人内源性反转录病毒(HERV),它占据了人类基因组中的8%,保留稀缺编码能力,但一十万长末端重复序列(LTRs)。一个自定义的Affymetrix基因芯片的目的是找出个人赫尔维基因的表达,并用在前列腺癌组织的概念,为今后的临床研究证明。
前列腺特异性抗原(PSA)是用于临床使用的前列腺癌的主要诊断的生物标志物,但它缺乏特异性和敏感性,尤其是在低剂量值1。 “如何使用PSA”仍然是当前的问题,无论是对诊断为对应于血清2.5-10纳克/毫升的浓度不允许的癌症和非癌症2或病人随访取得了明显的分化灰色地带时作为手术后的PSA分析动力学参数可能会造成相当大的挑战,他们的实际应用3,4。另外,非编码RNA(ncRNA方法)正在成为人类癌症的关键分子,有潜力成为疾病的新型标志物, 如 PCA3在前列腺癌5,6和揭示肿瘤生物学的未知问题。此外,从2012年出版ENCODE项目的数据表明,不同类型的RNA覆盖约62%的根的青梅。而且,看来的转录调控基序的量为比对应于编码蛋白质的外显子1的至少4.5倍高。因此,人的内源性逆转录病毒(HERVs)的长末端重复序列(LTRs)构成了广泛推定/候选转录调节序列的,因为它是在感染性逆转录病毒它们的主要功能。 HERVs,它们扩散到整个人类基因组中,从种系内的祖先和独立的感染,随后复制粘贴扩展过程,并导致多拷贝的家庭占人类基因组的8%(注意,外显子跨越了基因组的2%的起源)。有些赫尔维位点仍表现已经与几个病症包括癌症7-10相关的蛋白质。我们设计了高密度微阵列,在Affymetrix公司形式,旨在以最佳表征个体赫尔维位点表达,以便更好地了解他们是否可以活动,如果他们驾驶的非编码RNA的转录或Modulate编码基因的表达。这个工具已经在前列腺癌字段( 图1)中得到应用。
人类内源性逆转录病毒(也称为HERVs)是我们整个基因组中传播。他们从生殖系内的祖先和独立的感染,其次是复制粘贴的传播过程,并导致多拷贝的家庭起源。今天,他们没有更多的传染性,但它们占据了人基因组的8%;作为比较点,外显子跨越了人类基因组的2%。从2012年出版ENCODE项目的数据表明,不同类型的RNA覆盖约62%的基因组,其中包括在间隔区的三分之一。此外,似乎的转录调控基序的量为比对应于编码蛋白质的外显子1的至少4.5倍高。 HERVs长末端重复序列(LTR)代表广泛的潜在的转录调控元件的,因为它是在感染性逆转录病毒它们通常的功能。从历史上看,除了少数位点表达的胎盘或睾丸,人们普遍认为,赫尔维是无声的,由于EPigenetic调节。因此,我们设计了高密度微阵列,在Affymetrix公司的形式,旨在以最佳表征个体赫尔维位点表达,以便更好地了解它们是否处于活动状态,如果他们驾驶lncRNA转录或调节编码基因的表达。该工具被称为HERV-V2的基因芯片集成了23,583赫尔维的探针,可以区分个人的LTR组成5,573截然不同的赫尔维元素,以及完整的和部分原病毒( 图2)。
诊断,评估和计划:
前列腺癌的诊断依据前列腺特异性抗原(PSA)的生物标志物在临床实验室,直肠指检评估前列腺形态学改变,最后由病理学家观察前列腺活检的用量。传统的癌症生物标志物,如PSA前列腺癌之间足够的特异性和敏感性的缺乏,已被广泛认可AF之三几十年的临床意义1。首先,提出了在前列腺11腺癌的诊断和治疗的PSA。这是后者建议癌症筛查和监测疾病12的发展。但是,仍然存在一个问题,经常问:“如何使用PSA”。 (I)对应于浓度血清2.5-10纳克灰色地带/毫升不允许被癌症和非癌症2之间作出了明确的差异;(二)两个大型队列研究招募成千上万的人在欧洲和美国未能前来关于筛查在疾病特异性死亡率13,14条款的有效性一个明确的结论;(三)分析术后PSA动力学参数,如PSA的间隙,PSA速度和倍增时间的,虽然简单的理论,可能会造成在实际应用中3,4相当大的挑战。我们可以预期,在未来几年,生物标志物的应用程序lications将支持观察等待和更多的还是依赖于肿瘤的表型较不积极治疗之间的一种临床选择。至于由病理学家提供的诊断,第一限制因素来自前列腺活检中有20%的假阴性诊断(许多癌症是由采样错过了)。第二个关注涉及以下的负1,这可能呈现的不利影响,需要额外的活检程序。
前列腺癌根治术是目前前列腺癌的标准治疗方法之一。所以建议在健康的患者,从45-65岁(格里森7至10)老化,特别是在积极的图案的情况下,多灶性肿瘤或可触知的肿瘤。它现在在我科采用机器人辅助手术完成。因为越来越多的证据表明,分子标记技术将在未来几年内最为重要的,我们决定向所有的患者参加一个节目前列腺的可能性组织库。更确切地说,对前列腺癌的分子扩大研究计划已经导致越来越要求获得高品质的新鲜肿瘤组织中前列腺切除标本。这项研究,特别是基因组学方法,要求高的DNA / RNA的质量大样本。需要的肿瘤和邻近的“非肿瘤'从同一患者的组织。处理和加工根治性前列腺切除术的建议,目的是确保确定阶段和边缘状态,从而可能进一步治疗和预后病理特征。任何新鲜组织抽样的方法,因此,不应影响随后的病理评估,以可以接受的诊断。前列腺的解剖肉眼很难和高度重视需要支付保证金的组织和包膜浸润:任何解剖前列腺银行应始终由经过培训的uropathologist根据同意进行D协议。医学院和国家医疗委员会的伦理委员会同意这些调查和知情同意的获得为包含在前列腺组织银行所有患者。
在过去的10年中,大部分为尝试HERV表达测量都使用了RT-PCR技术,要么专注于某一特定位点20-24或基于的聚合酶基因的相对保护内赫尔维属25,26评估的一般趋势。此外,使用加上用于检测和量化HERV家庭27,28的表达低密度微阵列高度简并引物PCR扩增。为了跟踪一个家庭内的单个基因座的表达,方法的基础上的保守区结合随后的克隆和测序的PCR扩增使HML-2 29,30或HERV-E4.1 31家庭到转录活性的不同元件被识别。还通过克隆和测序步骤结束时,基因组重复表达监测技术,目的是查明确定主动HML-2特异性人孤零零的LTR重复发起人之一<sup> 32,33。我们先后开发了两代的高密度微阵列专用于赫尔维转录组的分析,引入适合重复的元素探测的设计方法,以减少家庭34,35内旁系同源分子之间的交叉反应。该赫尔维-V2芯片,针对2,690截然不同的HERV-W,HERV-H,HERV-E 4.1,赫尔维 – FRD,HERV-K HML-2和赫尔维-K HML-5系列的原病毒和2,883独奏的LTR,亮相的1718 HERV位点(图7A和B)在一个宽范围的组织35,以推定的前列腺癌生物标志物的鉴定中示出本文的表达。此外,在给定的轨迹中使用多个探针组的信息是关于它的转录调控。首先,在同一个U5正面1结合一个U3的负信号进行分类的LTR启动子,并且相反地U3正极和U5的负信号可以反映一个多聚腺苷酸化作用。因此,我们我dentified在广泛的组织35,并在此基础上的U3 U5由阵列提供二分信息326的LTR启动子,我们提出,并通过实验证实了一段选定的情况下,这种独立的转录是得到了甲基化依赖的表观遗传过程34( 图控制8)。其次,从如 LTR的检测信号, 插科打诨和env独立的探针或针对特定剪接点探针发出的信息是对前病毒拼接策略,就说明了在胎盘或睾丸肿瘤34 ERVWE1/Syncytin1表达谱。这表明,赫尔维特异性探针的选择过程是强大到足以支持组织相关的拼接战略的确定,尽可能高效率地用于传统的基因36( 图8)。
这种方法是第一次尝试,以确定个别赫尔维表达基因使用基于Affymetrix公司的技术,一个自定义的高密度微阵列。微阵列格式的明确优势破译HERV转录组包括(i)协调勘探几个HERV家庭及(ii)同时和独立分析不同区域的每个基因座的, 例如 。 U3和U5结构域独奏和原病毒的LTR,GAG或包膜的区域和可能的前病毒的结构相关联的拼接连接处,没有任何先验的HERV元件的功能。前景依赖于微阵列相关的生物运算工具注解的改进。这应该允许一个转换芯片信号转换成生物假说,如证明积极HERVs是否推动lncRNA转录或调节或多或少近端编码基因的表达。事实上,这样的假设是支持最近的研究,发现含有的V分量前列腺癌相关的非编码RNA转录物iral的ORF从HERV-K内源性逆转录病毒家族或部分的病毒LTR启动子区域37,以及2基因融合事件即HERV-K22q11-ETV1和HERV-K17-ETV 38,39。两者合计,整个转录组的方法结合LTR功能和拼接策略标识可以帮助破译的标记与赫尔维表达的触发组件慢性40,41和传染病42,43。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢薛Montgiraud,朱丽叶·希门尼斯和Magali Jaillard和Bertrand Bonnaud对本赫尔维-V2协议的初始开发和优化的贡献。我们还要感谢哈德Haidous他在道德方面的考虑指导。
Trizol | Invitrogen | 15596-026 | |
RNA poly-A control stock | Affymetrix | 900433 | |
DNAse 1 | Promega | M6101 | 1,000 U (1 U/µl) |
Terminal transferase | Roche | 3333574001 | 400 U. Including enzyme and coenzyme (CoCl2). |
DLR-1a | Affymetrix | 900542 | |
Hybridization internal controls B2 and 20x Eukaryotic Hybridization Control | Affymetrix | 900454 | |
GeneChip Hybridization, Wash and staining | Affymetrix | 900720 | Including PreHybridization Mix and 2x Hybridization Mix for 30 reactions |
10x One-Phor-All Buffer PLUS | Composition in DEPC-treated water: 100 mM Tris-acetate pH 7.5; 100 mM magnesium acetate; 500 mM potassium acetate. | ||
RNeasy Mini kit | Qiagen | 74104 | RNA cleanup protocol |
WT-Ovation RNA amplification system | Nugen | 2210-24 | |
QIAquik PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
EQUIPMENT | |||
Material Name | Company | Catalogue Number | Comments |
Nanodrop 1000 | Thermo Scientific | ||
GeneChip Scanner 3000 7G | Affymetrix | GS30007G | Optional: autoloader |
GeneChip Fluidics Station 450 | Affymetrix | FS450 | |
GeneChip Hybridization 640 Oven | Affymetrix | 640 | Includes 4 GeneChip Probe array carriers |
Workstation loaded with GeneChip Operating Software (GCOS) including the GeneChip Scanner 3000 High-Resolution Scanning Patch | |||
HERV-V2 chip | Affymetrix | Custom array. For microarray availability (for research use only), please contact: François Mallet Laboratoire Commun de Recherche Hospices Civils de Lyon-bioMérieux Medical Diagnostic Discovery Department Centre Hospitalier Lyon Sud, Bâtiment 3F 69495, Pierre Bénite cedex France Phone: 33 (0)4 72 67 87 85 Email: francois.mallet@biomerieux.com |
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HERV-V2 conception Dedicated database and annotations The construction of a dedicated database, grouping genomic HERV sequences belonging to 6 HERV families, has been achieved by the following procedure: (i) the most complete and representative sequence of each HERV family was selected from the literature and defined as a prototype sequence (Figure 2). (ii) The 6 prototypes were functionally annotated with reference to their LTR (U3/R/U5) and internal parts (gag/pol/env). (iii) RepeatMasker 44 was then applied using these functional sequences as input libraries. A genome-wide search of all related sequences was performed over the human genome on the basis of a minimum 80% homology (NCBI 36/hg18). (iv) Finally, the functional sequences retrieved by this process were assembled into distinct loci on the basis of their genomic location and eventually implemented in a dedicated HERV database. This database, called HERV-gDB3, contains 10,035 individual HERV loci35. Locus-specific probes design Starting from HERV-gDB3, overlapping tracks of 25-mer candidate probes were firstly generated. Each candidate probe was then aligned against the human genome using KASH 45 in order to assess the cross-hybridization potentialities. This latter estimation was performed by a model developed specifically for this purpose and referred to as EDA+. Briefly, the principle of EDA+ is to take into account the instability brought by mismatches and gaps in a 25-mer target/probe hybridization complex. Candidate probes exhibiting low cross-hybridization risks (i.e. a low number of non-specific genomic targets) are selected and lastly assembled into probesets. Custom HERV GeneChip microarray The custom HERV GeneChip integrates 23,583 HERV probesets and can discriminate 5,573 distinct HERV elements, composed of solo LTRs, complete and partial proviruses (Figure 2). The standard Affymetrix control probes for unbiased amplification and hybridization were also included in the microarray. |