビーカーの底（ 図3c）にサンプルを置く。
注1：それは、その全体がサンプルを撮像することが重要であるときに、アガロースビーカーにマウントすると、優先されるべきであるが、標本を囲むアガロースゲル、画像品質に有害である可能性があり、追加の光の散乱を生じさせる。サンプルの小部分は、撮像対象から除外することができれば、それが仕様をマウントする方がよいアガロースディスク上または直接チップ上imen。前者の方法は（嗅球のまたは脊髄の一部を画像化から除く）垂直脳を保つために、（脳の腹側または背側部分を画像化するから除く）水平後者の脳を維持するために最も適しています。
注2：アガロースゲルをTHFで脱水して、水中で調製する必要がある（50％、100％、4時間ごと）、および4時間またはそれは明らかに透明に見えるまで、DBE 100パーセントでクリア。
- 以前の方法の1以下の標本をマウントした後、ピンセットを用いて試料室内にイメージングプレートを配置。クリア溶液でチャンバーを埋める。
4。断層撮影の準備
- できるだけ多くの蛍光を収集するためにスリットを削除します。
- 光退色を防止するために、低いレーザーパワーで試料を照明する。
- ソフトウェア駆動微細位置決めの体系を使用して3方向にサンプルを動かすM。試料を照明し、カメラ（ 図4a）の視野内にある最小および最大の座標する各方向について特定する。
- 「プリトモ」サブルーチンのパラメータとして上記の座標を挿入します。また、隣接する断層撮影法で使用されるスタック、およびz方向のプリ断層サンプリング工程の間の距離を指定する。
- （4.4）で指定されたZのサンプリングを持つすべてのスタック内の画像を収集し、事前に断層を起動します。
注：収集された画像は、撮像時間を短縮し、従って、光退色、実際にのみ試料が占める体積に断層画像の取得を制限することができ、試料の形状や位置の大まかなマップ（ 図4b）を調製するために、ソフトウェアによって使用される。
5。トモ買収
- 微細位置決めシステムを使用して光シートの外にサンプルを移動します。
- 株式会社reaseレーザパワーと視野の中心においてのみ固定回線を照明するために、すべての走査システムの運動を停止させる。
- スリットをマウントし、クリア溶液からの自家蛍光信号を使用して、それに合わせます。あなたは明らかに、視野の中央にスリットラインが表示されるはずです。
- 、走査システムを再活性化するレーザーパワーを低減し、微細位置決めシステムを使用して光シート内の試料を移動します。スリットが使用されるレーザパワーは、空間光フィルタブロックの無視できない画分ので、それなしで使用されるものよりも高くなることに留意されたい。
- 画像がはっきりと明るく見えるまで、振幅を調整し、制御ソフトウェアでスキャンし、脱スキャニングシステムのオフセット。
- 実験のための適切なZの段階を設定した後、断層取得ソフトウェアを実行します。ボリュームは多くの並列、部分的に重複するスタック（ 図5a）で画像化され、画像が保存されます階層的なフォルダ構造。
6。ステッチと可視化
- 自動化されたソフトウェア（ 図4c）を用いた合成黒画像で（収集されたのと同じ型と大きさ、すなわち画像のもの-が、ゼロ強度で）取得したボリュームを完了します。このステップは、完全な体積に対処するためのステッチソフトウェアのためには必須です。
- （自由からダウンロードVaa3Dソフトウェアを起動しhttp://www.vaa3d.org/ TeraStitcherとTeraManagerがインストールされたプラグインを使用）。
- TeraStitcherプラグインをロードします。撮像されたボリュームを含むディレクトリを選択し、（基準に対して座標系を右手系）軸の相対的な向きを示し、ボクセルサイズ。
- ステッチの最初の部分を起動します。ソフトウェアは、スタックの夫婦間の相対変位を計算し、全体的な最適placemを見つける一緒にすべてのスタックのENT（ 図5b）。
- 単一解像度またはマルチ解像度フォーマットでステッチボリュームを保存するために選択します。後者はTeraManagerプラグインで多重解像度の可視化のために有効になります。高解像度画像は、数ギガバイトよりも大きい場合に両方の場合においても、モダリティセーブマルチスタックを選択し、個々のsubstacksのサイズを指定する。これは、格納されたデータへの効率的なアクセスを可能にします。
- ステッチの第二部を起動します。ソフトウェアは、整列スタックをマージし、単一または複数のスタックモード（ 図5Cおよび5D）のいずれかに保存します。最後にTeraStitcherプラグインを閉じます。
- TeraManagerプラグインをロードします。マルチスタック多重解像度ボリュームとフォルダを選択し、ボクセルサイズと方向を軸を示している。ボリュームには、最低解像度でロードされます。
- 高い解像度に拡大するには、右クリックmodalitを使用してランドマークを選択するVaa3DのYは、マウスのスクロールを使用してズームインします。別の方法としては、直接右クリックでズームインするROIを選択するか、関心ボリュームの座標を指定することができます。
- 低い解像度にはズームインしてするには、マウスのスクロールを使用しています。
Representative Results
記載されたプロトコルは、物理的なセクショニングを必要とせずに、ミクロンスケールの解像度全体マウスの脳を切除または部品のいずれかで再構成するために使用することができる。代表的な結果として、 図6にL7-GFPマウス（生後10日目）の小脳全体が示されている。この動物では、すべてのプルキンエ神経細胞は、EGFPで標識されている。我々は、ズームインする場合は、小脳皮質の典型的なラメラ構造（ 図7）を見ることができる。さらにズームインすると、明らかに各プルキンエ細胞体（ 図8）を区別することができます。記載されたプロトコルは、このように様々な神経発達の研究において、神経細胞の空間的組織をスクリーニングするために使用することができる。
第2の代表的結果として、我々は大人のTHY1-GFP-Mマウスのunsectioned脳から画像を提示。このトランスジェニック動物においてEGFPは、ランダムスパースニューロンのサブセットで発現される。脳の右半分を図9にで示されている。我々のようにさらにズームアップして（10と11を図 ）また、神経突起は区別可能になる。この結果は、記載されたプロトコルは、神経変性疾患のマウスモデルにおける細胞の分解能で全脳の解剖学的構造を研究する可能性を開いて、全体成体マウスの脳において、ミクロンスケールの分解能イメージングを可能にすることを示している。
図1。励起経路を示す装置の共焦点光シート顕微鏡（CLSM）の光学スキーム。（A）は上面図、。 488nmのダイオード励起固体（DPSS）レーザからのレーザ発光は、前記第1望遠鏡による膨張及びコリメーション後、ビーム強度を調節する音響光学チューナブルフィルタ（AOTF）に入る。そして、第望遠鏡はさらにビームを拡大する。 （Y方向）に垂直ガルボミラーは、BEをスキャン検出経路を示す装置の試料室内部レンズによって集束される時には、（b）は側面図、。検出目的で収集された光は垂直方向にガルボミラーによりデスキャンと移動励起線の固定画像を生成する、レンズによって集束される。定着画像の位置に線形空間フィルタ（スリット）が配置されます。スリットした後、4fをレンズ系内部に配置されたガルボミラーは、電子増倍電荷結合素子（EM-CCD）のチップ上に2次元画像を再構成する。蛍光バンドパスフィルタは、検出前に、すべての励起迷走光を除去。励起、検出およびバンドパスフィルタリングされた検出光の代表的な光線は、それぞれ、青色、青色光および緑色の光線で示されている。実際に顕微鏡で使用されるすべてのレンズの焦点距離が示されている。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください 。
図2標本クリア。ホルムアルデヒドで固定し、マウスの脳を、4℃でPBS 0.1 Mに記憶される（a）は、（（THF、b）は、続いて、100％のジベンジルエーテルでクリアテトラヒドロフラン一連の段階的に脱水さDBE と、c）。脱水工程はまた、いくつかの組織の収縮を引き起こす。
図3は、試料CLSM画像化のために実装。クリア脳に直接（b）は、クリアアガロースディスク上に接着、またはクリアアガロースビーカー（c）に挿入され、（a）は、ひっくり返した取付プレート上に急落することができる。
図4。断層画像取得プリ断層撮影ルーチン脳サンプルを（a）の画像にすべての試料を必要として平行に隣接するスタックの数と長さを定義することを含む平行六面体（b）に示す 。断層撮影法の後、黒画像は平行六面体（c）は 、取得した仮想ボリュームを完了するために生成される。
図5。ボリューム·スティッチ。収集された画像は、部分的にTeraStitcherプラグインの（b）を用いてそれらの正確な位置合わせを可能にする、（a）は、互いの間で重なり合うスタック。プラグインに関してはシングルスタック（C）またはマルチSTAのいずれかで整列スタックをマージし（D）多重解像度表現をcked。
図6。 P10のL7-GFPマウス、すべてのプルキンエニューロンがEGFPで標識されている全体の小脳。スケールバー、1ミリメートル。
図7。小脳皮質の典型的な層状構造を示す、図6に示した小脳の一部のズームアップ、スケールバー、500μmである。
図8。図6に示す小脳の一部のさらなるズームイン。プルキンエ細胞の細胞体を明確に区別することができるED。スケールバーは200μm。
図9。大人のTHY1-GFP-Mのまばらな非特異的神経細胞のEGFP標識によって特徴付けマウスの脳の右半分。スケールバー、1ミリメートル。
図10。海馬のと皮質の一部を示す図9に示す半脳の部分のズームアップ、スケールバー、200μmである。
図11。図9に示す半脳の一部分のさらなる拡大イン皮質における神経突起のいくつかは明確に区別することができる。スケールバー、50μmである。
Discussion
化学クリアと相まってCLSMは、蛍光プローブ、タンパク質のいずれかまたは合成色素で標識した全体のマウスの脳の神経解剖学を研究するための強力なツールを表しています。焦点面の外側に放射される光は、物理的空間フィルタにより遮断されるので、光学シートアーキテクチャの典型的な高フレームレートを維持しつつ、高コントラストイメージングは、厚い標本でも可能である。
記載された方法を使用した場合に対処する主な問題は、コントラストの最大化である。実際には、利用可能な信号が化学的および光学的要因の両方によって低減される。化学的観点から、有機溶剤に基づいて、清算手続きは、蛍光タンパク質および他の蛍光色素7からの発光を消光してもよい。ベッカーら 10によって記載されるように、溶媒の濾過は、過酸化物を除去し、溶媒をクリア組織においても、蛍光の良好なレベルを維持することができる。パブリッシュマウスの脳全体を扱うときエド水系クリアリング方法14は、少なくとも非線形光学技術を用いて、蛍光効率が低下するが、透明性が劣るをもたらさない。
一方、現時点では、高屈折率（n≈1.56）を使用したソリューションをクリアするために補正長作動距離との商用目的はありません。したがって、試料が浸漬される媒体と対物レンズの設計つとの間の屈折率不整合は、強力な球面収差を生じさせる。顕微鏡の分解能を低下させる他に、そのような収差は、光が広い領域に広がっているので、画像強度とコントラストの低下をもたらす。この問題の回避策が補償光学15および/ または静的な非球面補正器の使用を含む。
短いため、画像のコントラストや強度の任意の改善が容易に、また、イメージング速度に影響画像毎tegration時間を選択することができる。現時点ではCLSMは、100ミリ秒9のカメラの露出時間で、約106μmの3 /秒の撮影速度を得ることができます。この速度では、試料のサイズに応じて、1〜3日から画像全体のマウス脳をとる。画質の大幅な劣化が主な原因シート光照明6の本質的な低光退色のような長いイメージングセッション全体に観察されないが、長い間、単一のマウスの脳は、実際には、CLSMの適用可能性を減らすことができる画像する必要がありました。検出のための高速カメラを用いて結合されたシステム効率の10倍の増加は、記載されたプロトコルの日常的な使用を可能にする、数時間に撮像時間を減少させるであろう。
すべての上記の制限があるにもかかわらず、未満でミクロンスケールの分解能で全体のマウスの脳を再構築するために、組織が許すの化学クリアに結合されたCLSMイメージング週。全脳イメージングのための他の光学的方法は、CLSMよりも高い解像度を与えるが、より長い準備及び/または撮像時間2-4の価格で、またはスパースZサンプリング5。
この資料に記載された方法は、蛍光標識するための様々な戦略と組み合わせて使用することができます。実際には等を選択した神経細胞のサブセット、ウイルス性トランスフェクション、実質内色素注入、蛍光タンパク質を発現するトランスジェニック動物は、動物の犠牲の前にすべての染色戦略はCLSMと互換性があります。実際に、全体のマウス脳の死後蛍光標識は、現在までに実証されていない、染色のような種類が近い将来に可能である場合には、とにかく、CLSMによって再構築することができる検体数ははるかに大きくなり、潜在的にヒトの脳組織を含む。
結論として、共焦点光シート顕微鏡TISと組み合わせて使用スー清算および多重解像度のデータ管理は、研究者は、ほとんどの研究室の手元によくある技術的な努力で、ミクロンスケールの分解能で巨視的検体を再構築し、分析することを可能にすることができる。 CLSMの潜在的なアプリケーションでは、神経科学に限定されるものではなく、もちろんですが、16,17や小動物18の解剖学的構造を、胚発生、光シート顕微鏡が既に使用された全ての研究分野にまたがる。
Disclosures
著者は、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。
Acknowledgments
これらの結果につながる研究は、N助成契約の下で、欧州連合（EU）セブンス枠組み計画（FP7/2007-2013）から資金提供を受けています。 228334と241526。の枠組みの中で、この研究プロジェクトにもヒューマン·フロンティア·サイエンス·プログラムの研究助成金（RGP0027/2009）によって支えられてきた、とイタリアの教育省、大学·研究により、フラッグシップ·プロジェクトNanomaxの枠組みの中で、健康のイタリア省「幹細胞は、提案募集」。この研究は、「エンテカッサディ·ディ·フィレンツェRisparmio」でサポートされているのICON財団の研究活動の枠組みの中で行われている。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphate Buffered Saline Tablets | Sigma-Aldrich | P4417_100TAB | |
| Paraformaldehyde | Agar Scientific | R1018 | |
| Peroxide-free Tetrahydrofuran | Sigma-Aldrich | 186562 | |
| Aluminum oxide activated, basic, Brockmann I | Sigma-Aldrich | 199443 | |
| Dibenzyl ether | Sigma-Aldrich | 108014 | |
| Butylated hydroxytoluene | Sigma-Aldrich | W218405 | |
| Agarose Type III-A, High EEO | Sigma-Aldrich | A9793 | |
| Acrylic glue | Bostik | D2498 | |
| Vaa3D software | open source | freely downloadable from http://www.vaa3d.org/ |
References
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