Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

प्रोस्टेट कैंसर में Biomarker डिस्कवरी के लिए आवेदन: व्यक्तिगत HERV loci अभिव्यक्ति की माइक्रोएरे आधारित पहचान

Published: November 2, 2013 doi: 10.3791/50713
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,3,4, 1,2, 5, 1,4,6, 1,4,7, 1,2
1Joint Unit Hospices de Lyon-bioMérieux, 2Medical Diagnostic Discovery Department, BioMérieux, 3Department of Pathology and Cytology, Centre Hospitalier Lyon Sud, Hospices Civils de Lyon, 4Medical Faculty, Lyon 1 University, 5Data and Knowledge Laboratory, BioMérieux, 6Department of Biochemistry and Molecular Biology, Centre Hospitalier Lyon Sud, Hospices Civils de Lyon, 7Department of Urology, Centre Hospitalier Lyon Sud, Hospices Civils de Lyon

Summary

मानव जीनोम का 8% पर कब्जा है, जो मानव अंतर्जात रेट्रोवायरस (HERV), दुर्लभ कोडिंग क्षमता है लेकिन एक लाख लंबे टर्मिनल दोहराता (लीटर) बरकरार रहती है. एक कस्टम Affymetrix माइक्रोएरे व्यक्ति HERV ठिकाना अभिव्यक्ति की पहचान करने के लिए डिजाइन किया गया था और भविष्य में नैदानिक ​​अध्ययन के लिए अवधारणा के एक सबूत के रूप में प्रोस्टेट कैंसर के ऊतकों पर इस्तेमाल किया गया था.

Abstract

प्रोस्टेट विशिष्ट प्रतिजन (पीएसए) के नैदानिक ​​प्रयोग में प्रोस्टेट कैंसर के लिए मुख्य नैदानिक ​​biomarker है, लेकिन यह विशेष रूप से कम खुराक मान 1 में, विशिष्टता और संवेदनशीलता का अभाव है. 'पीएसए का उपयोग कैसे करें' या तो एक स्पष्ट भेदभाव कैंसर और noncancer 2 के बीच या रोगी पालन के लिए किए जाने की अनुमति नहीं है 2.5-10 एनजी / एमएल के सीरम में एक एकाग्रता को इसी एक ग्रे क्षेत्र के रूप में निदान के लिए, एक ताजा अंक बनी हुई है ऊपर पोस्ट ऑपरेटिव पीएसए के विश्लेषण के रूप में गतिज मापदंडों उनके व्यावहारिक आवेदन 3,4 के लिए काफी चुनौतियां खड़ी कर सकते हैं. वैकल्पिक रूप से, noncoding RNAs (ncRNAs), बीमारी के रूप में उपन्यास मार्कर की सेवा प्रोस्टेट कैंसर 5,6 में जैसे PCA3 और ट्यूमर जीव विज्ञान की uncharacterized पहलुओं को उजागर करने की क्षमता के साथ, मानव कैंसर में महत्वपूर्ण अणुओं के रूप में उभर रहे हैं. इसके अलावा, 2012 में प्रकाशित सांकेतिक शब्दों में बदलना परियोजना से डेटा अलग आरएनए प्रकार जनरल के बारे में 62% को कवर से पता चला किome. यह भी विनियामक रूपांकनों की राशि प्रोटीन कोडिंग exons को इसी एक से कम से कम 4.5x अधिक है कि प्रतीत होता है. यह संक्रामक रेट्रोवायरस में उनकी प्राथमिक कार्य है के रूप में इस प्रकार, मानव अंतर्जात रेट्रोवायरस (HERVs) की लंबी टर्मिनल दोहराता (लीटर), ख्यात / उम्मीदवार विनियामक दृश्यों की एक विस्तृत श्रृंखला का गठन. मानव जीनोम भर में फैले हुए हैं जो HERVs, कॉपी पेस्ट प्रचार प्रक्रियाओं के द्वारा पीछा किया और मानव जीनोम का 8% कब्जा परिवार (एक्सॉनों हमारे जीनोम के 2% अवधि ध्यान दें कि MULTICOPY के लिए अग्रणी रोगाणु लाइन के भीतर पैतृक और स्वतंत्र संक्रमण से उत्पन्न ). कुछ HERV loci अभी भी कैंसर 7-10 सहित कई विकृतियों के साथ संबद्ध किया गया है कि प्रोटीन व्यक्त करते हैं. हम बेहतर बेहतर वे ncRNA प्रतिलेखन या एम ड्राइव अगर वे सक्रिय किया जा सकता है समझने के क्रम में, व्यक्तिगत HERV loci अभिव्यक्ति की विशेषताएँ करने के लिए लक्ष्य Affymetrix प्रारूप में, एक उच्च घनत्व माइक्रोएरे तैयार की हैodulate जीन अभिव्यक्ति कोडिंग. यह उपकरण प्रोस्टेट कैंसर क्षेत्र (चित्रा 1) में लागू किया गया है.

Introduction

(यह भी HERVs कहा जाता है) मानव अंतर्जात रेट्रोवायरस हमारे जीनोम भर में फैले हुए हैं. वे कॉपी पेस्ट प्रचार प्रक्रियाओं के द्वारा पीछा किया और MULTICOPY परिवारों के लिए अग्रणी रोगाणु लाइन के भीतर पैतृक और स्वतंत्र संक्रमण, से उत्पन्न. आज, वे कोई और अधिक संक्रामक रहे हैं, लेकिन वे मानव जीनोम का 8% पर कब्जा, तुलना का एक बिंदु के रूप में, एक्सॉनों मानव जीनोम का 2% अवधि. 2012 में प्रकाशित सांकेतिक शब्दों में बदलना परियोजना से डेटा विभिन्न आरएनए प्रकार intergenic क्षेत्रों में एक तिहाई सहित जीनोम के बारे में 62% को कवर दिखाया. इसके अलावा, यह विनियामक रूपांकनों की राशि प्रोटीन कोडिंग exons को इसी एक से कम से कम 4.5x अधिक है कि प्रतीत होता है. यह संक्रामक रेट्रोवायरस में उनके सामान्य समारोह के रूप में HERVs लंबे टर्मिनल दोहराता (लीटर), संभावित विनियामक तत्वों की एक विस्तृत रेंज का प्रतिनिधित्व करते हैं. ऐतिहासिक, अलग नाल या वृषण में व्यक्त कुछ स्थलों से, यह आमतौर पर HERV कारण ईपी को चुप हैं कि माना जाता थाigenetic विनियमन. इसलिए, हम बेहतर बेहतर वे lncRNA प्रतिलेखन ड्राइव या जीन अभिव्यक्ति कोडिंग मिलाना अगर वे सक्रिय हैं, चाहे समझने के क्रम में, व्यक्तिगत HERV loci अभिव्यक्ति की विशेषताएँ करने के लिए लक्ष्य Affymetrix प्रारूप में, एक उच्च घनत्व माइक्रोएरे तैयार की है. HERV-V2 GeneChip करार दिया यह उपकरण 23,583 HERV probesets एकीकृत करता है और 5573 एकल लीटर से बना अलग HERV तत्वों के साथ ही पूर्ण और आंशिक proviruses (चित्रा 2) भेदभाव कर सकते हैं.

निदान, आकलन, और योजना:

प्रोस्टेट कैंसर के निदान के नैदानिक ​​प्रयोगशाला में प्रोस्टेट विशिष्ट प्रतिजन (पीएसए) biomarker, रूपात्मक प्रोस्टेट के परिवर्तन और पैथोलॉजिस्ट ने मनाया अंत में प्रोस्टेट बायोप्सी का मूल्यांकन करने के लिए एक डिजिटल गुदा परीक्षा की खुराक पर आधारित है. प्रोस्टेट कैंसर के लिए पीएसए के रूप में पारंपरिक कैंसर बायोमार्कर के बीच पर्याप्त विशिष्टता और संवेदनशीलता की कमी है, व्यापक रूप से वायुसेना में पहचाना गया हैनैदानिक ​​निहितार्थ के आतंकवाद कई दशकों 1. प्रारंभ में, पीएसए प्रोस्टेट 11 के adenocarcinoma के निदान और उपचार के लिए प्रस्तावित किया गया था. यह कैंसर जांच के लिए प्रस्तावित और बीमारी 12 के विकास की निगरानी के उत्तरार्द्ध था. हालांकि, नियमित रूप से पूछा जाता है जो एक सवाल बनी हुई है: 'पीएसए का उपयोग कैसे करें'. (Ii) दो बड़ी पलटन पढ़ाई यूरोप में हजारों लोगों के सैकड़ों दाखिला और (मैं) 2.5-10 एनजी के सीरम में एक एकाग्रता को इसी एक ग्रे क्षेत्र / एमएल एक स्पष्ट अंतर कैंसर और noncancer 2 के बीच किए जाने की अनुमति नहीं है सिद्धांत रूप में हालांकि सरल, ऐसे पीएसए निकासी, पीएसए वेग और समय दोहरीकरण के रूप में पोस्ट ऑपरेटिव पीएसए गतिज मापदंडों (iii) विश्लेषण, अमरीका रोग विशिष्ट मृत्यु दर 13,14 के मामले में स्क्रीनिंग की उपयोगिता के बारे में एक स्पष्ट निष्कर्ष पर आने के लिए विफल व्यावहारिक आवेदन 3,4 में काफी चुनौतियां खड़ी कर सकते हैं. हम biomarker अनुप्रयोग, आने वाले वर्षों में उम्मीद है कि हो सकता हैlications सतर्क कर और अधिक या ट्यूमर phenotype के आधार पर कम आक्रामक उपचार के बीच एक नैदानिक ​​विकल्प का समर्थन करेंगे. रोगविज्ञानी द्वारा प्रदान की गई निदान के संबंध में, एक पहली सीमित कारक (कई तरह के कैंसर नमूना से याद किया जाता है) प्रोस्टेट बायोप्सी के भीतर एक 20% झूठी नकारात्मक निदान से आता है. एक दूसरी चिंता प्रतिकूल प्रभाव उपस्थित हो सकता है जो एक नकारात्मक एक है, के बाद एक अतिरिक्त बायोप्सी प्रक्रिया के लिए जरूरत के साथ संबंधित है.

कट्टरपंथी prostatectomy वर्तमान में प्रोस्टेट कैंसर के लिए मानक उपचार में से एक है. यह (10 ग्लीसन 7) विशेष रूप से आक्रामक पैटर्न के मामले में 45-65 साल से उम्र बढ़ने, स्वस्थ रोगियों में Multifocal ट्यूमर या स्पर्शनीय ट्यूमर का प्रस्ताव है. यह अब रोबोट की मदद से सर्जरी का उपयोग कर अपने विभाग में किया जाता है. क्योंकि आणविक मार्कर आने वाले वर्षों में सबसे ज्यादा महत्वपूर्ण होगा कि बढ़ती सबूत के, हम अपने सभी रोगियों को प्रोस्टेट के लिए एक कार्यक्रम में भाग लेने की संभावना का प्रस्ताव करने का निर्णय लियाऊतक बैंकिंग. अधिक संक्षेप में, प्रोस्टेट कैंसर पर विस्तार आणविक अनुसंधान कार्यक्रमों prostatectomy के नमूनों से उच्च गुणवत्ता ताजा ट्यूमर ऊतकों के लिए उपयोग के लिए एक बढ़ती आवश्यकता के परिणामस्वरूप है. इस शोध में विशेष रूप से जीनोमिक दृष्टिकोण, उच्च डीएनए / आरएनए गुणवत्ता के बड़े नमूनों की आवश्यकता है. Tumoral और एक ही रोगी से सटे 'गैर tumoral' ऊतकों की जरूरत है. कट्टरपंथी prostatectomies से निपटने और प्रसंस्करण के लिए सिफारिशें मंच और मार्जिन की स्थिति और इस तरह संभावित आगे के इलाज और रोग का निदान है कि निर्धारित रोग सुविधाओं को संरक्षित करने के लिए तैयार कर रहे हैं. किसी भी ताजा ऊतक नमूने विधि, इसलिए, निदान करने के लिए स्वीकार्य होने के लिए बाद में रोग आकलन समझौता नहीं करना चाहिए. प्रोस्टेट के macroscopic विच्छेदन के लिए मुश्किल है और काफी ध्यान मार्जिन ऊतकों और सम्पुटी आक्रमण करने के लिए भुगतान किया जाना चाहिए: प्रोस्टेट बैंकिंग के लिए किसी भी विच्छेदन हमेशा एक सहमत के अनुसार एक प्रशिक्षित uropathologist द्वारा आयोजित किया जाना चाहिएडी प्रोटोकॉल. चिकित्सा संकाय और राज्य चिकित्सा बोर्ड की आचार समिति इन जांच करने के लिए सहमत हुए हैं और सभी रोगियों को प्रोस्टेट ऊतकों बैंकिंग में शामिल करने के लिए सहमति प्राप्त हुई थी सूचित किया.

Protocol

1. सर्जरी

एक पैथोलॉजिस्ट ने की सत्ता में ले लिया जब तक एक बार सर्जन द्वारा हटाया, बर्फ पर प्रोस्टेट रखना.

2. प्रोस्टेट ऊतकों की हैंडलिंग

  1. Perioperative ischemia की देरी का सम्मान करने के लिए, शल्य पृथक होने के बाद 30 मिनट के भीतर समर्पित कर्मचारियों द्वारा प्रयोगशाला में बर्फ पर कट्टरपंथी prostatectomy नमूनों हस्तांतरण. ठंड की देरी कम से कम 20-30 मिनट (चित्रा 3) होना चाहिए.
  2. वजन और सामान्य प्रोटोकॉल (बाईं ओर काला दाएं पर जैसे हरी,, आंकड़े 3 बी और 3C देखें) के अनुसार प्रोस्टेट दाग.
  3. पीछे की ओर (चित्रा 3 डी) पर ग्रंथि की एक बड़ी अनुप्रस्थ अनुभाग प्रदर्शन करना. प्रोस्टेट ओरिएंट और पूर्वकाल पक्ष पर डाल दिया. एक बाँझ सर्जिकल चाकू के साथ पीछे की ओर पर ग्रंथि की एक बड़ी अनुप्रस्थ अनुभाग प्रदर्शन करना.
  4. संक्रमण क्षेत्र पर ऊतक के टुकड़े टुकड़े करना,(चित्रा 3E) बरकरार हाशिये छोड़ने बाएँ और दाएँ परिधीय क्षेत्र पर.
  5. एक Eppendorf ट्यूब में ऊतक की कोर रखो, तरल नाइट्रोजन (चित्रा 3F) में फ्रीज और दुकान तस्वीर. आप नहीं कर रहे हैं Biobank कदम 2.7 के साथ सीधे आगे बढ़ना.
  6. बायोप्सी पर कैंसर की कुल लंबाई 10 मिमी से बेहतर है ही अगर प्रोस्टेट बैंकिंग कार्य करें. प्रोस्टेट बंद करने के लिए और ग्रंथि विरूपण और शल्य मार्जिन (चित्रा 3 जी) की न्यूनतम विघटन को रोकने के लिए एक सीवन धागे का प्रयोग करें. फिर ऊतकीय विश्लेषण के लिए सामान्य प्रक्रिया के अनुसार आयल में formalin और एम्बेड साथ कट्टरपंथी prostatectomy नमूना तय कर लो.
  7. खड़ी अक्टूबर के एक छोटे से टीले पर जमे हुए ऊतक कोर माउंट और एक cryostat में वर्गों करें. एक पहले ही 5 माइक्रोन जमे हुए खंड लो और नीले toluidine साथ यह दाग.
  8. ऊतक की प्रकृति का विश्लेषण करने के लिए एक त्वरित ऊतकीय परीक्षा प्रदर्शन (यानी. सौम्य या घातक). Tumoral लिएऊतक, tumoral कोशिकाओं की मात्रा का अनुमान लगाने और tumoral कोशिकाओं के 80% से अधिक के साथ ही कोर का चयन करें.
  9. इस के बाद, एक नए एकल 5 माइक्रोन जमे हुए खंड प्रदर्शन और hematoxylin, eosin और सैफ्रन साथ यह दाग. फिर, x 30 माइक्रोन 15 वर्गों में कटौती और एक RNase मुक्त Eppendorf ट्यूब में जगह है.
  10. Hematoxylin, eosin और सैफ्रन के लिए एक पिछले 5 माइक्रोन जमे हुए खंड लो और प्रक्रिया के अंत में tumoral कोशिकाओं की मात्रा को नियंत्रित करने के लिए यह दाग.
  11. सूखी बर्फ में Eppendorf ट्यूब रखो और आणविक जीव विज्ञान प्रयोगशाला के लिए नमूना भेजने के.

3. शाही सेना निष्कर्षण, शोधन, और गुणवत्ता नियंत्रण

  1. Homogenization. ऊतक पूरी तरह से समाधान में भंग कर रहा है जब तक Trizol/100 मिलीग्राम ऊतक के 1 मिलीलीटर की उपस्थिति में homogenization प्रदर्शन करना. धीरे - धीरे Trizol समाधान जोड़ें और एक हाथ से आयोजित की चक्की का उपयोग कर बर्फ पर सावधानी से आगे बढ़ना. एक बार homogenized, Eppendorf ट्यूबों का हल विभाज्य और के लिए कमरे में अस्थायी में TRIzol में छोड़पांच मिनट.
  2. चरण जुदाई. 300 μl क्लोरोफॉर्म (या 150 μl BCP/1.5 मिलीलीटर Trizol) जोड़ें. भंवर 15 सेकंड फिर 2-3 मिनट के लिए कमरे अस्थायी पर छोड़ दें. 2-8 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 12,000 XG पर अपकेंद्रित्र
  3. शाही सेना वर्षा. एक नया ट्यूब ध्यान से शीर्ष जलीय चरण हस्तांतरण. 750 μl isopropanol जोड़ें. 10 मिनट (पलटने से आंदोलन) के लिए आरटी पर सेते हैं. सेल्सियस C/-31 ° -19 पर 2 घंटा सेते 2-8 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 12,000 XG पर अपकेंद्रित्र नमूने
  4. आरएनए धोने और निलंबन. Centrifugation के बाद, सतह पर तैरनेवाला हटायें. धो आरएनए 1 मिलीलीटर 80% EtOH (धीरे ​​ट्यूब रिवर्स) के साथ गोली. 2-8 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 7500 XG पर अपकेंद्रित्र नमूने P1000 और P10 उपयोग कर सतह पर तैरनेवाला निकालें. 2-3 मिनट के लिए शुष्क हवा EtOH शेष की अनुमति दें. 70 डिग्री सेल्सियस गर्मी ब्लॉक के लिए 100 μl RNase मुफ्त पानी, स्थानांतरण ट्यूब जोड़ें और गोली भंग करने के लिए 2-3 मिनट के लिए बैठते हैं. फिर बर्फ पर डाल दिया. पर -19 ° C/-31 डिग्री सेल्सियस के लिए लघु अवधि के भंडारण स्टोर और -लंबी अवधि के भंडारण के लिए 80 डिग्री सेल्सियस.
  5. शाही सेना शुद्धि. RNeasy मिनी किट (Qiagen) का उपयोग आरएनए शुद्ध. संक्षेप में, 100 μl शाही सेना के नमूने लिए 350 μl बफर RLT जोड़कर शुरू और मिश्रण अच्छी तरह से, फिर Qiagen प्रक्रिया का पालन करें. अंत में, गुणवत्ता नियंत्रण (3.6 कदम) के लिए (50 μl के बाहर) शुद्ध उत्पाद की विभाज्य एक 3 μl ले. पर स्टोर आरएनए -19 ° C/-31 डिग्री सेल्सियस एक अल्पकालीन अवधि के लिए या एक लंबी अवधि के भंडारण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस.
  6. शाही सेना के नायब (चित्रा -4 ए). निर्माता के निर्देशों के अनुसार, शाही सेना की गुणवत्ता और एक Bioanalyzer (Agilent) और एक Nanodrop (थर्मो) का उपयोग आरएनए अखंडता की जाँच करें. शाही सेना वफ़ादारी संख्या (Rin) शाही सेना गुणवत्ता का आकलन करने के लिए प्रयोग किया जाता है. विशेष रूप से, 18S और 28S चोटियों का पता लगाने में सफल दृढ़ता से आगे कदम में नमूने का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है.

4. WT-तालियाँ आरएनए प्रवर्धन

WT-ओवर का उपयोग प्रवर्धन चरणों को पूरा करने के लिए सिफारिशेंइष्टतम स्थितियों में व्यावहारिक प्रवर्धन किट:

  • Pipetting शुद्धता सुनिश्चित करने के लिए एक समय में कोई कम आठ से प्रवर्धन नमूने चलाएँ. 8 प्रतिक्रियाओं के 3 बैचों में किट का एक बंटवारे की आवश्यकता है कि मास्टर मिक्स तैयारी कर तब, जब 1 अपशिष्ट मात्रा के लिए खाते.
  • अन्यथा निर्देश दिए हैं जब तक हमेशा बर्फ पर thawed अभिकर्मकों और प्रतिक्रिया ट्यूबों रखना.
  • शुद्धि के लिए केवल एक ताजा 80% इथेनॉल के समाधान का प्रयोग करें.
  • प्रोटोकॉल के किसी भी स्तर पर रोक नहीं है.

  1. 25 एनजी / μl के एक एकाग्रता प्राप्त करने के लिए कुल शाही सेना पतला. पतला नमूना के 2 μl प्रक्रिया.
  2. तैयार करें पाली एक एक 1:25,000 कमजोर पड़ने प्राप्त करने के लिए पाली, एक नियंत्रण कमजोर पड़ने बफर (Affymetrix) के साथ पाली, एक शाही सेना स्टॉक का एक धारावाहिक कमजोर पड़ने, द्वारा शाही सेना नियंत्रण कील में समाधान.

    चरण 1: 4.3 से पहले कतरा सीडीएनए संश्लेषण - 4.8. इस प्रकार के रूप में उल्लेख किया अभिकर्मकों आपूर्तिकर्ता द्वारा निर्दिष्ट कर रहे हैं: A1 (प्रथम किनारा प्राइमर मिक्स), ए 2 (फाईRST किनारा बफर मिक्स), ए 3 (प्रथम किनारा एनजाइम मिक्स).

  3. कमरे के तापमान पर ए 1 और ए 2 पिघलना. 2 सेकंड के लिए 2 सेकंड और स्पिन के लिए एक भंवर मिक्सर का उपयोग कर मिलाएं. तो, जल्दी से बर्फ पर जगह है. बर्फ पर A3 रखें.
  4. एक 0.2 मिलीलीटर पीसीआर ट्यूब में कुल शाही सेना (50 एनजी) के 2 μl रखो और A1 के 2 μl (अंतिम मात्रा: 4 μl) जोड़ें. कैप और 2 सेकंड के लिए ट्यूब स्पिन.
  5. 5 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं तो बर्फ पर ट्यूब जगह.
  6. (एक भी प्रतिक्रिया के लिए दिया जाता है) के रूप में निम्नानुसार पहले कतरा सीडीएनए मास्टर मिश्रण तैयार करें. Pipetting द्वारा मिश्रण और मास्टर मिक्स संक्षेप में नीचे स्पिन. इसके तत्काल बाद, बर्फ पर जगह है.
    अभिकर्मक खंड
    पहली कतरा बफर मिक्स (A2) 5 μl
    पाली, एक शाही सेना नियंत्रण (1:25,000) 0.5 μl
    पहली कतरा एनजाइम मिक्स (ए 3) 0.5 μl
  7. जोड़ें 6 & #181, आरएनए / प्राइमर युक्त ट्यूब को मास्टर मिक्स के एल. 2 सेकंड के लिए ट्यूब, स्पिन flicking द्वारा मिक्स और जल्दी से बर्फ (अंतिम मात्रा: 10 μl) पर जगह है.
  8. 15 मिनट के लिए तो 1 फिर 10 मिनट के लिए तो मिनट, 25 डिग्री सेल्सियस, 10 मिनट के लिए 42 डिग्री सेल्सियस और 70 डिग्री सेल्सियस के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं. 4 डिग्री सेल्सियस पर शांत रखें , थर्मल cycler से प्रतिक्रिया ट्यूब निकालें संक्षेप में स्पिन और बर्फ पर रख. दूसरा कतरा सीडीएनए संश्लेषण कदम के साथ तुरंत जारी.

    चरण 2: 4.8 से दूसरा कतरा सीडीएनए संश्लेषण - 4.12. बी 1 (दूसरा किनारा बफर मिक्स) और बी 2 (दूसरा किनारा एनजाइम मिक्स) इस प्रकार है: उल्लेख किया अभिकर्मकों आपूर्तिकर्ता द्वारा भेजा जाता है.

  9. 2 सेकंड के लिए बी 2 और बी 3 स्पिन और जल्दी से बर्फ पर जगह है. कमरे के तापमान पर बी 1 पिघलना. 2 सेकंड के लिए एक भंवर मिक्सर का उपयोग करके मिक्स, जल्दी से 2 सेकंड के लिए स्पिन और बर्फ पर जगह है.
  10. (एक भी प्रतिक्रिया के लिए दिया जाता है) के रूप में निम्नानुसार एक दूसरा Strand मास्टर मिश्रण तैयार करें. Pipetting द्वारा मिश्रण और मास्टर मिक्स ब्री नीचे स्पिनउड़. इसके तत्काल बाद, बर्फ पर जगह है.
    अभिकर्मक खंड
    दूसरा किनारा बफर मिक्स (बी 1) 9.75 μl
    दूसरा किनारा एनजाइम मिक्स (बी 2) 0.25 μl
  11. प्रत्येक पहले Strand प्रतिक्रिया ट्यूब के लिए मास्टर मिक्स के 10 μl जोड़ें. 3x, बर्फ (20 μl अंतिम मात्रा) पर 2 सेकंड और जगह के लिए स्पिन pipetting द्वारा मिक्स.
  12. 5 मिनट के लिए तो 1 से 30 मिनट के लिए फिर 10 मिनट के लिए तो मिनट, 25 डिग्री सेल्सियस, 50 डिग्री सेल्सियस, और 70 डिग्री सेल्सियस के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं. 4 डिग्री सेल्सियस पर शांत रखें , थर्मल cycler से प्रतिक्रिया ट्यूब निकालें संक्षेप में स्पिन और बर्फ पर रख. बाद दूसरा किनारा संवर्धन कदम के साथ तुरंत जारी.

    चरण 3: 4.13 से बाद दूसरा किनारा संवर्धन - 4.15. इस प्रकार के रूप में उल्लेख किया अभिकर्मकों आपूर्तिकर्ता द्वारा निर्दिष्ट कर रहे हैं: बी 1 (दूसरा किनारा बफर मिक्स), बी 3 (रिएक्शन संवर्धन एनजाइम मिक्स).

  13. (एक भी प्रतिक्रिया के लिए दिया जाता है) के रूप में निम्नानुसार बी 1 और बी 3 मिक्स के संयोजन के द्वारा एक मास्टर मिश्रण तैयार करें. Pipetting द्वारा मिश्रण और मास्टर मिक्स संक्षेप में नीचे स्पिन. इसके तत्काल बाद, बर्फ पर जगह है.
    अभिकर्मक खंड
    दूसरा किनारा बफर मिक्स (बी 1) 1.9 μl
    रिएक्शन संवर्धन एनजाइम मिक्स (बी 3) 0.1 μl
  14. प्रत्येक दूसरा किनारा प्रतिक्रिया ट्यूब के लिए मास्टर मिक्स की 2 μl जोड़ें. 3x, बर्फ (22 μl अंतिम मात्रा) पर 2 सेकंड और जगह के लिए स्पिन pipetting द्वारा मिक्स.
  15. 20 मिनट के लिए तो 1 15 मिनट के लिए तो मिनट, 37 डिग्री सेल्सियस, और 80 डिग्री सेल्सियस के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं. 4 डिग्री सेल्सियस पर शांत रखें संक्षेप में स्पिन और बर्फ पर जगह, थर्मल cycler से प्रतिक्रिया ट्यूब निकालें. SPIA प्रवर्धन कदम के साथ तुरंत जारी.

    चरण 4: 4.16 से SPIA प्रक्रिया से भी कतरा सीडीएनए (sscDNA) संश्लेषण -4.19. सी 1 (SPIA प्राइमर मिक्स), सी 2 (SPIA बफर मिक्स), सी 3 (SPIA एनजाइम मिक्स) इस प्रकार है: उल्लेख किया अभिकर्मकों आपूर्तिकर्ता द्वारा भेजा जाता है.

  16. कमरे के तापमान पर सी 1 और सी 2 पिघलना. 2 सेकंड के लिए एक भंवर मिक्सर, स्पिन का उपयोग करने और जल्दी से बर्फ पर जगह से मिलाएं. बर्फ पर C3 पिघलना. धीरे 5x inverting द्वारा सामग्री मिलाएं. हवाई बुलबुले परिचय नहीं सुनिश्चित करें. फिर, बर्फ पर 2 सेकंड और जगह के लिए स्पिन.
  17. इस प्रकार है, एक 0.5 अपशिष्ट मात्रा के लिए लेखांकन, एक SPIA मास्टर मिश्रण तैयार करें. Pipetting द्वारा मिश्रण और मास्टर मिक्स संक्षेप में नीचे स्पिन. इसके तत्काल बाद, बर्फ पर जगह है.
    अभिकर्मक खंड
    SPIA-बफर मिक्स (सी 2) 5 μl
    SPIA-प्राइमर मिश्रण (सी 1) 5 μl
    SPIA एंजाइम मिक्स (C3) 10 μl
  18. बढ़ी दूसरा किनारा रिएक्शन टी को SPIA मास्टर मिक्स के 20 μl जोड़ेंUbe. 6-8X, स्पिन pipetting और जल्दी से बर्फ पर (42 μl अंतिम मात्रा) जगह से मिलाएं.
  19. 5 मिनट के लिए तो 1 तब मिनट, 60 मिनट के लिए 47 डिग्री सेल्सियस और 95 डिग्री सेल्सियस के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं. 4 डिग्री सेल्सियस पर शांत रखें , थर्मल cycler से ट्यूब निकालें संक्षेप में स्पिन और बर्फ पर जगह है.

5. sscDNA शोधन और गुणवत्ता नियंत्रण

  1. sscDNA शुद्धि. QIAquik पीसीआर शुद्धि किट (Qiagen) का उपयोग sscDNA शुद्ध. संक्षेप में, प्रवर्धित सीडीएनए उत्पाद के 42 μl के लिए 200 μl बफर पंजाब जोड़कर शुरू मिश्रण और स्तंभ पर भार. फिर Qiagen प्रक्रिया का पालन करें. अंत में, गुणवत्ता नियंत्रण (कदम 5.2) के लिए (30 μl के बाहर) sscDNA शुद्ध उत्पाद की विभाज्य एक 3 μl ले.
  2. (चित्रा 4 बी) उपज और आकार वितरण सत्यापन sscDNA. निर्माता के निर्देशों के अनुसार, sscDNA उपज और एक Bioanalyzer और एक Nanodrop का उपयोग कर आकार के वितरण की जाँच करें. प्रवर्धित सीडीएनए के वितरण का आकार चाहिए खई आम तौर पर 600 ठिकानों के चारों ओर एक चोटी के साथ लंबे समय तक 100 और 1500 के ठिकानों के बीच शामिल थे.

6. sscDNA विखंडन

  1. Nuclease मुक्त पानी के साथ मात्रा का समायोजन, 30 μl में सीडीएनए की 2 ग्राम तैयार करें.
  2. एक 10x OPA बफर प्लस समाधान से शुरू, 1x एक Phor सभी बफर प्लस (OPA) तैयार करें.
  3. 0.2 यू / μl DNase तैयार करें मैं (1 यू / μl DNase मैं का 5 गुना कमजोर पड़ने).
  4. के रूप में निम्नानुसार एक विखंडन मास्टर मिश्रण तैयार (एक भी प्रतिक्रिया के लिए दिया):
    अभिकर्मक खंड
    10X एक Phor सभी बफर प्लस 3.6 μl
    DNase मैं (0.2 यू / μl) 3 μl
  5. SscDNA के 30 μl के लिए विखंडन मिक्स के 6.6 μl जोड़ें.
  6. स्पिन और फिर 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर DNase मैं निष्क्रिय और बर्फ पर रखने के लिए, 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं. विभाज्य 1 &# 181; Agilent आधारित आकार वितरण सत्यापन के लिए खंडित सीडीएनए के एल.
  7. sscDNA आकार वितरण सत्यापन (चित्रा 4C). एक Bioanalyzer (Agilent) का उपयोग sscDNA आकार के वितरण की जाँच करें. खंडित सीडीएनए का आकार वितरण आम तौर पर 35 और 200 के ठिकानों के बीच शामिल किया जाना चाहिए.

7. खंडित sscDNA के लेबल

  1. DEPC पानी में 5 मिमी के डीएलआर-1A 7.5 मिमी पतला.
  2. के रूप में निम्नानुसार एक लेबलिंग मास्टर मिक्स (एक भी प्रतिक्रिया के लिए दिया) तैयार करें:
    अभिकर्मक खंड
    5x TdT प्रतिक्रिया बफर 14 μl
    CoCl 2 (25 मिमी) 14 μl
    डीएलआर-1A (5 मिमी) 1 μl
    टर्मिनल ट्रांस्फ़्रेज़ (400 यू / μl) 4.4 μl
  3. लेबलिंग मिश्रण का 33.4 μl जोड़ेंप्रत्येक खंडित सीडीएनए नमूना है.
  4. , ट्यूब flicking द्वारा मिक्स संक्षेप में स्पिन और 60 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं, तो बर्फ पर रहते हैं.

8. HERV चिप माइक्रोएरे संकरण

  1. PreHybridization मिक्स (Affymetrix) के 200 μl के साथ HERV GeneChip Prewet और 10 मिनट के लिए, 50 डिग्री सेल्सियस, 60 rpm पर सेते हैं.
  2. (एक भी प्रतिक्रिया के लिए दिया जाता है) के रूप में निम्नानुसार संकरण मिश्रण तैयार करें:
    अभिकर्मक खंड
    नियंत्रण Oligo बी 2 (3NM) 3.3 μl
    20x यूकेरियोटिक संकरण नियंत्रण 10 μl
    2x संकरण मिश्रण 100 μl
    99.9% DMSO 17.7 μl
  3. एक अंतिम Vo बनाने के लिए कमरे के तापमान पर खंडित और लेबल सीडीएनए के 69 μl को संकरण मिश्रण के 131 μl जोड़ें200 μl के lume.
  4. मिक्स और 95 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए denature, तो 5 मिनट के लिए अधिकतम गति पर 5 मिनट और अपकेंद्रित्र के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
  5. Prewetted HERV GeneChip खाली और 200 μl लक्ष्य तैयारी लोड. दो SEPTA पर कठिन स्पॉट लागू करें.
  6. 18 घंटे के लिए, 50 डिग्री सेल्सियस, 60 rpm पर संकरण.
  7. 18 घंटे के बाद, HERV GeneChip खाली और 4 डिग्री सेल्सियस पर एकत्र संकरण समाधान की दुकान चिप्स तुरंत 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत fluidics, पर नहीं चला रहे हैं, तो 250 μl धो बफर ए के साथ जांच सरणी भरें

9. वॉशिंग और धुंधला

  1. GCOS मेनू पट्टी से Fluidics चलाएँ. Fluidics संवाद बॉक्स में, ब्याज की स्टेशन चयन (1-4), तो सभी मॉड्यूल के लिए Shutdown_450 का चयन करें, तो चलाते हैं. मिल्ली क्यू पानी में 3 Fluidics आकांक्षा लाइनों को विसर्जित कर दिया. एलसीडी स्क्रीन निर्देशों का पालन करें.
  2. सभी मॉड्यूल के लिए Prime_450 कार्यक्रम लागू करें. धो बफर में लिए ट्यूबिंग रखें200 मिलीलीटर धो बफर बी युक्त एक बोतल में 400 मिलीलीटर धो बफर युक्त एक बोतल, और धो बफर बी के लिए एक तो फिर, एलसीडी स्क्रीन निर्देशों का पालन करें.
  3. सुई उठा और 600 μl दाग कॉकटेल 1 (SAPE समाधान मिश्रण) और 600 μl दाग कॉकटेल जगह 2 (एंटीबॉडी समाधान मिक्स) पदों # # 1 और 2 पर microcentrifuge ट्यूबों युक्त, और 800 μl सरणी स्थिति # 3 पर बफर समाधान पकड़े .
  4. स्क्रीन पर निर्देशों का पालन, FS450-004 प्रोटोकॉल का चयन करें और प्रत्येक मॉड्यूल चलाने के लिए, प्रत्येक मॉड्यूल के लिए सही चिप निरुपित.

10. स्कैनिंग

  1. GS3000 स्कैनर वार्म अप. यह हल्के हरे रंग बदल जाता है जब स्कैन करने के लिए तैयार है.
  2. लीक से बचने के लिए SEPTA पर कठिन स्पॉट लागू करें तो स्कैनर में सीधे वैकल्पिक रूप से autoloader में चिप लोड या. स्कैनिंग शुरू.
  3. चिप स्कैनिंग के बाद,. सीईएल फ़ाइलें उत्पन्न कर रहे हैं. <छवि की जाँच करें और जांच कोशिकाओं (पहचान को हाजिर करने के लिए ग्रिड से संरेखितमजबूत> आंकड़े 4D एफ).

11. डेटा विश्लेषण

  1. गुणवत्ता नियंत्रण. मानक Affymetrix का संदर्भ लें HERV-V2 चिप्स क्यूसी मानदंडों को पूरा करने वाले सत्यापित करने के लिए नियंत्रित करता है. इस प्रयोजन के लिए निम्नलिखित अभ्यावेदन इस्तेमाल किया जा सकता है: तीव्रता मंझला बनाम प्रवेश तीव्रता मूल्य वितरण (घनत्व भूखंडों और बॉक्स भूखंडों), मंझला निरपेक्ष विचलन (पागल) (पागल मेड) भूखंडों, पृष्ठभूमि भूखंडों, सामान्यीकृत unscaled मानक त्रुटि (Nuse) भूखंडों और रिश्तेदार प्रवेश अभिव्यक्ति (अन्वेषण) भूखंडों.
  2. सामान्यीकरण. इसके अलावा, डाटासेट अप्रत्याशित बैच प्रभाव को उजागर करने और सांख्यिकीय विश्लेषण से पहले उन्हें सही पता लगाया जाना चाहिए. पूर्वप्रक्रमन इस प्रकार एक पृष्ठभूमि सुधार (जैसे. tryptophan जांच आधारभूत संकेत के आधार पर), आरएमए सामान्य बनाने और संक्षिप्तीकरण 15 द्वारा पीछा शामिल है.
  3. डाटा खनन और अंतर व्यक्त जीनों के लिए खोज. चिप्स मानक के अनुसार और एक श्रेणीबद्ध clusteri लागूडेटासेट (चित्रा 6A) का पता लगाने के लिए एनजी दृष्टिकोण. फिर, माइक्रोएरे की एक शास्त्रीय महत्वपूर्ण विश्लेषण (एसएएम) एक झूठे खोज दर (एफडीआर) सुधार 17 से पीछा प्रक्रिया 16 का उपयोग करके विभिन्न व्यक्त जीनों (डीईजी) के लिए एक खोज करते हैं. इन चरणों का पूरी तरह से Partek जी एस की तरह कुछ सॉफ्टवेयर विश्लेषण सुइट्स में एकीकृत कर रहे हैं लेकिन वैकल्पिक रूप से Bioconductor परियोजना 19 से संकुल के साथ आर सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर 18 का उपयोग किया जा सकता है ध्यान दें. सांख्यिकीय विश्लेषण के बाद, अभिव्यक्ति मूल्यों को कम से कम 2 से 6 जिसके लिए probesets बाहर करने के लिए डाटासेट फिल्टर.
  4. दृश्य और व्याख्या. एनोटेशन डेटाबेस का उपयोग कर एक समर्पित अंतरफलक में HERV-V2 माइक्रोएरे से परिणामों की व्याख्या.

Representative Results

transcriptomic पढ़ाई का मान आरंभ जैविक सामग्री की गुणवत्ता में मुख्य रूप से निहित है. शाही सेना निकासी इष्टतम परिस्थितियों में किया जाता है, तो शाही सेना वफ़ादारी संख्या (Rin) आम तौर पर 7 या अधिक से अधिक (चित्रा -4 ए) है. Affymetrix HERV-V2 चिप पर सीडीएनए की 2 ग्राम संकरण करने की जरूरत है एक प्रवर्धन प्रक्रिया का उपयोग निकलता है. एक सफल प्रवर्धन कदम एक घंटी के आकार का वितरण (चित्रा 4 बी) की ओर जाता है. फिर, DNAse1 विखंडन करीब 100 nucleotides संकरण (चित्रा 4C) से पहले सीडीएनए आकार वितरण homogenize के क्रम में किया जाता है. संकरण और स्कैनिंग (चित्रा 4D) के बाद, छवि के एक दृश्य निरीक्षण ग्रिड अच्छी तरह से स्पॉट (चित्रा 4E) के लिए गठबंधन किया है, तो जाँच करने के लिए एक सक्षम बनाता है और संकरण नियंत्रण संगत कर रहे हैं अगर (चित्रा 4F). यह कदम प्रोटीन को बाहर करने के क्रम में भी उपयोगी है, जिसमें हवाई बुलबुले या त्रुटियों प्रयोग के दौरान हुई.

चिप्स क्यूसी (चित्रा 5) पारित किया है और सामान्य बनाने के बाद, ल्योन सूद अस्पताल से 5 मैचों की जोड़ी ट्यूमर और सामान्य प्रोस्टेट शाही सेना के नमूने के सांख्यिकीय विश्लेषण अंतर अभिव्यक्ति मूल्यों के साथ 207 HERV probesets की पहचान (p.val नेतृत्व करने के लिए एक बार <0.05) (चित्रा 6A). इन अभिलेखों का समर्थन करने के लिए और प्रोस्टेट विशिष्ट जानकारी प्राप्त करने के लिए, 35 अतिरिक्त मैच जोड़ी नमूने (पेट के, अंडाशय, वृषण, स्तन, फेफड़े और प्रोस्टेट) अंततः पहचान विश्लेषण और सैम एफडीआर प्रक्रिया (एफडीआर = 20%) में जोड़ा गया 44 प्रोस्टेट विशिष्ट HERV probesets. उनमें से, सबसे अधिक प्रासंगिक 10 HERV संरचनाओं (चित्रा 6B) में वर्णित हैं. आगे नैदानिक ​​अध्ययन इन उम्मीदवार बायोमार्कर की संवेदनशीलता और विशिष्टता के मूल्यों का आकलन करने के लिए आवश्यक हो जाएगा.

pload/50713/50713fig1.jpg "चौड़ाई =" 500px "/>
. क्लिनिक से समग्र प्रक्रिया के चित्रा 1 योजना उम्मीदवार बायोमार्कर की पहचान करने के लिए अग्रणी: (नमूना तैयार करने, लक्ष्य तैयार करने, माइक्रोएरे प्रसंस्करण 2-6) बेंच के लिए (1 चिकित्सक और रोगविज्ञानी द्वारा ऊतक तैयारी द्वारा prostatectomy) (7: HERV प्रोटीन की biocomputing विश्लेषण). सामान्य ऊतकों से निकाली गई न्यूक्लिक एसिड नारंगी में चित्रित कर रहे हैं; tumoral क्षेत्र से निकाली गई न्यूक्लिक एसिड (नारंगी) और विशिष्ट ट्यूमर (काला) न्यूक्लिक एसिड सामान्य का एक मिश्रण से मिलकर बनता है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2
. चित्रा 2 गर्भाधान और HERV-V2 चिप की सामग्री: HERV दृश्योंमानव जीनोम से लिया गया HERV-gDB3 नामक एक डेटाबेस में जमा हो जाती है, तो 25 पूर्व उम्मीदवार जांच परिणामस्वरूप लक्षित उप क्षेत्रों से प्रत्येक के लिए चित्रित कर रहे हैं (अंततः सरणी पर संश्लेषित किया जा रहा से पहले एक समर्पित संकरण मॉडलिंग प्रक्रिया (EDA) के माध्यम से पारित परिवार). बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 3
पैथोलॉजिस्ट ने चित्रा 3. प्रोस्टेट हैंडलिंग. (ए) ताजा कट्टरपंथी prostatectomy नमूना प्रयोगशाला को सौंप दिया है. (ईसा पूर्व) प्रोस्टेट (बाईं ओर काला दाईं ओर हरे,) दाग है. (डी) पीछे तरफ ग्रंथि के बड़े अनुप्रस्थ अनुभाग. (ई) बरकरार, piec हाशिये छोड़करऊतकों की तों प्रोस्टेट ग्रंथि के विभिन्न क्षेत्रों से विच्छेदित कर रहे हैं. ऊतक के (एफ) कोर एक Eppendorf ट्यूब में रखा जाता है. (जी) सीवन धागे प्रोस्टेट बंद करने के लिए और ग्रंथि विरूपण और शल्य मार्जिन की न्यूनतम विघटन को रोकने के लिए प्रयोग किया जाता है. फिर, कट्टरपंथी prostatectomy नमूना ऊतकीय विश्लेषण के लिए सामान्य प्रक्रिया के अनुसार formalin में फिक्सिंग के लिए तैयार है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 4
न्यूक्लिक एसिड तैयारी और संकरण दक्षता की चित्रा 4. गुणवत्ता नियंत्रण. (ए) शाही सेना अखंडता, (बी) सीडीएनए लक्ष्य और संकरण चरण में इस्तेमाल किया (सी) खंडित लक्ष्य परिलक्षित. गुतीन गुणवत्ता नियंत्रण आरएनए नैनो चिप्स और eukaryote नैनो Serie द्वितीय परख का उपयोग Bioanalyzer के साथ प्राप्त किया गया ese. (डी) स्कैनिंग के बाद HERV-V2 माइक्रोएरे संकरण क्षेत्र, (ई) ऊपरी बाएँ कोने दिखा ग्रिड संरेखण नियंत्रण की वृद्धि और संकरण नियंत्रण खोलना दिखा केंद्र क्षेत्र के (एफ) वृद्धि की समग्र छवि. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 5
संकेतों के चित्रा 5. प्रसंस्करण. (ए) Affymetrix Pólya कील में प्रवर्धन नियंत्रण. Pólya बी से डीएपी, Thr, पीएचई और लिस टेप को नियंत्रित करता है subtilis जीन शाही सेना के नमूने में नुकीला और समग्र सफलता का आकलन करने के लिए की सेवा कर रहे हैं लक्ष्य तैयारी चरणों की. तीव्रता कोई पूर्वाग्रह उच्च और निम्न व्यक्त जीनों के बीच WT-तालियाँ प्रवर्धन के दौरान वहां गया था कि यह सुनिश्चित करने के लिए इन स्पाइक में नियंत्रण के बीच मूल्यों को कम करने पर पता लगाया जाना चाहिए. (बी) Affymetrix कील में संकरण नियंत्रण. ई. से अलग ये लक्ष्य कोली और P1 जीवाणुभोजी लेबलिंग प्रक्रिया से पहले नुकीला कर रहे हैं. BioB, BIOC, BIOD और रचनात्मक से बढ़ती मूल्यों संकरण की समग्र सफलता का संकेत मिलता है. आरएमए सामान्य बनाने के बाद चिप संकेतों के (सी) तीव्रता वितरण. कम 2 से 6 (पृष्ठभूमि) से मूल्यों के साथ probesets प्रदर्शनी संकेतों के अधिकांश मुख्य रूप से कुछ विशेष HERV स्थलों तक ही सीमित एक समग्र अभिव्यक्ति का संकेत है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

ftp_upload/50713/50713fig6.jpg "चौड़ाई =" 500px "/>
चित्रा 6. डेटा विश्लेषण. सामान्य और tumoral नमूनों की (ए) पदानुक्रमित क्लस्टरिंग विश्लेषण. और नीचे सामान्य और tumoral नमूनों के बीच (नीला) नियमन - विभाजन क्लस्टरिंग, एक इयूक्लिडियन दूरी समारोह कलन विधि का उपयोग (लाल) ऊपर में probesets समूहीकरण सामान्यीकृत अभिव्यक्ति मूल्यों को लागू किया गया था. प्रोस्टेट कैंसर के उम्मीदवार biomarker के रूप में पहचान की शीर्ष 10 HERV संरचनाओं का (बी) के चुनाव में. प्रत्येक HERV तत्व के लिए, संबंधित HERV परिवार, जीनोमिक निर्देशांक (NCBI 36/hg18) और HERV संरचना का एक संक्षिप्त विवरण दिया जाता है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 7
चित्रा 7. HERV प्रदर्शनों की सूची. (ए) मानव जीनोम का अनुक्रमण 25,000 प्रोटीन जीन कोडिंग (एक्सॉनों, 2%) और 200,000 लंबे टर्मिनल दोहराने (लीटर) retrotransposons (HERV, 8%) सहित transposable तत्वों की एक बड़ी राशि का पता चला. HERV-V2 चिप सामग्री से (बी) एक्सट्रपलेशन और जुड़े अभिव्यक्ति डेटा (tumoral प्रकार के ऊतकों की तुलना में सामान्य 8 से होने वाले 79 नमूने) HERV प्रदर्शनों की सूची का एक तिहाई transcriptionally सक्रिय है कि सुझाव देते हैं. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

8 चित्रा
चित्रा 8. चिप से संकेतों के कार्यात्मक व्याख्या. (ए) के प्रोमोटर पहचान और epigenetic नियंत्रण: U3 नकारात्मक संकेत (लाल जांच, 5'LTR) आर U5 सकारात्मक संकेत बनाम (नीला जांच, 5'LTR) विभिन्न CPG मेथिलिकरण (ठोस काले हलकों) tumoral ऊतकों बनाम peritumoral सामान्य में U3 की सामग्री द्वारा समर्थित U3 संचालित प्रतिलेखन, सुझाव देते हैं. (बी) Splicing रणनीति: mRNA ट्यूमर में विशेष रूप से व्यक्त एन्कोडिंग ख्यात 3.1 केबी लिफाफा जांच ओवरलैपिंग SD1/SA2 ब्याह जंक्शन का उपयोग पहचान की है. * अन्य गैर अपरा ऊतकों के साथ तुलना से deduced. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

Discussion

पिछले 10 वर्षों में, HERV अभिव्यक्ति माप के लिए प्रयास की सबसे RT-पीसीआर तकनीक का इस्तेमाल किया है या तो HERV पीढ़ी 25,26 भीतर सामान्य रुझान का मूल्यांकन करने के लिए पीओएल जीन के सापेक्ष संरक्षण पर आधारित एक विशिष्ट ठिकाना 20-24 या पर ध्यान केंद्रित करने के लिए . इसके अतिरिक्त, HERV परिवारों 27,28 की अभिव्यक्ति का पता लगाने और यों करने का इरादा कम घनत्व प्रोटीन के साथ मिलकर अत्यधिक degenerated प्राइमरों का उपयोग पीसीआर amplifications. एक परिवार के भीतर व्यक्तिगत लोकस की अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए आदेश में, बाद में क्लोनिंग और अनुक्रमण के साथ संयुक्त संरक्षित क्षेत्रों की पीसीआर प्रवर्धन पर आधारित दृष्टिकोण के लिए HML-2 29,30 या HERV-E4.1 31 परिवारों के transcriptionally सक्रिय अलग तत्वों सक्षम पहचान की जा. इसके अलावा क्लोनिंग और अनुक्रमण कदम से समाप्त, सक्रिय HML-2 विशिष्ट मानव एकान्त लीटर पहचान दोहराता के बीच प्रमोटरों की पहचान करने के लिए लक्ष्य जीनोम दोहराने अभिव्यक्ति निगरानी तकनीक 34,35 भीतर paralogous तत्वों के बीच क्रॉस प्रतिक्रियाओं को कम करने के क्रम में दोहराया तत्व जांच डिजाइन के लिए उपयुक्त तरीके को शुरू करने, HERV transcriptome का विश्लेषण करने के लिए समर्पित उच्च घनत्व प्रोटीन की दो पीढ़ियों का विकास किया. HERV-W HERV एच, HERV ई 4.1, HERV-FRD, HERV कश्मीर HML-2 और HERV कश्मीर HML-5 परिवारों के 2,690 अलग proviruses और 2,883 एकल लीटर जो लक्ष्य HERV-V2 चिप का अनावरण किया ख्यात प्रोस्टेट कैंसर बायोमार्कर की पहचान से इस पत्र में सचित्र ऊतकों 35, की एक विस्तृत श्रृंखला में 1,718 HERV लोकी (आंकड़े 7A और बी) की अभिव्यक्ति. इसके अलावा, एक दिया लोकस पर कई probesets का उपयोग अपने transcriptional विनियमन के बारे में जानकारीपूर्ण है. सबसे पहले, एक U5 सकारात्मक एक के साथ संयोजन के रूप में एक U3 नकारात्मक संकेत एक प्रवर्तक के रूप लीटर का वर्गीकरण, और इसके विपरीत U3 सकारात्मक और U5 नकारात्मक संकेतों के एक polyadenylation भूमिका को प्रतिबिंबित कर सकते. हम इस तरह मैंसरणी द्वारा प्रदान की गई इस U3-U5 दिचोतोमोउस जानकारी के आधार पर ऊतकों 35 और, की एक विस्तृत रेंज में 326 प्रमोटर लीटर dentified, हम प्रस्तावित और प्रयोगात्मक ऐसे स्वायत्त प्रतिलेखन एक मेथिलिकरण निर्भर epigenetic प्रक्रिया 34 (चित्रा द्वारा नियंत्रित किया गया है कि कुछ चुनिंदा मामलों के लिए पुष्टि की 8). नाल में या tumoral वृषण 34 में ERVWE1/Syncytin1 अभिव्यक्ति प्रोफाइल से सचित्र के रूप में द्वितीय, जैसे लीटर से संकेतों का पता लगाने, झूठ और वातावरण स्वतंत्र probesets या विशिष्ट ब्याह जंक्शन को लक्षित जांच से जारी किए गए, proviral splicing रणनीति के बारे में जानकारीपूर्ण है. इस HERV विशिष्ट जांच के चयन की प्रक्रिया (चित्रा 8) के रूप में कुशलतापूर्वक पारंपरिक जीन 36 के रूप में, ऊतक जुड़े splicing रणनीति की पहचान का समर्थन करने के लिए पर्याप्त मजबूत है कि इंगित करता है.

इस विधि व्यक्तिगत HERV ठिकाना अभिव्यक्ति की पहचान करने के लिए पहला प्रयास हैAffymetrix प्रौद्योगिकी पर आधारित एक कस्टम उच्च घनत्व माइक्रोएरे का उपयोग कर. माइक्रोएरे प्रारूप की स्पष्ट रूप से पहचान फायदे (मैं) से मिलकर HERV transcriptome समझने के लिए कई HERV परिवारों के समन्वित अन्वेषण और प्रत्येक लोकस के लिए विभिन्न क्षेत्रों के (द्वितीय) एक साथ और स्वतंत्र विश्लेषण, जैसे. एकल और proviral लीटर, झूठ या वातावरण क्षेत्रों और किसी भी एक प्राथमिकताओं HERV तत्व की कार्यक्षमता पर बिना proviral संरचनाओं के साथ जुड़े संभव spliced ​​जंक्शनों, के लिए U3 और U5 डोमेन. संभावनाएँ माइक्रोएरे जुड़े biocomputing उपकरणों में एनोटेशन के एक सुधार पर भरोसा करते हैं. यह एक ऐसी इसका सबूत सक्रिय HERVs lncRNA प्रतिलेखन ड्राइव या अधिक या कम समीपस्थ कोडिंग जीन अभिव्यक्ति मिलाना चाहे जैसे जैविक परिकल्पना में चिप संकेतों को परिवर्तित करने की अनुमति चाहिए. दरअसल, इस तरह धारणा वी के घटकों से युक्त प्रोस्टेट कैंसर से जुड़े ncRNA टेप की पहचान की है कि हाल ही के अध्ययन के द्वारा समर्थित हैHERV कश्मीर अंतर्जात रेट्रोवायरस परिवार या अंश एक वायरल लीटर प्रमोटर क्षेत्र की 37, साथ ही दो जीन संलयन घटनाओं अर्थात् HERV-K22q11-ETV1 और HERV-K17-ईटीवी 38,39 से iral ORFs. साथ में ले ली, लीटर समारोह और splicing रणनीति पहचान के साथ संयुक्त इस पूरे transcriptome दृष्टिकोण ट्रिगर पुरानी 40,41 में HERV अभिव्यक्ति के घटकों और संक्रामक रोगों 42,43 बनाम मार्कर को समझने में मदद मिल सकती.

Disclosures

इस काम BIOMERIEUX एसए, आश्रम CIVILS डे ल्यों और फ्रेंच सार्वजनिक एजेंसी OSEO (नई चिकित्सकीय दृष्टिकोण के लिए उन्नत, व्यक्तिगत चिकित्सा निदान के लिए समर्पित एक फ्रांसीसी सरकार से वित्त पोषित कार्यक्रम) द्वारा समर्थित किया गया. पीपी, कुलपति, जाओ, समुद्री मील दूर है, और एफएम BIOMERIEUX एसए के कर्मचारी हैं. पीपी, एनएम और एफएम इस पेपर के निष्कर्षों को कवर पेटेंट आवेदन प्रस्तुत किया है.

Acknowledgments

हम HERV-V2 प्रोटोकॉल के प्रारंभिक विकास और अनुकूलन के लिए उनके योगदान के लिए Cecile Montgiraud, जुलिएट Gimenez, मगाली Jaillard और बर्ट्रेंड बोनॉड धन्यवाद. हम भी नैतिक आधार पर उनके मार्गदर्शन के लिए Hader Haidous धन्यवाद देता हूँ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Trizol Invitrogen 15596-026
RNA poly-A control stock Affymetrix 900433
DNAse 1 Promega M6101 1,000 U (1 U/µl)
Terminal transferase Roche 3333574001 400 U. Including enzyme and coenzyme (CoCl2).
DLR-1a Affymetrix 900542
Hybridization internal controls B2 and 20x Eukaryotic Hybridization Control Affymetrix 900454
GeneChip Hybridization, Wash and staining Affymetrix 900720 Including PreHybridization Mix and 2x Hybridization Mix for 30 reactions
10x One-Phor-All Buffer PLUS Composition in DEPC-treated water: 100 mM Tris-acetate pH 7.5; 100 mM magnesium acetate; 500 mM potassium acetate.
RNeasy Mini kit Qiagen 74104 RNA cleanup protocol
WT-Ovation RNA amplification system Nugen 2210-24
QIAquik PCR purification kit Qiagen 28104
EQUIPMENT
Material Name Company Catalogue Number Comments
Nanodrop 1000 Thermo Scientific
GeneChip Scanner 3000 7G Affymetrix GS30007G Optional: autoloader
GeneChip Fluidics Station 450 Affymetrix FS450
GeneChip Hybridization 640 Oven Affymetrix 640 Includes 4 GeneChip Probe array carriers
Workstation loaded with GeneChip Operating Software (GCOS) including the GeneChip Scanner 3000 High-Resolution Scanning Patch
HERV-V2 chip Affymetrix Custom array.
For microarray availability (for research use only), please contact:
François Mallet
Laboratoire Commun de Recherche Hospices Civils de Lyon-bioMérieux
Medical Diagnostic Discovery Department
Centre Hospitalier Lyon Sud, Bâtiment 3F
69495, Pierre Bénite cedex France
Phone: 33 (0)4 72 67 87 85
Email: francois.mallet@biomerieux.com
HERV-V2 conception
Dedicated database and annotations

The construction of a dedicated database, grouping genomic HERV sequences belonging to 6 HERV families, has been achieved by the following procedure: (i) the most complete and representative sequence of each HERV family was selected from the literature and defined as a prototype sequence (Figure 2). (ii) The 6 prototypes were functionally annotated with reference to their LTR (U3/R/U5) and internal parts (gag/pol/env). (iii) RepeatMasker 44 was then applied using these functional sequences as input libraries. A genome-wide search of all related sequences was performed over the human genome on the basis of a minimum 80% homology (NCBI 36/hg18). (iv) Finally, the functional sequences retrieved by this process were assembled into distinct loci on the basis of their genomic location and eventually implemented in a dedicated HERV database. This database, called HERV-gDB3, contains 10,035 individual HERV loci35.

Locus-specific probes design
Starting from HERV-gDB3, overlapping tracks of 25-mer candidate probes were firstly generated. Each candidate probe was then aligned against the human genome using KASH 45 in order to assess the cross-hybridization potentialities. This latter estimation was performed by a model developed specifically for this purpose and referred to as EDA+. Briefly, the principle of EDA+ is to take into account the instability brought by mismatches and gaps in a 25-mer target/probe hybridization complex. Candidate probes exhibiting low cross-hybridization risks (i.e. a low number of non-specific genomic targets) are selected and lastly assembled into probesets.

Custom HERV GeneChip microarray
The custom HERV GeneChip integrates 23,583 HERV probesets and can discriminate 5,573 distinct HERV elements, composed of solo LTRs, complete and partial proviruses (Figure 2). The standard Affymetrix control probes for unbiased amplification and hybridization were also included in the microarray.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Artibani, W. Landmarks in prostate cancer diagnosis: the biomarkers. BJU Int. 110, Suppl 1. 8-13 (2012).
  2. Girometti, R., et al. Negative predictive value for cancer in patients with "gray-zone" PSA level and prior negative biopsy: preliminary results with multiparametric 3.0 Tesla MR. J. Magn. Reson. Imaging. 36, 943-950 (2012).
  3. You, B., et al. Prognostic value of modeled PSA clearance on biochemical relapse free survival after radical prostatectomy. Prostate. 69, 1325-1333 (2009).
  4. Vickers, A. J., Brewster, S. F. PSA Velocity and Doubling Time in Diagnosis and Prognosis of Prostate Cancer. Br. J. Med. Surg. Urol. 5, 162-168 (2012).
  5. Bussemakers, M. J., et al. DD3: a new prostate-specific gene, highly overexpressed in prostate cancer. Cancer Res. 59, 5975-5979 (1999).
  6. Vlaeminck-Guillem, V., Ruffion, A., Andre, J., Devonec, M., Paparel, P. Urinary prostate cancer 3 test: toward the age of reason. Urology. 75, 447-453 (2010).
  7. Buscher, K., et al. Expression of the human endogenous retrovirus-K transmembrane envelope, Rec and Np9 proteins in melanomas and melanoma cell lines. Melanoma Res. 16, 223-234 (2006).
  8. Ishida, T., et al. Identification of the HERV-K gag antigen in prostate cancer by SEREX using autologous patient serum and its immunogenicity. Cancer Immun. 8, 15 (2008).
  9. Sauter, M., et al. Human endogenous retrovirus K10: expression of Gag protein and detection of antibodies in patients with seminomas. J. Virol. 69, 414-421 (1995).
  10. Pérot, P., Bolze, P. A., Mallet, F. Viruses: Essential Agents of Life. Witzany, G. , Springer-Verlag. 325-361 (2012).
  11. Stamey, T. A., Kabalin, J. N. Prostate specific antigen in the diagnosis and treatment of adenocarcinoma of the prostate. I. Untreated patients. Untreated patients. J. Urol. 141, 1070-1075 (1989).
  12. Catalona, W. J., et al. Measurement of prostate-specific antigen in serum as a screening test for prostate cancer. New Engl. J. Med. 324, 1156-1161 (1991).
  13. Schroder, F. H. Prostate cancer around the world. An overview. Urol. Oncol. 28, 663-667 (2010).
  14. Klotz, L. Active surveillance for favorable-risk prostate cancer: background, patient selection, triggers for intervention, and outcomes. Curr. Urol. Rep. 13, 153-159 (2012).
  15. Irizarry, R. A., et al. Exploration, normalization, and summaries of high density oligonucleotide array probe level data. Biostatistics. 4, 249-264 (2003).
  16. Tusher, V. G., Tibshirani, R., Chu, G. Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 5116-5121 (2001).
  17. Storey, J. D., Tibshirani, R. Statistical significance for genomewide studies. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 9440-9445 (2003).
  18. Team, R. D. C. R: A language and environment for statistical computing. , (2008).
  19. Gentleman, R. C., et al. Bioconductor: open software development for computational biology and bioinformatics. Genome Biol. 5, R80 (2004).
  20. de Parseval, N., Lazar, V., Casella, J. F., Benit, L., Heidmann, T. Survey of human genes of retroviral origin: identification and transcriptome of the genes with coding capacity for complete envelope proteins. J. Virol. 77, 10414-10422 (2003).
  21. Wang-Johanning, F., et al. Detecting the expression of human endogenous retrovirus E envelope transcripts in human prostate adenocarcinoma. Cancer. 98, 187-197 (2003).
  22. Smallwood, A., et al. Temporal regulation of the expression of syncytin (HERV-W), maternally imprinted PEG10, and SGCE in human placenta. Biol. Reprod. 69, 286-293 (2003).
  23. Okahara, G., et al. Expression analyses of human endogenous retroviruses (HERVs): tissue-specific and developmental stage-dependent expression of HERVs. Genomics. 84, 982-990 (2004).
  24. Buscher, K., et al. Expression of human endogenous retrovirus K in melanomas and melanoma cell lines. Cancer Res. 65, 4172-4180 (2005).
  25. Forsman, A., et al. Development of broadly targeted human endogenous gammaretroviral pol-based real time PCRs Quantitation of RNA expression in human tissues. J. Virol. Methods. 129, 16-30 (2005).
  26. Muradrasoli, S., Forsman, A., Hu, L., Blikstad, V., Blomberg, J. Development of real-time PCRs for detection and quantitation of human MMTV-like (HML) sequences HML expression in human tissues. J. Virol. Methods. 136, 83-92 (2006).
  27. Seifarth, W., et al. Comprehensive analysis of human endogenous retrovirus transcriptional activity in human tissues with a retrovirus-specific microarray. J. Virol. 79, 341-352 (2005).
  28. Pichon, J. P., Bonnaud, B., Mallet, F. Quantitative multiplex degenerate PCR for human endogenous retrovirus expression profiling. Nat. Protoc. 1, 2831-2838 (2006).
  29. Flockerzi, A., et al. Expression pattern analysis of transcribed HERV sequences is complicated by ex vivo recombination. Retrovirology. 4, 39 (2007).
  30. Flockerzi, A., et al. Expression patterns of transcribed human endogenous retrovirus HERV-K(HML-2) loci in human tissues and the need for a HERV Transcriptome Project. BMC Genomics. 9, 354 (2008).
  31. Gosenca, D., et al. HERV-E-Mediated Modulation of PLA2G4A Transcription in Urothelial Carcinoma. PLoS ONE. 7, e49341 (2012).
  32. Buzdin, A., Kovalskaya-Alexandrova, E., Gogvadze, E., Sverdlov, E. GREM, a technique for genome-wide isolation and quantitative analysis of promoter active repeats. Nucleic Acids Res. 34, e67 (2006).
  33. Buzdin, A., Kovalskaya-Alexandrova, E., Gogvadze, E., Sverdlov, E. At least 50% of human-specific HERV-K (HML-2) long terminal repeats serve in vivo as active promoters for host nonrepetitive DNA transcription. J. Virol. 80, 10752-10762 (2006).
  34. Gimenez, J., et al. Custom human endogenous retroviruses dedicated microarray identifies self-induced HERV-W family elements reactivated in testicular cancer upon methylation control. Nucleic Acids Res. 38, 2229-2246 (2010).
  35. Pérot, P., et al. Microarray-based sketches of the HERV transcriptome landscape. PLoS ONE. 7, e40194 (2012).
  36. Fehlbaum, P., Guihal, C., Bracco, L., Cochet, O. A microarray configuration to quantify expression levels and relative abundance of splice variants. Nucleic Acids Res. 33, e47 (2005).
  37. Prensner, J. R., et al. Transcriptome sequencing across a prostate cancer cohort identifies PCAT-1, an unannotated lincRNA implicated in disease progression. Nat. Biotechnol. 29, 742-749 (2011).
  38. Tomlins, S. A., et al. Distinct classes of chromosomal rearrangements create oncogenic ETS gene fusions in prostate cancer. Nature. 448, 595-599 (2007).
  39. Hermans, K. G., et al. Truncated ETV1, fused to novel tissue-specific genes, and full-length ETV1 in prostate cancer. Cancer Res. 68, 7541-7549 (2008).
  40. Brodziak, A., et al. The role of human endogenous retroviruses in the pathogenesis of autoimmune diseases. Med. Sci. Monit. 18, RA80-RA88 (2012).
  41. Mullins, C. S., Linnebacher, M. Human endogenous retroviruses and cancer: Causality and therapeutic possibilities. World J. Gastroenterol. 18, 6027-6035 (2012).
  42. Young, G. R., et al. Resurrection of endogenous retroviruses in antibody-deficient mice. Nature. 491, 774-778 (2012).
  43. Vander Kuyl, A. C. HIV infection and HERV expression: a review. Retrovirology. 9, 6 (2012).
  44. Smit, A. F. A., Hubley, R. RepeatMasker Open-3.0. , (1996).
  45. Navarro, G., Raffinot, M. Flexible Pattern Matching in Strings: Practical On-Line Search Algorithms for Texts and Biological Sequences. , Cambridge University Press. (2002).

Tags

चिकित्सा अंक 81 कैंसर जीव विज्ञान जेनेटिक्स आण्विक जीवविज्ञान प्रोस्टेट Retroviridae बायोमार्कर भेषज ट्यूमर मार्करों जैविक prostatectomy के माइक्रोएरे विश्लेषण जीन अभिव्यक्ति निदान मानव अंतर्जात रेट्रोवायरस HERV माइक्रोएरे Transcriptome प्रोस्टेट कैंसर Affymetrix
प्रोस्टेट कैंसर में Biomarker डिस्कवरी के लिए आवेदन: व्यक्तिगत HERV loci अभिव्यक्ति की माइक्रोएरे आधारित पहचान
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pérot, P., Cheynet, V.,… More

Pérot, P., Cheynet, V., Decaussin-Petrucci, M., Oriol, G., Mugnier, N., Rodriguez-Lafrasse, C., Ruffion, A., Mallet, F. Microarray-based Identification of Individual HERV Loci Expression: Application to Biomarker Discovery in Prostate Cancer. J. Vis. Exp. (81), e50713, doi:10.3791/50713 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter