Summary
Humane endogene retrovirus (Herv), som optager 8% af det menneskelige genom, fastholde knappe kodning kapaciteter, men hundrede tusinde lange terminale gentagelser (LTR). En brugerdefineret Affymetrix microarray var designet til at identificere individuelle HERV locus udtryk og blev brugt på prostatakræft væv som et proof of concept for fremtidige kliniske studier.
Abstract
Prostata-specifikt antigen (PSA) er det vigtigste diagnostiske biomarkør for prostatacancer i klinisk anvendelse, men det mangler specificitet og følsomhed, især i lave dosisværdier 1. 'Sådan skal du bruge PSA "stadig er et aktuelt emne, enten for diagnose som en grå zone, der svarer til en koncentration i serum på 2,5-10 ng / ml, som ikke tillader en klar differentiering skal foretages mellem kræft og noncancer 2 eller for patient opfølgning -up analyse af postoperativ PSA kinetiske parametre kan udgøre betydelige udfordringer for deres praktiske anvendelse 3,4. Alternativt noncoding RNA (ncRNAs) fremstår som vigtige molekyler i human cancer, med potentiale til at tjene som nye markører for sygdom, fx PCA3 i prostatakræft 5,6 og afsløre ukarakteriserede aspekter af tumor biologi. Desuden data fra ENCODE projekt offentliggjort i 2012, viste, at de forskellige RNA-typer dækker omkring 62% af den genome. Det fremgår også, at mængden af transskriptionelle regulatoriske motiver er mindst 4,5 gange højere end den, der svarer til protein-kodende exoner. Således lange terminale gentagelser (LTR'er) af humane endogene retrovira (HERVs) udgør en bred vifte af formodede / kandidat transkriptionelle regulatoriske sekvenser, som det er deres primære funktion i infektiøse retrovirus. HERVs, der er spredt over hele det menneskelige genom, stammer fra fædrene og uafhængige infektioner i kønscellerne, efterfulgt af copy-paste formering processer og fører til MultiCopy familier besætter 8% af det menneskelige genom (bemærk, at exon span 2% af vores genom ). Nogle HERV loci stadig udtrykker proteiner, der har været forbundet med adskillige patologier, herunder kræft 7-10. Vi har designet en high-density microarray, i Affymetrix format, der sigter mod at optimalt karakterisere individuel HERV loci udtryk, for bedre at forstå, om de kan være aktive, hvis de kører ncRNA transskription eller modulate kodning genekspression. Dette værktøj er blevet anvendt i prostata område (figur 1) cancer.
Introduction
Humane endogene retrovirus (også kaldet HERVs) er spredt over hele vores genom. De stammer fra fædrene og uafhængige infektioner i kønscellerne, efterfulgt af copy-paste formering processer og fører til multicopy familier. I dag er de ikke mere smitsom, men de optager 8% af det menneskelige genom, som et punkt i sammenligning, exoner span 2% af det menneskelige genom. Data fra ENCODE projekt offentliggjort i 2012, viste, at de forskellige RNA-typer dækker omkring 62% af genomet, herunder en tredjedel i intergeniske regioner. Endvidere fremgår det, at mængden af transskriptionelle regulatoriske motiver er mindst 4,5 gange højere end den, der svarer til protein-kodende exoner. HERVs lange terminale gentagelser (LTR) repræsenterer en bred vifte af potentielle transkriptionsregulatorelementer, da det er deres normale funktion i smitsomme retrovirus. Historisk, bortset fra nogle få loci udtrykt i placenta og testis, var det almindeligt antaget, at HERV er tavse grund epigenetic regulering. Derfor har vi designet et high-density microarray, i Affymetrix format, der sigter mod at optimalt karakterisere individuel HERV loci udtryk, for bedre at forstå, om de er aktive, hvis de kører lncRNA transskription eller modulere kodning genekspression. Dette værktøj døbt HERV-V2 GeneChip integrerer 23.583 Herv probesets og kan diskriminere 5.573 forskellige Herv elementer bestående af solo LTR'er samt komplette og partielle provira (Figur 2).
Diagnose, vurdering og Plan:
Diagnosticering af prostatacancer baseret på dosering af prostata specifikt antigen (PSA) biomarkør i klinisk laboratorium, en digital rektal undersøgelse at vurdere morfologisk ændring af prostata og endelig prostata biopsier observeret af patologen. Manglen på tilstrækkelig specificitet og sensitivitet blandt konventionelle kræft biomarkører, såsom PSA for prostatakræft, er blevet bredt anerkendt AFter flere årtiers kliniske implikationer 1.. Oprindeligt var PSA foreslået til diagnosticering og behandling af adenokarcinom i prostata 11. Det var sidstnævnte, der foreslås for kræftscreening og overvåge udviklingen af sygdommen 12. Der er dog stadig et spørgsmål, der jævnligt spurgt: "hvordan man bruger PSA. (I) En grå zone, der svarer til en koncentration i serum på 2,5-10 ng / ml ikke giver en klar forskel, der skal foretages mellem kræft og noncancer 2 (ii) to store kohortestudier indskrive hundredtusinder af mennesker i Europa og USA undlod at komme til en klar konklusion om nytten af screening i form af sygdom dødelighed 13,14, (iii) analyse af post-operative PSA kinetiske parametre såsom PSA clearance, PSA hastighed og en fordobling tid, selv om enkelt i teorien, kan udgøre betydelige udfordringer i praktisk anvendelse 3,4. Vi kan forvente, at i de kommende år, biomarkør appner vil understøtte en klinisk valg mellem vågent venter og mere eller mindre aggressive behandlinger afhængigt tumor fænotype. Vedrørende diagnose afsagt af patolog, en første begrænsende faktor kommer fra en 20% falsk negativ diagnose indenfor prostata biopsier (mange kræftformer er savnet ved stikprøver). En anden bekymring beskæftiger sig med behovet for en yderligere biopsi-proceduren efter en negativ, hvilket kan forårsage bivirkninger.
Radikal prostatektomi er i øjeblikket en af de standard behandlinger for prostatakræft. Det foreslås i raske patienter, aldring 45-65 år, især i tilfælde af aggressive mønstre (Gleason 7 til 10), multifokal tumor eller palpable tumor. Det sker nu i vores afdeling ved hjælp af robot assisteret kirurgi. På grund af den voksende beviser for, at molekylære markører vil have afgørende betydning i de kommende år, besluttede vi at foreslå til alle vores patienter mulighed for at deltage i et program for prostatavæv bankvirksomhed. Mere præcist har de ekspanderende molekylære forskningsprogrammer om prostatakræft resulteret i et stigende behov for adgang til høj kvalitet friske tumorvæv fra prostatektomi prøver. Denne forskning, navnlig de genomiske metoder, kræves store prøver af høj DNA / RNA-kvalitet. Tumor og tilstødende »non svulstsygdomme 'væv fra den samme patient er nødvendige. Anbefalinger til håndtering og forarbejdning radikale prostatectomies er designet til at bevare patologiske træk, der bestemmer scenen og margin status og dermed potentiel yderligere behandling og prognose. Enhver frisk væv prøveudtagningsmetode bør derfor ikke gå på kompromis efterfølgende patologiske vurderinger for at være acceptabel for diagnosen. Makroskopisk dissektion af prostata er vanskelig og stor opmærksomhed skal betales til margin væv og kapsel-invasion: enhver dissektion for prostata bank bør altid udføres af en uddannet uropathologist ifølge en enigd protokol. Den etiske komité i det medicinske fakultet og staten medicinske bord enige om at disse undersøgelser og informeret samtykke blev opnået for alle patienter indgår i prostata væv bankvirksomhed.
Protocol
1.. Kirurgi
Når fjernet af kirurgen, holde prostata på is, indtil taget ansvaret for af en patolog.
2. Håndtering af prostatavæv
- For at respektere forsinkelse af perioperative iskæmi, overføre radikal prostatektomi prøver på is til laboratoriet af engagerede medarbejdere inden for 30 min efter kirurgisk ablation. Forsinkelsen for frost skal være mindre end 20-30 min (figur 3A).
- Afvejes og plette prostata efter den sædvanlige protokol (fx grønt på højre side, sort på den venstre side, se figur 3B og 3C).
- Udføre et stort tværsnit af kirtel på den bageste side (figur 3D). Vend prostata og sætte det på den forreste side. Udfør en stor tværsnit af kirtel på den bageste side med en steril kirurgisk kniv.
- Dissekere stykker af væv på overgangszonepå venstre og højre perifere zoner, hvorved margenerne intakt (figur 3E).
- Sæt kerner af væv i et eppendorfrør, snap fryse og opbevares i flydende kvælstof (figur 3F). Hvis du ikke gør biobank fortsætte direkte med trin 2.7.
- Udfør prostata bank, hvis den samlede længde af kræft på biopsier er overlegen i forhold til 10 mm. Brug en suturtråd at lukke prostata og for at forhindre kirtel forvrængning og minimal forstyrrelse af den kirurgiske margin (figur 3G). Så fastsætte radikal prostatektomi eksemplar med formalin og embed i paraffin i henhold til den sædvanlige procedure for histologisk analyse.
- Monter frosne væv kerner lodret på en lille høj OLT og lave sektioner i en kryostat. Tag en første single 5 um frosne sektion og plette den med blå toluidin.
- Udføre en hurtig histologisk undersøgelse for at analysere beskaffenheden af vævet (dvs.. Godartede eller ondartede). For tumorvæv anslå størrelsen af tumorceller og vælger kun kerner med mere end 80% af tumorceller.
- Efter denne, udføre en ny single 5 um frosne sektion og plette den med hæmatoxylin, eosin og Safran. Derefter skæres 15 sektioner x 30 m og placere den i et RNAse gratis Eppendorf rør.
- Tag en sidste 5 m frosne sektion for hæmatoxylin, eosin og Safran og plette den til at kontrollere mængden af tumorceller ved afslutningen af proceduren.
- Sæt Eppendorf-rør i tøris og sende prøven til molekylærbiologisk laboratorium.
3. RNA-ekstraktion, rensning, og Quality Control
- Homogenisering. Udfør homogenisering i nærvær af 1 ml Trizol/100 mg væv indtil vævet er fuldstændigt opløst i opløsning. Tilføj Trizol løsning gradvist og fortsætte med omhu på is ved hjælp af en håndholdt kværn. Når homogeniseret, udportionerer løsningen på Eppendorf-rør og efterlade i Trizol ved stuetemp tilfem minutter.
- Faseadskillelse. Tilsæt 300 pi chloroform (eller 150 pi BCP/1.5 ml Trizol). Vortex 15 sek derefter forlade ved stuetemperatur i 2-3 min. Centrifuger ved 12.000 xg i 15 minutter ved 2-8 ° C.
- RNA udfældning. Overfør omhyggeligt øverste vandige fase til et nyt rør. Tilføj 750 pi isopropanol. Inkuberes ved stuetemperatur i 10 min (agitere ved tilbageførsel). Inkuber 2 timer ved -19 ° C/-31 ° C. Centrifuger prøverne ved 12.000 x g i 30 minutter ved 2-8 ° C.
- RNA vask og suspension. Efter centrifugering, supernatanten fjernes. Vask RNA pellet med 1 ml 80% EtOH (forsigtigt vende rørene). Centrifugér prøver ved 7.500 xg i 10 minutter ved 2-8 ° C. Fjern supernatanten under anvendelse af P1000 og P10. Tillad resterende EtOH lufttørre i 2-3 min. Tilsæt 100 pi RNase-frit vand, transfer rør til 70 ° C varmeblok og lad det sidde i 2-3 min for at opløse bundfaldet. Derefter sætte på is. Opbevares ved -19 ° C/-31 ° C til kortvarig opbevaring og -80 ° C til langtidsopbevaring.
- RNA-oprensning. Oprense RNA under anvendelse af RNeasy Mini-kittet (Qiagen). Kort fortalt, start ved at tilsætte 350 ul buffer RLT til 100 ul RNA prøve og bland godt, så følg Qiagen procedure. Endelig kan man tage en 3 pi (ud af 50 ul) aliquot af det oprensede produkt til kvalitetskontrol (trin 3.6). Opbevar RNA ved -19 ° C/-31 ° C for en kort sigt periode eller ved -80 ° C for en langsigtet opbevaring.
- RNA QC (figur 4A). Kontrollere kvaliteten af RNA og RNA integritet ved hjælp af en Bioanalyzer (Agilent) og en NanoDrop (Thermo), i henhold til producentens anvisninger. RNA Integrity Number (RIN) bruges til at vurdere RNA kvalitet. Især lykkes i påvisning af 18S og 28S toppe anbefales kraftigt at bruge prøverne i yderligere skridt.
4.. WT-ovation RNA Amplification
Anbefalinger til at varetage de amplifikationstrin under anvendelse af WT-Ovation forstærkning kit i optimale betingelser:
- Kør ikke færre end otte forstærkningsmetoder prøver ad gangen for at sikre afpipettering præcision. Derefter tegner sig for 1 affaldsmængde når de forbereder masterblandinger der kræver en opsplitning af kittet i 3 partier af 8 reaktioner.
- Altid holde optøede reagenser og reaktionsglassene på is, medmindre andet er anvist.
- Brug kun en frisk 80% ethanol opløsning til rensning.
- Du må ikke stoppe på noget tidspunkt i protokollen.
- Fortynd totalt RNA for at få en koncentration på 25 ng / ul. Proces 2 pi af den fortyndede prøve.
- Forbered Poly-A RNA spike-in kontrol løsning med en seriel fortynding af Poly-A-RNA Stock med Poly-A Kontrol fortyndingsbuffer (Affymetrix), for at opnå en 1:25.000 fortynding.
Trin 1: First Strand cDNA Synthesis 4,3-4,8. De nævnte reagenser henvist af leverandøren som følger: A1 (First Strand Primer Mix), A2 (FiRST Strand Buffer Mix), A3 (First Strand Enzyme Mix).
- Optø A1 og A2 ved stuetemperatur. Bland ved hjælp af en vortex-blander i 2 sekunder og centrifugering i 2 sek. Så hurtigt placeres på is. Placér A3 på is.
- Put 2 pi total RNA (50 ng) i en 0,2 ml PCR-rør og tilsæt 2 pi A1 (endelig volumen: 4 ul). Cap og spin røret i 2 sek.
- Inkuber ved 65 ° C i 5 minutter og derefter placere røret på is.
- Forbered First Strand cDNA Master Mix som følger (givet for en enkelt reaktion). Bland ved pipettering og spin ned Master Mix kortvarigt. Straks placere på is.
Reagens Volumen First Strand Buffer Mix (A2) 5 mikroliter Poly-A-RNA-kontrol (1:25.000) 0,5 pi First Strand Enzyme Mix (A3) 0,5 pi - Tilføj 6 & #181, l af Master Mix til RNA / Primer-holdige rør. Bland ved at svirpe røret, spin for 2 sek og hurtigt placere på is (endelig volumen: 10 ul).
- Inkuber ved 4 ° C i 1 min, derefter 25 ° C i 10 minutter, derefter 42 ° C i 10 minutter og derefter 70 ° C i 15 min. Opbevares køligt ved 4 ° C. Fjern reaktionsrøret fra termisk cykler, spinde kortvarigt og holde på is. Fortsæt straks med Second Strand cDNA Synthesis skridt.
Trin 2: Second Strand cDNA Synthesis 4,8-4,12. De nævnte reagenser henvist af leverandøren som følger: B1 (Second Strand Buffer Mix) og B2 (Anden Strand Enzyme Mix).
- Spin ned B2 og B3 i 2 sek og hurtigt placere på is. Optø B1 ved stuetemperatur. Bland ved hjælp af en vortex-mixer til 2 sek, spin for 2 sek og hurtigt placere på is.
- Forbered en Second Strand Master Mix som følger (gives for en enkelt reaktion). Bland ved pipettering og spin ned Master Mix brieflyve. Straks placere på is.
Reagens Volumen Second Strand Buffer Mix (B1) 9,75 pi Second Strand Enzyme Mix (B2) 0,25 pi - Tilsæt 10 ul af Master Mix til hver First Strand Reaction rør. Bland ved pipettering 3x, spin for 2 sek og anbring på is (endelig volumen: 20 ul).
- Inkuber ved 4 ° C i 1 min, derefter 25 ° C i 10 minutter, derefter 50 ° C i 30 minutter og derefter 70 ° C i 5 min. Opbevares køligt ved 4 ° C. Fjern reaktionsrøret fra termisk cykler, spinde kortvarigt og holde på is. Fortsæt straks med Post-Second Strand Enhancement skridt.
Trin 3: Post-Second Strand Enhancement 4,13-4,15. De nævnte reagenser henvist af leverandøren som følger: B1 (Second Strand Buffer Mix), B3 (Reaction Enhancement Enzyme Mix).
- Forbered en Master Mix ved at kombinere B1 og B3 Mix som følger (gives for en enkelt reaktion). Bland ved pipettering og spin ned Master Mix kortvarigt. Straks placere på is.
Reagens Volumen Second Strand Buffer Mix (B1) 1.9 pi Reaktion Enhancement Enzyme Mix (B3) 0,1 pi - Tilsæt 2 ul af Master Mix til hver anden streng Reaction rør. Bland ved pipettering 3x, spin for 2 sek og anbring på is (endelig volumen: 22 ul).
- Inkuber ved 4 ° C i 1 min, derefter 37 ° C i 15 min, og derefter 80 ° C i 20 min. Opbevares køligt ved 4 ° C. Fjern reaktionsrøret fra termisk cykler, spinde kortvarigt og placer på is. Fortsæt straks med SPIA Amplification trin.
Trin 4: Single Strand cDNA (sscDNA) syntese af SPIA proceduren fra 4,16 -4.19. De nævnte reagenser henvist af leverandøren som følger: C1 (SPIA Primer Mix), C2 (SPIA Buffer Mix), C3 (SPIA Enzyme Mix).
- Optø C1 og C2 ved stuetemperatur. Bland ved hjælp af en vortex-mixer, spin for 2 sek og hurtigt placere på is. Tø C3 på is. Bland indholdet ved forsigtigt at vende 5x. Sørg for ikke at indføre luftbobler. Derefter snurre i 2 sek og sted på is.
- Forbered en SPIA-Master Mix, der tegner sig for et volumen 0,5 spild, som følger. Bland ved pipettering og spin ned Master Mix kortvarigt. Straks placere på is.
Reagens Volumen SPIA-Buffer Mix (C2) 5 mikroliter SPIA-Primer Mix (C1) 5 mikroliter SPIA-Enzyme Mix (C3) 10 pi - Tilsæt 20 ul af SPIA Master Mix til Enhanced Second Strand Reaction tUbe. Bland ved pipettering 6-8x, spin og hurtigt placere på is (endelig volumen: 42 ul).
- Inkuber ved 4 ° C i 1 min, derefter 47 ° C i 60 minutter og derefter 95 ° C i 5 min. Opbevares køligt ved 4 ° C. Glasset fjernes fra termiske variator, spinde kortvarigt og placer på is.
5.. sscDNA Oprensning og kvalitetskontrol
- sscDNA oprensning. Renses sscDNA bruger QIAquik PCR oprensningskit (Qiagen). Kort fortalt, start ved at tilsætte 200 ul buffer PB til de 42 pi forstærket cDNA produkt, mix og belastning på kolonnen. Følg derefter Qiagen procedure. Endelig kan man tage en 3 pi (ud af 30 ul) portion af sscDNA rensede produkt til kvalitetskontrol (trin 5.2).
- sscDNA opnåelse og kontrol størrelsesfordelingen (figur 4B). Tjek sscDNA udbytte og størrelsesfordeling ved hjælp af en Bioanalyzer og en NanoDrop, i henhold til producentens anvisninger. Størrelsen af fordelingen af amplificerede cDNA skal be typisk på mellem 100 og 1.500 baser lang med en top omkring 600 baser.
6.. sscDNA Fragmentering
- Forbered 2 ug cDNA i 30 ul, justere lydstyrken med Nuclease-frit vand.
- Forbered 1x One-Phor-All Buffer PLUS (OPA), startende fra en 10x OPA buffer PLUS løsning.
- Forbered 0,2 U / ul DNase I (5-fold fortynding af 1 U / ul DNase I).
- Forbered en Fragmentering Master Mix som følger (gives for en enkelt reaktion):
Reagens Volumen 10X One-Phor-All Buffer PLUS 3.6 pi DNase I (0,2 U / pl) 3 pi - Tilføj 6,6 ul Fragmentering Mix til de 30 pi sscDNA.
- Spin og inkuberes ved 37 ° C i 10 minutter, derefter inaktivere DNase I ved 95 ° C i 10 minutter og holde på is. Alikvot 1 &# 181, l den fragmenterede cDNA for Agilent baseret størrelse fordeling verifikation.
- verifikation sscDNA størrelsesfordelingen (figur 4C). Check sscDNA størrelsesfordeling under anvendelse af en Bioanalyzer (Agilent). Størrelsesfordelingen af fragmenteret cDNA bør omfatter typisk mellem 35 og 200 baser.
7.. Mærkning af fragmenterede sscDNA
- Fortynd DLR-1a 7,5 mM til 5 mM i DEPC-vand.
- Forbered en mærkning Master Mix som følger (gives for en enkelt reaktion):
Reagens Volumen 5x TdT reaktionsbuffer 14 pi CoCl2 (25 mM) 14 pi DLR-1a (5 mM) 1 pi Terminal transferase (400 U / ul) 4.4 pi - Tilføj 33,4 pi af mærkning mixhver fragmenteret cDNA prøve.
- Bland ved at svirpe røret, spinde kortvarigt og inkuberes ved 37 ° C i 60 min, og derefter holde på is.
8.. Hybridisering til HERV Chip Microarray
- Prewet den HERV GeneChip med 200 pi præhybridisering Mix (Affymetrix), og der inkuberes ved 50 ° C, 60 rpm i 10 min.
- Forbered hybridiseringsblanding som følger (givet for en enkelt reaktion):
Reagens Volumen Kontrol Oligo B2 (3 nM) 3.3 pi 20x Eukaryotic Hybridization Kontrol 10 pi 2x hybridiseringsblanding 100 pi 99,9% DMSO 17.7 pi - Tilsæt 131 ul hybridiseringsblandingen til de 69 pi fragmenteret og mærkede cDNA ved stuetemperatur at foretage en endelig volume 200 pi.
- Bland og denaturering i 2 minutter ved 95 ° C, og derefter inkuberes ved 50 ° C i 5 minutter og centrifugeres ved maksimal hastighed i 5 minutter.
- Tøm befugtet HERV GeneChip og indlæse målet forberedelse 200 ul. Påfør hårde-spots på to septa.
- Hybridisere ved 50 ° C, 60 rpm i 18 timer.
- Efter 18 timer, tøm HERV GeneChip og lagre den indsamlede hybridiseringsopløsningen ved 4 ° C. Fyld probe array med 250 pi Wash Buffer A. Hvis flisen ikke umiddelbart løber fluidikken, lagret ved 4 ° C.
9.. Vask og farvning
- Kør Fluidik fra GCOS menulinjen. I Fluidik dialogboksen vælge stationen af interesse (1 - 4), og vælg derefter Shutdown_450 for alle moduler, derefter køre. Fordyb de 3 Fluidik aspiration linjer i Milli-Q vand. Følg instruktionerne LCD-skærmen.
- Påfør Prime_450 programmet for alle moduler. Anbring slangerne vaskebuffer A ien flaske, der indeholder 400 ml vaskebuffer A, og den ene for vaskebuffer B i en flaske, der indeholder 200 ml vaskebuffer B. Så igen, skal du følge instruktionerne LCD-skærmen.
- Løft nåle og placere 600 pi pletten cocktail 1 (SAPE Solution Mix) og 600 pi pletten cocktail 2 (Antibody Solution Mix) indeholdende mikrocentrifugerør ved positionerne # 1 og # 2, og 800 pi array indeholdende bufferopløsning ved position # 3 .
- Tildele den rigtige chip til hvert modul, skal du vælge FS450-004-protokollen og køre hvert modul, følge instruktionerne på skærmen.
10.. Scanning
- Varm op GS3000 scanneren. Det er klar til at scanne, når lyset skifter til grønt.
- Påfør hårde-spots på septa at undgå lækkende derefter indlæse chippen ind i autoloader eller alternativt direkte i scanneren. Start scanning.
- Efter scanning af chip. Cel-filer er genereret. Kontroller billedet og tilpasse nettet til stedet for at identificere sonden celler (<strong> Tal 4D-F).
11.. Dataanalyse
- Kvalitetskontrol. Der henvises til standard Affymetrix kontroller for at kontrollere, at de HERV-V2 chips opfylder QC kriterier. Til dette formål følgende repræsentationer kan anvendes: log intensitetsværdien distribution (tæthed plots og box-plot), den mediane absolutte afvigelse (MAD) versus intensiteten median (MAD-MED) plots, baggrunden plots, den normaliserede uskalerede standardafvigelse (nBrug) plots og den relative log udtryk (RLE) plots.
- Normalisering. Desuden bør datasættet undersøges for at fremhæve uventede batch effekter og rette dem, før statistisk analyse. Dataene forbehandling omfatter således en baggrund korrektion (f.eks. Baseret på tryptophan probe baseline signal), efterfulgt af RMA normalisering og sammendrag 15.
- Data mining og søgen efter differential udtrykte gener. Normalisere chips og anvende en hierarkisk clustering tilgang til at udforske datasættet (figur 6A). Derefter foretage en søgning for differentielt udtrykte gener (DEG) ved hjælp af en klassisk betydelig analyse af microarray (SAM) procedure 16 efterfulgt af en falsk opdagelse sats (FDR) rettelse 17.. Bemærk, at disse trin er fuldt integreret i nogle softwareanalyse suiter som Partek GS, men kan alternativt udføres ved hjælp af R statistisk software 18 med pakker fra BioConductor projektet 19. Efter statistisk analyse, filtrere datasættet at udelukke probesets for hvilket udtryk værdier er mindre end 2 6.
- Visualisering og fortolkning. Fortolke resultaterne fra HERV-V2 microarray i en dedikeret interface ved hjælp annotation databaser.
Representative Results
Værdien af transkriptom undersøgelser først og fremmest ligger i kvaliteten af den begyndende biologisk materiale. Hvis RNA-ekstraktion udføres under optimale betingelser, RNA Integrity Number (RIN) typisk 7 eller derover (figur 4A). Behovet for at hybridisere 2 ug af cDNA på Affymetrix HERV-V2 chip forudsætter anvendelse af en amplifikationsprocessen. En vellykket amplifikationstrin fører til en klokkeformet fordeling (figur 4B). Derefter DNAse1 fragmentering udføres for at homogenisere cDNA størrelsesfordeling omkring 100 nukleotider før hybridisering (figur 4C). Efter hybridisering og scanning (figur 4D), en visuel inspektion af billedet gør det muligt at kontrollere, om nettet er godt afstemt med pletter (fig. 4E), og hvis hybridisering kontrol er konsekvent (Figur 4F). Dette trin er også nyttigt for at udelukke microarrays, hvor luftbobler eller fejl opstod under forsøget.
Når chips har passeret QC (figur 5), og efter normalisering, den statistiske analyse af 5 match-pair tumor og normale prostata RNA-prøver fra Lyon-Sud Hospital førte til identifikation af 207 Herv probesets med differentieret ekspression værdier (p.val <0,05) (figur 6A). For at understøtte disse registre og for at få prostata-specifikke oplysninger blev 35 ekstra match-pair prøver (colon, ovarie, testikel-, bryst-, lunge-og prostatakræft), lægges til analyse og SAM-FDR procedure (FDR = 20%) til sidst identificeret 44 prostata specifikke Herv probesets. Blandt dem, der er de mest relevante 10 Herv strukturer beskrevet (figur 6B). Yderligere kliniske studier vil være forpligtet til at vurdere værdierne for sensitivitet og specificitet af disse kandidat biomarkører.
pload/50713/50713fig1.jpg "width =" 500px "/>
. Figur 1. Skema af den samlede procedure fra klinikken (1: prostatektomi af klinikeren og forberedelsen væv ved patologen) til bænken (2-6: prøveforberedelse, forberedelse mål, microarray forarbejdning), der fører til identifikation af mulige biomarkører (7: bioinformatik analyse af Herv microarrays). Nukleinsyrer stammer fra normalt væv er afbildet i orange, nukleinsyrer, der stammer fra tumor område består af en blanding af normal (orange) og tumor specifikke (sort) nukleinsyrer. Klik her for at se større billede .
. Figur 2 undfangelse og indholdet af HERV-V2 chip: Herv sekvenserhentet fra det humane genom er lagret i en database kaldet HERV-gDB3, så 25-mer kandidat prober passere gennem en dedikeret hybridisering model procedure (EDA +) inden det eventuelt bliver syntetiseret på arrayet (de resulterende målrettede delregioner er afbildet for hver familie). Klik her for at se større billede .
Figur 3. Prostata håndtering af patologen. (A) Frisk radikal prostatektomi prøven overføres til laboratoriet. (BC) Prostata er plettet (grøn på højre side, sort på den venstre side). (D) Stor tværsnit af kirtel på den bageste side. (E) Forlader margenerne intakt, tredees af væv dissekeres fra forskellige områder af prostata. (F) Cores væv anbringes i et Eppendorf-rør. (G) suturtråd bruges til at lukke prostata og forhindre kirtel forvrængning og minimal forstyrrelse af det kirurgiske margin. Derefter radikal prostatektomi prøven er klar til fastgørelse i formalin efter den sædvanlige procedure for histologisk analyse. Klik her for at se større billede .
Kontrol Figur 4.. Kvalitet af nukleinsyre forberedelse og hybridisering effektivitet. (A)-RNA integritet, (B)-cDNA amplificeret mål og (C) fragmenterede mål anvendes i hybridiseringen. These tre kvalitetskontrol blev opnået med Bioanalyzer hjælp RNA nano chips og Eukaryot Nano Serie II-analysen. (D) Samlet billede af HERV-V2 microarray hybridisering område efter scanning, (E) udvidelse af det øverste venstre hjørne som viser gitter kontrol justering og (F) udvidelse af centerområdet viser spotting hybridisering kontrol. Klik her for at se større billede .
Fig. 5. Behandling af signaler. (A) Affymetrix polyA spike-i amplifikationsprodukter kontrol. PolyA styrer Dap, Thr, Phe og Lys udskrifter fra B. subtilis-gener er tilsat i RNA-prøven og tjener til at vurdere den samlede succes af mål fremstillingstrin. Intensitet bør opdages ved faldende værdier blandt disse spike-in kontrol for at sikre, at der ikke var nogen skævhed i WT-Ovation forstærkning mellem højt-og lavt-udtrykte gener. (B) Affymetrix spike-i hybridiseringsbetingelser kontrol. Disse mål isoleret fra E. coli og P1 bakteriofager er tilsat før proceduren mærkning. Stigende værdier fra BioB, Bioc, bioD og Cre angive generelle succes hybridisering. (C) Intensitet fordeling af chip signaler efter RMA normalisering. De fleste af de probesets udstille signaler med værdier mindre end 2 6 (baggrund), hvilket indikerer et samlet udtryk hovedsageligt begrænset til nogle specifikke HERV loci. Klik her for at se større billede .
ftp_upload/50713/50713fig6.jpg "width =" 500px "/>
Figur 6. Dataanalyse. (A) Hierarkisk klyngedannelse analyse af normale og tumorale prøver. Partitionering clustering blev anvendt til de normaliserede udtryk værdier ved hjælp af et euklidisk afstand funktion algoritme, gruppering probesets i op (rød) - og ned (blå)-regulering blandt normale og tumorale prøver. (B) Valg af top 10 Herv strukturer identificeret som kandidat biomarkør for prostatakræft. For hvert HERV element, den tilhørende HERV familien, de genomiske koordinater (NCBI 36/hg18) og en kort beskrivelse af HERV struktur er givet. Klik her for at se større billede .
Figur 7. Den HERV repertoire. (A) Kortlægningen af det menneskelige genom afslørede 25.000 protein-kodende gener (exons, 2%) og en enorm mængde af transposoner, herunder 200.000 lang terminal repeat (LTR) retrotransposons (HERV, 8%). (B) ekstrapolering fra HERV-V2 chip indhold og tilhørende udtryk data (79 prøver stammer fra 8. normal versus tumorale vævstyper), tyder på, at en tredjedel af HERV repertoire er transkriptionelt aktiv. Klik her for at se større billede .
Fig. 8. Funktionel fortolkning af signalerne fra chippen. (A) Arrangøren identifikation og epigenetiske kontrol: U3 negativt signal (rød sonde, 5'LTR) Versus R-U5 positivt signal (blå sonde, 5'LTR'et) antyder U3-drevet transkription, støttet af forskellige CpG methylering (massive sorte cirkler) indholdet af U3 i peritumoral normal versus tumorvæv. (B) Splejsning strategi: den formodede 3.1 kb kuvert koder mRNA udtrykt udelukkende i tumoren er identificeret ved hjælp SD1/SA2 splejsningsforbindelsen overlappende sonde. * Fratrukket ved sammenligning med andre ikke-placentavæv. Klik her for at se større billede .
Discussion
I de sidste 10 år har de fleste af de forsøg til måling HERV udtryk, der anvendes RT-PCR-teknikker til enten at fokusere på et bestemt locus 20-24 eller baseret på den relative bevarelsen af de pol-generne til at vurdere generelle tendenser inden HERV slægter 25,26 . Derudover PCR amplifikationer, hvor meget degenererede primere kombineret med lav tæthed microarrays er beregnet til at påvise og bestemme udtryk for Herv familier 27,28. For at spore udtryk for enkelte locus inden for en familie, tilgange baseret på PCR-amplifikation af konserverede områder kombineret med efterfølgende kloning og sekventering aktiveret transkriptionelt aktive særskilte elementer i HML-2 29,30 eller HERV-E4.1 31 familier til identificeres. Også slutter ved kloning og sekventering trin genomet gentage udtrykket overvågning teknik til formål at identificere initiativtagere blandt gentagelser identificerede virksomme HML-2 specifikke menneskelige ensomme LTR'er
Denne metode er det første forsøg på at identificere individuelt HERV locus udtrykhjælp af en brugerdefineret høj densitet microarray baseret på Affymetrix teknologi. De klart identificerede fordele ved microarray-format til at dechifrere HERV transkriptom bestående af (i) den koordinerede efterforskning af flere Herv familier og (ii) den samtidige og uafhængig analyse af de forskellige regioner for hvert locus, fx. U3 og U5 domæner for solo og provirale LTR'erne, gag eller env regioner og eventuelle splejset vejkryds forbundet med provirusstrukturerne uden nogen a priori på funktionaliteten af HERV element. Udsigterne stole på en forbedring af anmærkninger i microarray-associeret bioinformatik værktøjer. Dette skulle give en til at konvertere chip signaler til biologiske hypoteser såsom hvorvidt dokumenteret aktive HERVs drive lncRNA transskription eller modulere mere eller mindre proksimale kodning genekspression. Faktisk er en sådan antagelse understøttes af de seneste undersøgelser, der identificerede prostata cancer-associerede ncRNA udskrifter, der indeholder komponenter af viral ORF'er fra HERV-K endogene retrovirus familie eller dele af en viral LTR-promotor-regionen 37, samt to genfusion begivenheder nemlig HERV-K22q11-ETV1 og HERV-K17-ETV 38,39. Tilsammen kan det hele transkriptom tilgang kombineret med LTR funktion og splejsning strategi identifikationer hjælpe med at dechifrere markør versus trigger komponenter af HERV udtryk i kronisk 40,41 og infektionssygdomme 42,43.
Disclosures
Dette arbejde blev støttet af bioMérieux SA, Hospices Civils de Lyon og den franske offentlige agentur OSEO (Advanced Diagnostics for nye terapeutiske tilgange, en fransk statsfinansieret program dedikeret til skræddersyet medicin). PP, VC, GO, NM, og FM er medarbejdere i bioMérieux SA. PP, NM og FM har indgivet patentansøgninger, der dækker resultaterne af dette papir.
Acknowledgments
Vi takker Cecile Montgiraud, Juliette Gimenez, Magali Jaillard og Bertrand Bonnaud for deres bidrag til den indledende udvikling og optimering af HERV-V2-protokollen. Vi ønsker også at takke Hader Haidous for hans vejledning om etiske overvejelser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trizol | Invitrogen | 15596-026 | |
| RNA poly-A control stock | Affymetrix | 900433 | |
| DNAse 1 | Promega | M6101 | 1,000 U (1 U/µl) |
| Terminal transferase | Roche | 3333574001 | 400 U. Including enzyme and coenzyme (CoCl2). |
| DLR-1a | Affymetrix | 900542 | |
| Hybridization internal controls B2 and 20x Eukaryotic Hybridization Control | Affymetrix | 900454 | |
| GeneChip Hybridization, Wash and staining | Affymetrix | 900720 | Including PreHybridization Mix and 2x Hybridization Mix for 30 reactions |
| 10x One-Phor-All Buffer PLUS | Composition in DEPC-treated water: 100 mM Tris-acetate pH 7.5; 100 mM magnesium acetate; 500 mM potassium acetate. | ||
| RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | RNA cleanup protocol |
| WT-Ovation RNA amplification system | Nugen | 2210-24 | |
| QIAquik PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| EQUIPMENT | |||
| Material Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| Nanodrop 1000 | Thermo Scientific | ||
| GeneChip Scanner 3000 7G | Affymetrix | GS30007G | Optional: autoloader |
| GeneChip Fluidics Station 450 | Affymetrix | FS450 | |
| GeneChip Hybridization 640 Oven | Affymetrix | 640 | Includes 4 GeneChip Probe array carriers |
| Workstation loaded with GeneChip Operating Software (GCOS) including the GeneChip Scanner 3000 High-Resolution Scanning Patch | |||
| HERV-V2 chip | Affymetrix | Custom array. For microarray availability (for research use only), please contact: François Mallet Laboratoire Commun de Recherche Hospices Civils de Lyon-bioMérieux Medical Diagnostic Discovery Department Centre Hospitalier Lyon Sud, Bâtiment 3F 69495, Pierre Bénite cedex France Phone: 33 (0)4 72 67 87 85 Email: francois.mallet@biomerieux.com |
|
| HERV-V2 conception Dedicated database and annotations The construction of a dedicated database, grouping genomic HERV sequences belonging to 6 HERV families, has been achieved by the following procedure: (i) the most complete and representative sequence of each HERV family was selected from the literature and defined as a prototype sequence (Figure 2). (ii) The 6 prototypes were functionally annotated with reference to their LTR (U3/R/U5) and internal parts (gag/pol/env). (iii) RepeatMasker 44 was then applied using these functional sequences as input libraries. A genome-wide search of all related sequences was performed over the human genome on the basis of a minimum 80% homology (NCBI 36/hg18). (iv) Finally, the functional sequences retrieved by this process were assembled into distinct loci on the basis of their genomic location and eventually implemented in a dedicated HERV database. This database, called HERV-gDB3, contains 10,035 individual HERV loci35. Locus-specific probes design Starting from HERV-gDB3, overlapping tracks of 25-mer candidate probes were firstly generated. Each candidate probe was then aligned against the human genome using KASH 45 in order to assess the cross-hybridization potentialities. This latter estimation was performed by a model developed specifically for this purpose and referred to as EDA+. Briefly, the principle of EDA+ is to take into account the instability brought by mismatches and gaps in a 25-mer target/probe hybridization complex. Candidate probes exhibiting low cross-hybridization risks (i.e. a low number of non-specific genomic targets) are selected and lastly assembled into probesets. Custom HERV GeneChip microarray The custom HERV GeneChip integrates 23,583 HERV probesets and can discriminate 5,573 distinct HERV elements, composed of solo LTRs, complete and partial proviruses (Figure 2). The standard Affymetrix control probes for unbiased amplification and hybridization were also included in the microarray. |
|||
References
- Artibani, W. Landmarks in prostate cancer diagnosis: the biomarkers. BJU Int. 110, Suppl 1. 8-13 (2012).
- Girometti, R., et al. Negative predictive value for cancer in patients with "gray-zone" PSA level and prior negative biopsy: preliminary results with multiparametric 3.0 Tesla MR. J. Magn. Reson. Imaging. 36, 943-950 (2012).
- You, B., et al. Prognostic value of modeled PSA clearance on biochemical relapse free survival after radical prostatectomy. Prostate. 69, 1325-1333 (2009).
- Vickers, A. J., Brewster, S. F. PSA Velocity and Doubling Time in Diagnosis and Prognosis of Prostate Cancer. Br. J. Med. Surg. Urol. 5, 162-168 (2012).
- Bussemakers, M. J., et al. DD3: a new prostate-specific gene, highly overexpressed in prostate cancer. Cancer Res. 59, 5975-5979 (1999).
- Vlaeminck-Guillem, V., Ruffion, A., Andre, J., Devonec, M., Paparel, P. Urinary prostate cancer 3 test: toward the age of reason. Urology. 75, 447-453 (2010).
- Buscher, K., et al. Expression of the human endogenous retrovirus-K transmembrane envelope, Rec and Np9 proteins in melanomas and melanoma cell lines. Melanoma Res. 16, 223-234 (2006).
- Ishida, T., et al. Identification of the HERV-K gag antigen in prostate cancer by SEREX using autologous patient serum and its immunogenicity. Cancer Immun. 8, 15 (2008).
- Sauter, M., et al. Human endogenous retrovirus K10: expression of Gag protein and detection of antibodies in patients with seminomas. J. Virol. 69, 414-421 (1995).
- Pérot, P., Bolze, P. A., Mallet, F. Viruses: Essential Agents of Life. Witzany, G. , Springer-Verlag. 325-361 (2012).
- Stamey, T. A., Kabalin, J. N. Prostate specific antigen in the diagnosis and treatment of adenocarcinoma of the prostate. I. Untreated patients. Untreated patients. J. Urol. 141, 1070-1075 (1989).
- Catalona, W. J., et al. Measurement of prostate-specific antigen in serum as a screening test for prostate cancer. New Engl. J. Med. 324, 1156-1161 (1991).
- Schroder, F. H. Prostate cancer around the world. An overview. Urol. Oncol. 28, 663-667 (2010).
- Klotz, L. Active surveillance for favorable-risk prostate cancer: background, patient selection, triggers for intervention, and outcomes. Curr. Urol. Rep. 13, 153-159 (2012).
- Irizarry, R. A., et al. Exploration, normalization, and summaries of high density oligonucleotide array probe level data. Biostatistics. 4, 249-264 (2003).
- Tusher, V. G., Tibshirani, R., Chu, G. Significance analysis of microarrays applied to the ionizing radiation response. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 5116-5121 (2001).
- Storey, J. D., Tibshirani, R. Statistical significance for genomewide studies. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 9440-9445 (2003).
- Team, R. D. C. R: A language and environment for statistical computing. , (2008).
- Gentleman, R. C., et al. Bioconductor: open software development for computational biology and bioinformatics. Genome Biol. 5, R80 (2004).
- de Parseval, N., Lazar, V., Casella, J. F., Benit, L., Heidmann, T. Survey of human genes of retroviral origin: identification and transcriptome of the genes with coding capacity for complete envelope proteins. J. Virol. 77, 10414-10422 (2003).
- Wang-Johanning, F., et al. Detecting the expression of human endogenous retrovirus E envelope transcripts in human prostate adenocarcinoma. Cancer. 98, 187-197 (2003).
- Smallwood, A., et al. Temporal regulation of the expression of syncytin (HERV-W), maternally imprinted PEG10, and SGCE in human placenta. Biol. Reprod. 69, 286-293 (2003).
- Okahara, G., et al. Expression analyses of human endogenous retroviruses (HERVs): tissue-specific and developmental stage-dependent expression of HERVs. Genomics. 84, 982-990 (2004).
- Buscher, K., et al. Expression of human endogenous retrovirus K in melanomas and melanoma cell lines. Cancer Res. 65, 4172-4180 (2005).
- Forsman, A., et al. Development of broadly targeted human endogenous gammaretroviral pol-based real time PCRs Quantitation of RNA expression in human tissues. J. Virol. Methods. 129, 16-30 (2005).
- Muradrasoli, S., Forsman, A., Hu, L., Blikstad, V., Blomberg, J. Development of real-time PCRs for detection and quantitation of human MMTV-like (HML) sequences HML expression in human tissues. J. Virol. Methods. 136, 83-92 (2006).
- Seifarth, W., et al. Comprehensive analysis of human endogenous retrovirus transcriptional activity in human tissues with a retrovirus-specific microarray. J. Virol. 79, 341-352 (2005).
- Pichon, J. P., Bonnaud, B., Mallet, F. Quantitative multiplex degenerate PCR for human endogenous retrovirus expression profiling. Nat. Protoc. 1, 2831-2838 (2006).
- Flockerzi, A., et al. Expression pattern analysis of transcribed HERV sequences is complicated by ex vivo recombination. Retrovirology. 4, 39 (2007).
- Flockerzi, A., et al. Expression patterns of transcribed human endogenous retrovirus HERV-K(HML-2) loci in human tissues and the need for a HERV Transcriptome Project. BMC Genomics. 9, 354 (2008).
- Gosenca, D., et al. HERV-E-Mediated Modulation of PLA2G4A Transcription in Urothelial Carcinoma. PLoS ONE. 7, e49341 (2012).
- Buzdin, A., Kovalskaya-Alexandrova, E., Gogvadze, E., Sverdlov, E. GREM, a technique for genome-wide isolation and quantitative analysis of promoter active repeats. Nucleic Acids Res. 34, e67 (2006).
- Buzdin, A., Kovalskaya-Alexandrova, E., Gogvadze, E., Sverdlov, E. At least 50% of human-specific HERV-K (HML-2) long terminal repeats serve in vivo as active promoters for host nonrepetitive DNA transcription. J. Virol. 80, 10752-10762 (2006).
- Gimenez, J., et al. Custom human endogenous retroviruses dedicated microarray identifies self-induced HERV-W family elements reactivated in testicular cancer upon methylation control. Nucleic Acids Res. 38, 2229-2246 (2010).
- Pérot, P., et al. Microarray-based sketches of the HERV transcriptome landscape. PLoS ONE. 7, e40194 (2012).
- Fehlbaum, P., Guihal, C., Bracco, L., Cochet, O. A microarray configuration to quantify expression levels and relative abundance of splice variants. Nucleic Acids Res. 33, e47 (2005).
- Prensner, J. R., et al. Transcriptome sequencing across a prostate cancer cohort identifies PCAT-1, an unannotated lincRNA implicated in disease progression. Nat. Biotechnol. 29, 742-749 (2011).
- Tomlins, S. A., et al. Distinct classes of chromosomal rearrangements create oncogenic ETS gene fusions in prostate cancer. Nature. 448, 595-599 (2007).
- Hermans, K. G., et al. Truncated ETV1, fused to novel tissue-specific genes, and full-length ETV1 in prostate cancer. Cancer Res. 68, 7541-7549 (2008).
- Brodziak, A., et al. The role of human endogenous retroviruses in the pathogenesis of autoimmune diseases. Med. Sci. Monit. 18, RA80-RA88 (2012).
- Mullins, C. S., Linnebacher, M. Human endogenous retroviruses and cancer: Causality and therapeutic possibilities. World J. Gastroenterol. 18, 6027-6035 (2012).
- Young, G. R., et al. Resurrection of endogenous retroviruses in antibody-deficient mice. Nature. 491, 774-778 (2012).
- Vander Kuyl, A. C. HIV infection and HERV expression: a review. Retrovirology. 9, 6 (2012).
- Smit, A. F. A., Hubley, R. RepeatMasker Open-3.0. , (1996).
- Navarro, G., Raffinot, M. Flexible Pattern Matching in Strings: Practical On-Line Search Algorithms for Texts and Biological Sequences. , Cambridge University Press. (2002).
