Summary
En teknik för att transplantera "Extreme Anterior Domän" ansiktsvävnaden mellan Xenopus laevis embryon har utvecklats. Vävnad kan flyttas från ett genuttryck bakgrund till en annan, vilket gör studiet av lokala krav för kraniofaciala utveckling och för att signalera interaktioner mellan ansikts regioner.
Abstract
Kraniofaciala missbildningar förekommer hos 1 av varje 700 levande födda, men etiologin sällan känt på grund av begränsad förståelse för kraniofaciala utveckling. För att identifiera var signalvägar och vävnader agerar under mönstring av framkallnings ansiktet, har en "ansiktstransplantation" teknik utvecklats i embryon av grodan Xenopus laevis. En region av presumtiva ansiktsservetter (den "Extreme Anterior Domain" (EAD)) avlägsnas från en givare embryo vid tailbud skede, och transplanteras till en värd embryo av samma scen, från vilken motsvarande region har tagits bort. Detta kan användas för att generera en chimär ansiktet där värd-eller donatorvävnad har en förlust eller vinst av funktion i en gen, och / eller innefattar en härstamning etikett. Efter läkning, är resultatet av utvecklingen övervakas, och indikerar roller signalväg i givaren eller omgivande värdvävnader. Xenopus är en värdefull modell för ansiktet utveckling, som ansikts-regionen är stor och lätt enccessible för mikromanipulering. Många embryon kan analyseras, under en kort tidsperiod eftersom utvecklingen sker snabbt. Fynden i grodan är relevanta för mänsklig utveckling, eftersom kraniofaciala processer verkar bevaras mellan Xenopus och däggdjur.
Introduction
För att förstå mekanismerna bakom kraniofaciala missbildningar 1-2, viktiga vävnader och deras signal bidrag under kraniofaciala utveckling måste identifieras. I grodan Xenopus laevis, en del av ansiktet, inklusive munnen och näsborrar form från "Extreme Anterior Domän" (EAD), där ektoderm och endoderm direkt juxtaposed 3-4. EAD fungerar också som ett signaleringscentrum för att påverka omgivande vävnader, inklusive kranial neural crest, vilket bildar käftarna och andra ansiktsregioner 5. För att identifiera gener som bidrar till EAD-funktion, var en "ansikte transplantation" teknik som utvecklats, där vävnad transplanteras från en donator till en värd embryo, efter avlägsnande av motsvarande värdregionen. Efter transplantationen, vilket resulterar i ansiktet utveckling bedöms. Således är effekterna av förlust av funktion (LOF) eller vinst på funktion (GOF) för en specifik gen i EAD analyseras lokalt, där resten av head och kroppen är sammansatt av vildtyp vävnad. Den ömsesidiga transplantation kan utföras, där vildtyp vävnaden transplanteras in i embryon med global LOF eller GOF i specifika gener. Transplantation har ofta använts i Xenopus och chick Studier 6. Till exempel har Xenopus transplantation riktat homogenetic neural induktion, objektiv och neurala kompetens, och neurallist migration 7-10. Quail-chick chimär ympning har analyserat utvecklingen av den främre neurala plattan, främre neurala ås, neurallist och skallbenen 11-14. Detta är den första transplantationen teknik för studier av kraniofaciala utveckling i Xenopus. Har denna teknik visat en ny roll för Wnt-hämmare Frzb1 och Crescent i regleringen av basalmembranet bildning i den presumtiva munnen 5. Xenopus laevis är en idealisk modell för studier av kraniofaciala utveckling som embryon är stora, utvecklas externt, ennd ansiktet är väl synlig, så att mikromanipulation och avbildning av utveckling. Mekanismerna bakom ansikts utveckling verkar bevaras, vilket tyder på att resultaten av den grodan ge insikt i människans utveckling 4,15-16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förberedelse Reagens
- 10x MBS: Bered 1 L av 10x Modifierad Barths Saline (MBS) lösning 17. Se Tabell 1, Reagents, ingredienser, och instruktioner. Använd destillerat vatten för alla lösningar. Blanda i en bägare med hjälp av en omrörare, tills fullständig upplösning. Alla lösningar bör göras vid rumstemperatur.
- 1x MBS: Späd 100 ml 10x MBS-lösning i 900 ml destillerat vatten till 1 liter 1x MBS. Lägg till 0,7 ml av 1 M CaCl2-lösning.
- 0,1 x MBS: Späd 1x MBS att förbereda 1 L av 0,5 x MBS-lösning och 2 liter 0,1 x MBS lösning. Till 1 L av 0,1 x MBS-lösning, tillsätt 1 ml 10 mg / ml gentamycin lösning. Den 0,1 x MBS lösning med gentamycin kommer att användas för långsiktig embryo kultur.
- Ficoll / MBS: Lägg till 15 gram av Ficoll 400 till 500 ml av 0,5 x MBS-lösning. Blanda kraftigt. Lägg till en omrörare och blanda tills Ficoll är helt upplöst (flera timmar).
- 70% etanol: Späd 100% etanol till 70% etanol med användning avdestillerat vatten.
2. Förbereda Glass Drifts Verktyg
- Needle förberedelse: Ladda kapillärrör in en nål avdragare.
- Dra nålar enligt de inställningar som visas i tabell 2: nål avdragare inställningar. Inställningarna är en Sutter Instrument Co Modell P-80/PC mikropipett avdragare och kapillär slangar, som beskrivs i tabellen för specifika reagenser och utrustning. Dessa inställningar är specifika för Sutter nål avdragare, och kommer att behöva justeras för andra maskiner. Inställningar kan bestämmas med hjälp av en ramptest, som specificerats av maskinens tillverkare.
- Dra 4-6 nålar som förberedelse för förfarandet. Nålarna bör delas, så att den flexibla, hår-liknande delen av glasspetsen är helt borta, som typiskt är 2-3 mm långa. Spetsen måste vara relativt styvt, men fortfarande tillräckligt smal för att kunna användas som ett skärverktyg. Se foto av en perfekt nål i Figur 1A. Lagra de nålar i en petriskål med en remsa av lera längs mitten. Tryck på axeln av varje nål i lera, för att hålla den på plats och för att hålla den bräckliga skarpa spetsen bort från botten och sidor.
- För ytterligare verktyg, få glas täckglas, ett par långa standardmönster pincett, en bunsenbrännare och 3-4 glas Pasteur pipetter (Storlek 5 ¾ tum).
- Pipett verktyget: För att göra en pipett verktyg, tända bunsenbrännare och placera spetsen på ett glas Pasteur pipett i den blå delen av lågan samtidigt vrida den, så att spetsen smälter och hålet helt sälar, som bildar en sluten, rundad ände . Den rundade, förseglade spets används senare för att göra fördjupningar i leran skålen som håller embryona under operationen. Se Figur 1B.
- Glas broar: Att göra glas broar, använda långa standardmönster pincett för att försiktigt bryta av 3 mm med 3 mm bitar av täckglas glas. Håll i bit täckglas med tweezers, placera glaset i lågan tills alla fyra kanterna mjuka och kurvan nedåt och bildar en liten glaskupol. Kanterna bör inte längre vara vassa. Se figur 1C.
- Förvara glaset täckglas broar genom att sätta in dem, kanter ner, in i modellera, foder botten av en petriskål. Sätt bryggorna så att toppen av bron förblir ovanför lera yta. Tryck inte för hårt så att bron går sönder, och inte helt bädda bron i leran, eftersom det kan vara svårt att ta bort. Efter sterilisering med en låga eller 70% etanol, kan broarna återanvändas från experiment till experiment.
3. Förberedelser inför Embryo Operation
- Linje en liten 60 mm plast petriskål med modellera. Mellan användningar, är skålen och lera yta noggrant tvättades med destillerat vatten och därefter med 70% etanol.
OBS: Använd röd, vit eller gul, Van Aken Plastalina modellera, som kan köpas på en lokal tilly eller konst butik. Svart lera rekommenderas inte eftersom det frigör en rest. - Fyll skålen med 3% Ficoll 0.5x MBS-lösning. Ju högre saltkoncentrationen förhindrar vävnadsdissociering och polysackariden Ficoll hjälper till att förtjocka lösningen, som assisterar vid hållandet av ansiktet i positionen.
- Använd den flammade pasteurpipett verktyg (se figur 1) för att grunda, 2-3 mm fördjupningar i leran, om djupet av en etapp 20 embryo kropp. Gör 20-30 depressioner, 1-2 mm från varandra, på vardera sidan av skålen, så det finns totalt 40 till 60 fördjupningar. Märk en sida LOF / GOF, och den andra sidan av vildtyp, genom att bortse initialer in i leran med pincett.
4. Preoperation Embryo Framställning
- Skaffa och kultur Xenopus laevis embryon med hjälp av standardmetoder 17. För en detaljerad beskrivning av groda hållningen, se Sive et al. 17
- Fyrtioåtta timmar före försöket obtai ägg från kvinnliga grodor och utför provrörsbefruktning.
- Injicera 0,5-1 ng av det utjämnade membran GFP mRNA, plus någon önskad mRNA eller antisens morfolino-modifierad antisensoligonukleotiderna ("morpholinos") vid en cellstadiet eller i 2 celler vid 2 cellstadiet. I en cell stadium varar cirka 70-90 minuter. Injicera en total volym på 1-3 nl. I stället för RNA, som kodar för ett fluorescerande protein (t.ex. GFP eller RFP RNA) kan en injicera FITC-märkt morfolino-eller fluorescensmärkt dextran. Fluorescensen är viktigt för att bestämma om den transplanterade vävnaden läker och förblir i huvudet.
- Capped mRNA kan framställas från en linjäriserad plasmid med användning av en mMessage mMachine SP6-eller T7-kit. Morpholinos kan utformas och beställs genom Gene Verktyg LLC. Mängden morpholino som krävs för en önskad effekt måste bestämmas för varje gen 18.
- Förvara de injicerade embryon vid 15 ° C under 48 timmar, tills de når stadium 19-20. (Feller alla efterföljande steg, embryon scen enligt den normala bord av Xenopus laevis av Nieuwkoop och Faber 19.)
OBS: På dagen för operationen, måste både mottagar-och givar embryon vara inom en etapp av varandra för transplantationer för att fungera optimalt. Men embryon injiceras med morpholinos ("morphants") ibland utvecklas långsammare än vildtypen eller kontrollera morphant embryon, vilket gör det nödvändigt att samordna experiment så både morphant och vilda embryon typ är i samma skede. Morphants kan behöva hållas vid en högre temperatur av 12 till 24 h före ingreppet. För att öka sannolikheten för att embryon kan hittas på matchande stadier, kan embryon hållas vid flera temperaturer. Tjugofyra timmar före experimentet, bör man dela upp de embryon till en flera rätter och lägger morphants vid 18-20 ° C och vilda embryon typ vid 15-18 ° C.
- På dagen för transplantation experiment remove embryon från de 15 ° C inkubator och iscensätta dem enligt Nieuwkoop och Faber 19. Om de är yngre än sent neurula (etapp 19), lämna dem i rumstemperatur i 1-2 timmar, tills de når stadium 19.
- Sikta de injicerade embryona under ett fluorescerande mikroskop. Välj embryon som visar jämn, ljus fluorescens för experimentet.
- Ta bort skräp och eventuella föroreningar i närheten av operationsområdet. Torka av manöverytan, stereomikroskop och alla verktyg med 70% etanol.
- När embryona i etapp 19, ta bort vitellinmembranet med # 5/45 Dumont pincett under ett stereomikroskop.
- Ta vitellinmembranet 20-30 av varje givare och embryon värd.
- För de första ansiktstransplantation experiment, bör man träna med några embryon för varje tillstånd. Metoden är utmanande och kräver noggrann övning innan det kan användas i större skala, snabbt och framgångsrikt. Man kan arbeta up för att göra 20 transplantationer / experiment.
- Flytta embryon värd in i operations skålen med hjälp av en plast graderad överföringspipett med spetsen avskuren så att öppningen är mycket bredare än ett embryo (åtminstone några få millimeter). Var noga med att undvika att röra embryon till bubblor eller vattenytan, eftersom embryon kommer att explodera i ytspänningen.
- Använd # 5/45 pincett för att infoga embryona in i leran fördjupningar, med den bakre delen av embryot i leran. Stäng försiktigt leran runt baserna av embryot med hjälp av pincett, lämnar toppen fjärdedel av embryot, huvudet, sticker ut från depression.
- När alla värd embryon är säkrade i sina fördjupningar, flytta till den andra sidan av plattan och börjar att infoga givare embryon i sina fördjupningar. Upprepa processen för att säkra embryona i sina brunnar.
5. Utföra Face Transplant Surgery
- Skärkniv: Som en skärkniv för avlägsnandeav donator EAD vävnad, använd en lämpligt krossat glas kapillär nål (se steg 2.3 och figur 1).
OBS: Man kan direkt hålla kapillär mellan fingrarna (detta fungerar bra för personer med små händer) eller man monterar nålen i en insekt stift hållare. Electrosharpened volfram nålar 17 laddade i en stifthållare kan användas i stället för ett kapillärrör nål. Se förslag på stifthållare och volfram nålar i tabellen av särskilda reagenser och utrustning. - Enligt ett stereomikroskop, för in nålen i huvudet av embryot till vänster om cementkörteln. Nålen ska sättas in djupt, så att den passerar utanför embryot, genom huvudet, och in i framtarmen. För att transplantera hela EAD bör snitten sträcker sig från utsidan av embryot till framtarmen. För ektoderm enbart transplantationer, bör nedskärningarna vara grundare och sträcker sig endast genom ektoderm.
- Snärta nålen från vänster till höger sida avhuvudet, över hela bredden av cementkörteln. Den snärta är viktigt som motion ger ett rent snitt. Se figur 2A för en sammanfattning av tekniken och Figur 2B för en demonstration av nedskärningarna. Cement körtel och ögon är viktiga landmärken för nedskärningarna. Ordningen på nedskärningar påverkar inte resultatet och kan variera beroende på användarens önskemål eller opartiskhet.
- Placera nålen vid början av den föregående skuren, vid den vänstra gränsen av cement körteln, och stiletter nålen uppåt tills den når botten av det vänstra ögat. Detta kommer att skapa ett vertikalt snitt från vänster kant av cementkörteln till botten av det vänstra ögat.
- Placera nålen i den högra kanten av cementkörteln, och bläddra nålen uppåt tills den når botten på höger öga. Detta kommer att skapa ett vertikalt snitt från den högra kanten av den cementkörteln till botten av det högra ögat.
- För att till fullo excidera den vävnad, flick nålen från botten av vänster öga till botten av det högra ögat och skapar ett horisontellt snitt som kommer att frigöra vävnaden. Snitt kan sträcka sig från utsidan av embryot till framtarmen, inklusive både ektoderm och endoderm i EAD explantatet. Alternativt kan grunda nedskärningar användas för ektoderm enbart EAD transplantationer. När EAD vävnad tas bort, bör det finnas ett rektangulärt hål från utsidan av embryot i framtarmen, som sträcker sig från cementkörteln till strax under ögonen (topp till botten). Hålet ska sträcka sig från den inre kanten av vänster öga till innerkanten av den högra ögat (sida till sida). Se Figur 2BB.
- Tryck försiktigt utskurna vävnaden på spetsen av nålen, och lyfta den genom bufferten till den del av skålen som innehåller embryon värd. Utsätt inte vävnaden till ytan luften eller kommer det att bli skadad.
- Utskärning av samma vävnad från värdembryo, som för donatorn. Kasta värd EAD Explantation eller spara den till INSERt in givaren ansiktet, för ömsesidiga transplantationer.
- Sätt givaren explantatet i den resulterande värd hålet med # 5/45 pincett.
- När donatorvävnad är rätt placerad och helt insatt, försiktigt placera ett glas bro (se Figur 1 och Figur 2BC) under embryots ansikte att hålla transplantatet på plats. Ändarna av bryggan bör infogas i lera, som håller den på plats. Bron ska tryck försiktigt på den transplanterade vävnaden, så att transplantatet ligger i jämnhöjd med den mottagande huvudet, utan att det sticker ut huvudet eller ligger djupt inne i huvudet. Huvudet kan vara något tillplattad av locket glida, men var noga med att inte skada embryot med för mycket tryck. Transplantat bör utföras inom 5 minuter.
OBS: En erfaren utredare kan utföra tjugotal transplantationer per experiment, under 2-3 timmar. Under denna period embryona kommer att gå från scenen 20-22. Slutföra ansiktstransplantations vid stadium 21 eller 22 inte påverkar utfallet. Senare transplantationer (vid stegen 22-26) kan göras, men är svårare eftersom krönet fria EAD mittlinjen regionen minskat som kraniala neurallist flyttar in i ansiktet. Konsekvens mellan transplantationer är kritisk.
6. Face Transplant Post-operation Recovery
- Healing tar normalt 2-3 timmar. Låt embryona i rumstemperatur ostört i sina lera depressioner med glasbroar håller givarvävnaden på plats.
- När transplantationer har läkt, försiktigt bort glasbroar, ta bort leran från runt basen av embryon med hjälp av pincett, och använda en plast graderad överföringspipett att försiktigt dammsuga embryon ur sina depressioner.
- Placera embryon i ett lämpligt märkt petriskål, halvfylld med rena 0,1 x MBS med gentamycin.
- Odla embryona vid 15 ° C eller 18 ° C under flera dagar tills de når utfodring grodyngel scenen på scen 40, whöna ansikts fenotyper kan görs.
- Den 0,1 x MBS lösningen med gentamycin bör ändras dagligen, och eventuella döda embryon bör tas bort omedelbart för att förhindra kontaminering och död av andra embryon.
- Munnen öppnar vid stadium 40. I steg 40-41, måste man kontrollera att den transplanterade vävnaden förblir läkt på plats genom att visa dess fluorescens. Transplantationer ibland falla ut, så man måste se till att alla skårade embryon har donatorvävnaden på plats.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Transplanterade vävnaden bör helt införd i värdhuvudet efter transplantation som visas i figur 3A, och har ett glas bro lämpligt placerad på embryots ansikte, som visas i figur 2BC. Det transplanterade donatorvävnad måste vara korrekt dimensionerade för den mottagande öppningen, för transplantatet att vara framgångsrik. EAD vävnad bör inte skjuta ut från huvudet, på något sätt, såsom framgår av fig. 3B och 3C. Dessutom bör ansiktet transplantation inte roteras i förhållande till sin position på givarkroppen, som visas i figur 3D. Efter flera timmar, bör den transplanterade vävnaden och omgivande ansikts läka, och efter nästa dag, bör embryot visas som det exempel som visas i figurerna 4A och 4A '. Man kan observera under fluorescens, att transplantatet förblir på plats i figur 4B. I steg 41, kommer det transplanterade kontrollvävnad kontribute till munnen och förblir fluorescerande grön, sett i fig 4B. " Wild typ EAD vävnad transplanteras in vildtyp värdar skulle ge upphov till normala ansikten, jämfört med ostörda embryon vildtyp. Men med LOF eller GOF donatorvävnad, ansikten ska läka och stanna kvar i huvudet, men dessa kan eller inte kan ge upphov till normala kraniofaciala strukturer, som visas i figur 3 i Dickinson och Sive 5.
| Reagens | Ingredienser | Instruktioner |
| 1 M CaCl2-lösning | 111 g CaCl2 per liter | Autoklav och förvara i en ml alikvoter vid -20 eller 4 ° C. |
| 10x Modifierad Barths Saline (MBS) lösning | 880 mM NaCl, 51,4 g | Justera volymen upp till 1 L med destillerat vatten. Anpassa den slutliga pH-värdet till 7,8 med NaOH ochsedan autoklav. |
| 10 mM KCl, 745,5 mg | ||
| 10 mM MgSO 4, 1,2 g | ||
| 50 mM HEPES (pH 7,8), 11,9 g | ||
| 25 mM NaHCOs 3, 2,1 g | ||
| 1x MBS Lösning | Slutliga koncentrationer: | Bered 1x MBS-lösning genom att blanda 100 ml av 10x MBS saltlösningen med 0,7 ml av 1 M CaCl2-lösning. Justera volymen upp till 1 L med destillerat vatten. Späd denna lösning för att göra 0,5 X MBS och 0,1 x MBS. |
| 88 mM NaCl | ||
| 1 mM KCl | ||
| 0,7 mM CaCl 2 | ||
| 1 mM MgSO 4 | ||
| 5 mM HEPES (pH 7,8) | ||
| 2,5 mM NaHCOs 3 |
Tabell 1. Reagenser, ingredienser och instruktioner.
| Hetta | Dra | Vel. | Tid |
| 800 | 70 | 40 | 50 |
Tabell 2. Nål avdragare inställningar *.
* Nål avdragare inställningar varierar från maskin till maskin, så varje labb kommer förmodligen behöver för att optimera sin egen nål avdragare inställningar.
Figur 1. Verktyg användas. A) visar en intakt obruten nål och en bruten nål efter den flexibla spetsen har tagits bort. B) skildrar två pipettspetsar verktyg med sina ändar helt tätade och rundade. C) visar tre provglas broar. Skala barer = 1,000 mm.
... Figur 2 Sammanfattning av ansikte transplantation metod A) Allmänt Transschema:. En Embryon Schematisk bild av ansiktet transplantation metoden injiceras med ett fluorescerande ämne och en antisensoligonukleotid morpholino vid 1 cellstadiet. Den fluorescerande medlet kan antingen vara GFP mRNA, FITC-märkta morfolino, eller fluorescerande dextran. B.. Presumtiva mun avlägsnas vid steg 22 från en värd vildtyp embryo och en donator morphant embryo. Den transplanterade vävnaden kan också utvidgas med den presumtiva näsan, som ligger direkt ovanför munnen regionen. Donator morphant vävnaden transplanteras till vildtyp värd, och därefter är fäst på plats med ett glas bron. Grå båge: kläckning körtel.
Figur 3. Schematisk bild av embryon strax efter transplantation. Frontal vyer visas. Den transplanterade vävnaden beskrivs i röda prickar. A och A 'skildrar ett perfekt resultat vid stadium 22. Vävnaden är helt inskjuten och korrekt placerad i huvudet. B och B 'visar en felaktig transplantation, med vävnaden delvis införd i huvudet. C och C visar en felaktig transplantation med de flesta av vävnaden införes i huvudet, men det överskotts region sticker ut från den helande plats. Denna vävnad kommer necrose, och hämmar läkningen av de omgivande, väl insatta regioner. D och D 'visar en felaktig transplantation, där ansiktet har roterats i värden, i förhållande till sin position i givaren. I tFrågan kommer att läka in i huvudet, men ansiktet kommer inte utvecklas normalt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Äldre embryon med perfekt resultat. Frontal vyer visas. cg: cement körtel, mo:.. mun A) Visar ett embryo en dag efter transplantation, visar en riktigt läkt transplantation vid steg 32 A ') visar samma embryo med en fluorescerande overlay, vilket bekräftar att den transplanterade vävnaden kvarstår B. ) Visar samma embryo vid steg 42 som hade en kontroll morfolino, GFP + transplantation flera dagar innan. Ansiktet har utvecklats ordentligt. B ')Visar samma embryo med en fluorescerande overlay, vilket bekräftar att den transplanterade vävnaden kvar i huvudet och har bidragit normalt ansikts strukturer. klicka gärna här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiska moment och Begränsningar: EAD ansikte transplantationen är tid och arbeta intensivt. Det kräver övning, stadiga händer, och fingerfärdighet för att fullända. Ansiktet transplantation protokoll bygger på forskarens förmåga att effektivt ta bort och transplantationsvävnad. Om man tar för lång tid att föra in transplantation i värdens ansikte, kommer värd ansikte börjar att dra ihop sig och läka. Tång kan användas för att varsamt expandera ansikts-regionen. Men om betydande sårkontraktion har inträffat, transplantationen kommer inte läka så bra och kan behöva minskas i storlek för att passa in i värdens ansiktshålet. Transplantationen storlek och form skall ungefär motsvara storleken och formen på mottagarens ansikts hålighet, för att möjliggöra framgångsrik insättning.
Face transplantationer är mest framgångsrika när de utförs mellan stegen 19-22, med embryon som matchas av scenen. Äldre ansiktstransplantationer, mellan stegen 22-26, är möjliga, men är mer utmanande end kan störa neural crest migration i sidorna av ansiktet eftersom krönet fria mittlinjen regionen blir betydligt smalare från steg 22-26.
Både mottagaren och givaren måste vara likartade scener för transplantationen ska fungera optimalt. Helst ska de vara samma scen, och minimalt måste vara inom några timmar från varandra. Embryon som injicerats med antisens-RNA morpholino oligonukleotider ("morphants") ibland utvecklas långsammare än vildtypen eller kontrollera morphant embryon, som kräver att morphants odlas vid en högre temperatur för att matcha vildtyp embryon stadier.
Donator ansikte vävnad bör inte roteras i den mottagande kroppen i förhållande till dess ursprungliga läge i givarembryo, annars ansiktet inte kommer att utvecklas normalt. Cementkörteln behöver inte ingå i ansiktet transplantation för att förfarandet ska fungera, ansiktet utvecklas normalt utan den. Emellertid är cementkörteln ofta ingår i than extirpated ansiktsservetter, eftersom det fungerar som en tydlig markör för att indikera och placera undersidan av transplantatet. Denna markör kommer att bidra till att undvika misstag rotera vävnaden under överföringen av ansiktet vävnad till mottagaren. Om transplantatet har satts in felaktigt i den mottagande ytan, kan donatorvävnad tas bort och kasseras. Man kan försöka att sätta in en ny transplantation i samma värd, om öppningen inte har börjat tygla. Men om den mottagande öppningen har märkbart minskat, sedan kasta värden och börja på nytt.
Det är viktigt att placera glaset bro direkt på det transplanterade ansikte, så att transplantatet hålls i värdens huvud under läkning. Om transplantatet inte hålles på plats, kan transplantatet extruderas från värdens ansikte. Transplantat som inte är fullt insatta i ansiktet eller som dyker under läkningen kommer att genomgå nekros. Även i perfekta transplantationer, kan små mängder av vävnadsdöd uppstår runt kanterna of transplantatet. Vanligtvis detta inte medför negativa effekter och en helt normal ansikte kan fortfarande bildas. I lyckade kontroller har vi inte observerat någon missbildning efter fyra veckor av utveckling tyder på att brosk bildas normalt och att avvisandet av vävnaden är sällsynt.
Slutligen, om en morfolinogrupp perturbs ett protein som erfordras för normal sårläkning, denna teknik kan inte, såsom den transplanterade LOF vävnad inte kan införlivas i värdhuvudet.
Möjliga ändringar och Felsökning: Ändringar kan göras till förfarandet. Med lite övning kan forskaren lära sig att transplantera mindre regioner, till exempel hälften av EAD. Grunda snitt tillåter ektodermala transplantationer, lämnar djupare endoderm ostört. Andra regioner av embryonal vävnad kan transplanteras, genom att använda liknande metoder.
Om den transplanterade vävnaden dör efter insättning, det finns ett par av possible orsaker. Transplanterad vävnad som inte är helt insatt i värden eller på lämpligt sätt hålls på plats med ett glas bro, kommer att dö och hindra ett korrekt läkning. Se till att helt sätta den transplanterade vävnaden och fäst den på plats med ett glas bro. Om transplantationen kommer från en morfolino eller RNA injiceras donator, då vävnaden kan dö på grund av toxicitet från injicerade vätskor. Likaså om värd embryon är morphants eller RNA-injicerade och ofta dör, då mängden morfolino eller RNA kommer att behöva reduceras. Lös problemen, titrera mängden injicerat RNA eller morfolino och bestämma en säker belopp för lyckade ansiktstransplantationer. Slutligen ökar saltkoncentrationen i lösningen MBS ovanför 0,1 x kan också hjälpa till att läka.
Betydelse: Ansiktet transplantation beskrivna tekniken möjliggör analys av de lokala krav och aktivitet av genprodukter under kraniofaciala utveckling. Detta tillvägagångssätt kan klargöra signaling mellan utvecklings noncrest, neurallist och omgivande strukturer. Det gör att man kan undersöka LOF eller GOF (använder någon strategi) i alla EAD-härledda vävnader, vilket inte är möjligt med någon enstaka promotor driven konstruktion. Även om det finns en lång historia av vävnadstransplantation i utvecklingsbiologi detta är den första tillämpningen av transplantation till studiet av kraniofaciala utveckling i grodor och är avgörande för mekanistiska studier 7. Således kan tekniken bidra till att riva upp de komplexa mekanismer som styr mönstring och bildandet av ryggradsdjur ansiktet och för att klargöra orsakerna till kraniofaciala utvecklingsdefekter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Vi tackar Radek Sindelka för hans hjälp, och Cas Bresilla för att hjälpa till med grodan djurhållning och embryo förberedelse. Detta arbete har finansierats av NIH via bidrags R01DE021109 till HLS Laura Jacox finansierades av Herschel Smith Graduate Fellowship vid Harvard University och en F30 enskilda stipendium bidrag F30DE022989-01 genom NIDCR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pasteur pipette | VWR | 14672-400 | Lime Glass |
| Size 5 3/4 in | Cotton Plugged | ||
| Graduated Transfer Pipette | VWR | 16001-180 | Disposable |
| #5/45 forceps | Fine Science Tools by Dupont medical | 11251-35 | Angled 45° |
| Standard Pattern Forceps | Fine Science Tools | 11000-20 | Straight; serrated tip; stainless steel |
| Capillary Tubing (for needles) | FHC | 30-30-1 | Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID/Fiber |
| Cover slip | VWR | 48393 252 | 24 x 60 mm micro cover glass; |
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F9378 | |
| Needle Puller | Sutter Instrument Co | Needle Puller: discontinued Filament: FB300B | The most similar, currently available needle puller is the P-97. For filaments, use Sutter 3.00 mm square box filaments, 3.0 mm wide. |
| Model P-80 | Flaming / Brown micropipette puller | ||
| Stereomicroscope | Zeiss | ||
| Stereomicroscope Lighting by Fostec | Fostec | Use a light box with 2 fiberoptic arms. | |
| Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26018-17 | Jaw Opening Diameter: 0-1 mm |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Tools | 26016-12 | Jaw opening Diameter: 0-1 mm |
| Tungsten Needles | Fine Science Tools | 10130-05 | 0.125 mm Rod diameter |
| Van Aken Plastalina | Blick | #33268-2981 | |
| Modeling Clay- white, red, or yellow | |||
| mMessage mMashine SP6 or T7 Kit | Ambion | AM1340 |
References
- Gorlin, R. J., Cohen, M., Levin, L. Syndromes of the head and neck. , Oxford University Press. UK. (1990).
- Trainor, P. Craniofacial birth defects: The role of neural crest cells in the etiology and pathogenesis of Treacher Collins syndrome and the potential for prevention. Am. J. Med. Gen. A. 152, 2984-2994 (2010).
- Dickinson, A. J., Sive, H. L. Development of the primary mouth in Xenopus laevis. Dev. Bio. 295, 700-713 (2006).
- Dickinson, A. J., Sive, H. L. Positioning the extreme anterior in Xenopus: cement gland, primary mouth and anterior pituitary. Sem. Cell Dev. Bio. 18, 525-533 (2007).
- Dickinson, A. J., Sive, H. L. The Wnt antagonists Frzb-1 and Crescent locally regulate basement membrane dissolution in the developing primary mouth. Dev. 136, 1071-1081 (2009).
- Gilbert, S. F. Developmental Biology. , Sinauer Associates, Inc. Sunderland, MA. (2010).
- Borchers, A., Epperlein, H. H., Wedlich, D. An assay system to study migratory behavior of cranial neural crest cells in Xenopus. Dev. Genes Evol. 210, 217-222 (2000).
- Grunz, H. Homoiogenetic neural inducing activity of the presumptive neural plate of Xenopus laevis. Dev. Growth Differ. 32, 583-589 (1990).
- Servetnick, M., Grainger, R. M. Changes in neural and lens competence in Xenopus ectoderm: evidence for an autonomous developmental timer. Dev. Bio. 112, 177-188 (1991).
- Servetnick, M., Grainger, R. M. Homeogenetic neural induction in Xenopus. Dev. Bio. 147, 73-82 (1991).
- Couly, G., Coltey, P., Le Douarin, N. The triple origin of skull in higher vertebrates: a study in quail-chick chimeras. Dev. 117, 409-429 (1993).
- Couly, G. F., Le Douarin, N. M. Mapping of the early neural primordium in quail-chick chimeras : I. Developmental relationships between placodes, facial ectoderm. 110, 422-439 (1985).
- Couly, G. F., Le Douarin, N. M. Mapping of the early neural primordium in quail-chick chimeras II. The prosencephalic neural plate and neural folds: Implications for the genesis of cephalic human congenital abnormalities. Dev. Bio. 120, 198-214 (1987).
- Lievre, A. L., Le Douarin, N. The early development of cranial sensory ganglia and the potentialities of their component cells studied in quail-chick chimeras. Dev. Bio. 94, 291-310 (1982).
- Kennedy, A., Dickinson, A. Median facial clefts in Xenopus laevis: roles of retinoic acid signaling and homeobox genes. Dev. Bio. 365, 229-240 (2012).
- Trainor, P., Tam, P. Cranial paraxial mesoderm and neural crest of the mouse embryo- codistribution in the craniofacial mesenchyme but distinct segregation in the branchial arches. Dev. 121, 2569-2582 (1995).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. Early Development of Xenopus laevis. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2000).
- Tandon, P., Showell, C., Christine, K., Conlon, F. Morpholino injection in Xenopus. Methods Mol. Biol. 843, 29-46 (2012).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , Garland Publishing. New York. (1994).
