Immunology and Infection

Nanomechanics של אינטראקציות סמים היעד ואיתור התנגדות אנטיבקטריאלי

Published: October 25, 2013 doi: 10.3791/50719

Joseph W. Ndieyira¹, Moyu Watari¹, Rachel A. McKendry¹

¹London Centre for Nanotechnology and Departments of Medicine, University College London

Summary

רכשה עמידות לאנטיביוטיקה היא בעיה בריאות ציבורית גדולה והיא מדורגת כיום על ידי ארגון הבריאות העולמי כאחת הסכנות הגדולות ביותר לחיי אדם. כאן אנו מתארים את השימוש בטכנולוגית שלוחה לכמת התנגדות אנטיבקטריאלי, קריטית לגילוי של סוכני רומן ורבי עוצמה נגד multidrug חיידקים עמידים.

Abstract

חיישן שלוחה, הפועל כמתמר של תגובות בין מודל חיידקי דופן תא משותקת על פני השטח שלו ותרופות אנטיביוטיות בפתרון מטריצה, הראה פוטנציאל רב ביישומי חישה ביוכימיים ברגישות וסגוליות ^1-5 חסר תקדים. את אינטראקציות סמים היעד ליצור מתח פני השטח, וגרם שלוחה להתכופף, והאות ניתן לנתח אופטי כאשר הוא מואר על ידי לייזר. השינוי במשטח לחץ נמדד בדייקנות בקנה מידה ננו מאפשר שיבושים בביומכניקה של קיר תא חיידק מודל המטרות כדי להיות במעקב בזמן אמת. למרות מציע יתרונות משמעותיים, חיישן מערכי שלוחה מרובים מעולם לא יושמו בכימות אינטראקציות מחייבות סמים היעד.

כאן אנו מדווחים על השימוש במערכים מרובים שלוחה סיליקון מצופה עצמית התאספו monolayers alkanethiol מחקה חיידקי קיר מטריצת תא כמותית לסטהאינטראקציות מחייבות אנטיביוטיות dy. כדי להבין את ההשפעה של ונקומיצין על המכניקה של מבני קיר תא חיידק ^1,6,7. אנחנו פיתחה מודל חדש שמציע ¹ שלוחה כיפוף שיכולה להיות מתוארת על ידי שני גורמים בלתי תלויים; I) כלומר גורם כימי, אשר ניתן על ידי ספיחת האיזותרמה אנגמיור קלסית, שממנו אנו מחשבים את שיווי משקל תרמודינמי ניתוק הקבוע (K _ד) ו ii) גורם גיאומטרי, למעשה מדד של כמה קולטנים פפטיד חיידקים מופצים על פני שלוחה. משטח ההפצה של קולטנים פפטיד (עמ ') משמשת כדי לחקור את התלות של גיאומטריה וטעינה ליגנד. הוא הראה כי ערך סף של p ~ 10% הוא קריטי ליישומי חישה. שמתחתיו אין אות זיהוי תוך כיפוף מעל ערך זה, אות הכיפוף מגדילה כמעט ליניארי, חושפת כי לחץ הוא תוצר של חומר כימי מקומי מחייבים facטור וגורם גיאומטרי בשילוב של הקישוריות מכאנית של אזורים הגיבו ומספק פרדיגמה חדשה לעיצוב של סוכנים רבי עוצמה כדי להילחם בזיהומי superbug.

Introduction

הפרדיגמה נתחים המולקולריים ההכרה ניצבת בבסיס גדול של ביולוגיה ורפואה. בפרמקולוגיה, למשל המטרה היא להפריע למסלול פתולוגית על ידי מיקוד משתתף מרכזי בתהליך ביוכימי כגון transglycoslyation או transpeptidation שמזרז crosslinking של פפטידים קיר תא חיידק. תכנון התרופות מצטמצם ולכן להגדרת מולקולה מתאימה כדי למקד את אתר עגינה חיידקים ספציפי כדי לגרום להתאמה מושלמת. דוגמה קלאסי לחיקוי ההצלחה של גישה זו היא ונקומיצין (ואן), אשר מטרות דופן תא פפטידוגליקן, תכונה מבנית שימור של חיידק. בחיידק גראם חיובי המתהווה, מטריצת פפטידוגליקן מורכבת של פפטידים המסתיימים ברצף ליזין-D-אלנין-D-אלנין, קשורים באמצעות C55 ^8-10 מקשר שומנים כאן מכונה D-עלא. פפטידים אלו שנחשפו על מבשרי peptidoglycan הם יסוד להגנה מכאנית של התאים חיידקיים נגד כוחות סביבתיים קשים, וחשוב מכך, לא נמצא בתאים אנושיים, מה שהופך אותם למטרות אידיאליות לתרופות אנטיביוטיות. אן במיוחד נקשר לC-הסופית של פפטידים קיר תא החיידק יוצרים ואן-פפטיד חזק בינוני מורכב, כפי שמוצג באיור 1. אינטראקציה זו בין ואן ואת אבני פפטידים שנחשפו מעשיו של transpeptidases וtransglycosylases, אשר לזרז cross-linking של קירות תא ^1, ביעילות לעצור אותם מcrosslinking ולכן nanomechanically מחליש את תא החיידק שהוביל למותה על ידי קרע ^{1,6, 7.}

הופעתה של vancomycin עמיד אנטרוקוקוס (VRE) היא בעיה בריאות ¹¹ גוברת ובגלל עמידות החיידקים בEnterococci מתעוררת עקב השינוי העדין של לין אמיד Kage להצמדת אסתר ^8, שינוי מבני פשוט מטעה זה על פני השטח של החיידק מוחק קשר מימן אחד מאתר עגינה של ואן עם השינוי הבא של הכיס המחייב. חשוב לציין את התהליך הזה משנה את הווה אלאנין מסוף pentapeptide בונקומיצין רגיש אנטרוקוקוס (VSE) ליזין ^{10,12-D-אלנין-D-חומצת} חלב, המכונה כאן D-Lac, מניב לירידה משמעותית בזיקה מחייבת ואן-D-Lac ידי שלושה סדרי הגודל ואן טיוח טיפולי יעילה נגד זיהומי Enterococcal ^1, הצמיחה המדאיגה של חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה הוא נוהגים פיתוח גישות חדשניות אפוא להאיץ ולשחזר את הפעילות אנטיבקטריאלי של סוכנים אנטיבקטריאלי או גילוי של תרופות יותר חזקות נגד חיידקים עמידים multidrug זיהומים.

= "Jove_content" כיתה> הניסויים שלנו באמצעות cantilevers שעמד חופשי בהשראת המערכות כגון תאים אשר לרתום אנרגיה כימית לתנועה. היכולת של חיישני שלוחה לתרגם אנרגיה כימית לתנועה מכאנית גורמת להם בדיקות ייחודיות עם יתרונות רבים לניטור הפרעות מכאניות של מטרות קיר תא חיידק בזמן אמת. את חיישני שלוחה דורשים 'תגים' לא כתב וביומולקולות מזוהות במהירות בתגובה בשלב יחידה. הם יכולים להקרין תרופות מרובות במקביל בסביבות פיסיולוגיות כגון פתרונות שנאגרו וכל סרום. בנוסף, הטכנולוגיה משתמשת בשלוחת התייחסות אתר למדידות דיפרנציאלי המאפשרים להם לזהות באופן ספציפי אינטראקציות סמים והיעד, מכוח הייצור שלהם באמצעות מסלולים מוליכים למחצה לעיבוד סטנדרטי, הם נוחים לייצור המוני ועמות להקרנת תפוקה גבוהה של אלפי של תרופות לשעה. בparticחיישן מערכים מרובים שלוחה ular הם כלים שימושיים לחקר עמידות לאנטיביוטיקה לונקומיצין - בגלל התנגדות לוונקומיצין היא בעיקרו בעיה מכאנית ^1,6,7. התגובות שבין מודל יעד חיידקי דופן תא ואן בפתרון יכולות להיות מזוהות על ידי מעקב אחר השינויים במתח רלוונטי קליני הנגרמים מתגובות בין תרופתי מחייבות גבוהה מהיעד. המתח שנוצר משטח תגובות אשר באו לידי ביטוי באות כיפוף שלוחה מנותח על ידי חיישנים אופטי מאירים עם קרן לייזר. יתרה מזאת על ידי התאמת הציפוי פתוח של מולקולות מטרת משטח חיידקים על גבי חיישן שלוחה, קרוב למספר בלתי מוגבל של analytes (ואן), האינטראקציות ביוכימיות הספציפיות וביומכניקה של תא חיידק מודל קיר מטריצה מנוטרת בזמן אמת. מלבד אירוע ההכרה המולקולרי, ישנם מספר גורמים שיכולים לגרום לחיישני שלוחה defבוחר בי, הכולל - וריאציות טמפרטורה, מחייב נוקבים או שינויים של מקדם שבירה של הפתרון. כדי להסביר את אותות ספציפיים, במדידות באתרו דיפרנציאלי מבוצעים בו הכיפוף של שניהם המדידה וcantilevers התייחסות מנוטרים באופן רציף כדי לנתח אינטראקציות ספציפיות. יתר על כן, ניתן לשפר את זיהוי של רגישויות חיישני שלוחה הנשען על פני השטח וגיאומטרית chemistries ידי כוונון צפיפות השטח עמ '(עמ' שבו מוגדר כיחס בין שטח הפנים שנכבש על ידי מולקולות לכידה לאזור המשטח העליון של כל שלוחה מכוסה על ידי האוכלוסייה של מולקולות, כפי שנקבע על ידי X-Ray Photoelectron ספקטרוסקופיה (XPS) ^1.

הנה פרטי פרוטוקול זה איך ונקומיצין או כל אנטיביוטיקה אחרת מחייב אנלוגים חיידקי דופן תא מבשר (mucopeptides) בריכוזים רלוונטיים קליני בפתרון שנאגרונסיוב דם ND יכול להיות מזוהה על ידי טכנולוגיית שלוחה תווית ללא שימוש. משטחי זהב טריים משמשים כי monolayers עצמית התאספו (Sams) נוטות ליצור שכבות יציבות בקלות על זהב נקי ^13,14. טילים נ"מ מורכב בדרך כלל ממולקולות קצרות עם מחצית תיאול המצורפת קוולנטית במשטח הזהב בזמן שיחידת לכידה הרצויה בצד השני מותרת להגיב בחופשיות עם המטרות אנליטי בתמיסה. Thiols ליצור מערכת גמישה במיוחד בהתחשב כי תרכובות תיאול רבות עם קבוצות קצה כימיות שונות זמינות באופן מסחרי או מסונתזים בקלות במעבדה. עם זאת, יש להקפיד על מנת להבטיח שמולקולות עם מחצית תיאול חייבת את קבוצות הקצה הנכונות, לדוגמה בחלבון או נטיה פפטיד, הקבוצה אמינית צריכה להתמודד פנימה לתגובה עם קבוצת carboxylic של מחצית תיאול קשורה על פני השטח כדי להתעורר. הנה, את thiols היה מצומדת ישירות עם mimetics tripeptide של חיידקי שומנים משניים בדופן תא acterial יעדים מסונתזת על ידי המתודולוגיה שלב מוצקה באמצעות זמין מסחרי מראש וואנג-D-עלא וואנג-D-Lac שרפים והסטנדרטי Fmoc הגנת קבוצת הכימיה ^15. למרות שתיאור זה מתמקד לוונקומיצין, ברור שזה יכול להתארך לאנטיביוטיקה אחרות, ואכן מחקרים נוספים מוזמנים על ידי חוקרים מתחומים שונים ובמיוחד בביוכימיה, פרמקולוגיה, מדעי חומר ולאמץ פרוטוקול זה לניסויים שלהם בקלות.

Protocol

1. הכנת cantilevers

שימוש בטפלון פינצטה לטבול מספר הנבחר של שבבי שלוחה (כל שלוחה מדידה 500 מיקרומטר הארוך, 100 מיקרומטר רחב ו0.9 מיקרומטר עבה) לפתרון Piranha טרי (ב 1:1 H ₂ SO ₄ ו-H ₂ O ₂₎ במשך 20 דקות .
לאחר כ 20 דקות להסיר את שבבי שלוחה מפתרון Piranha ולשטוף אותם ביסודיות עם מים deionized ולהעביר באופן מיידי לפתרון Piranha מוכן טרי. חזור על שלב 1.1 לעיל, אם את השבבים מכילים כתמי לכלוך אחר, המשיכו לשלב הבא.
לאחר ניקוי יסודי במי deionized, לשטוף עם אתנול טהור ולייבש את שבבי שלוחה על פלטה חמה על 75 ° C כדי להסיר כל עקבות של מים. לבדוק אותם באמצעות מיקרוסקופ אופטי כדי לאשר הניקיון שלהם.
העבר את שבבי שלוחה ניקו לתא אידוי ולשאוב למטה, כדי להשיג מיקוד ואקוםלחץ של 10 ^-7 mbar.
ברגע שלחץ הוואקום הנדרש יושג, צד אחד מעיל של כל מערך שלוחה עם טיטניום 2 ננומטר ראשון שפועל כשכבת הדבקה לפני שכבה נוספת של 20 ננומטר זהב עבה. כדי לאשר את העובי שלהם, להשתמש בצג גביש קוורץ ממוקם ישירות מעל למקור היעד.
השאר שבבי חיישן שלוחה מצופים זהב בתא עבור 1-2 שעות להתקרר תחת ואקום לפני הפתיחה.
העבר את השבבים טריים התאדו לכלי אחסון ואקום מלאים בארגון, כדי למנוע כל סוג של זיהומים.

2. Functionalization צ'יפ שלוחה

, ראשית לארגן צינורות מייקר הנימים על במה functionalization ² בהתאם לגודל המגרש שלוחה של 250 מיקרומטר.
לאחר מכן 2 מ"מ פתרונות האתנולית תיאול של מולקולות מטרת משטח, mucopeptides חיידקי IE (D-עלא ו-D-Lac) להזריק, וINER 'alkanethiol 'לא מסתיים בגליקול triethylene (PEG) ידועה להתנגד biomolecular ספיחה. ¹⁶ כל אחד מtubings הנימים צריך להכיל מולקולות ללכוד שטח שונים שנקבעו באופן אקראי, כדי למנוע הטיה משתמש.
דגירה הבאה במשך 20 דקות את cantilevers בmicrocapillaries מלאה בפתרונות המכילים מולקולות תיאול לכידת פני שטח. להבטיח כי פתרונות של המולקולות ללכוד משטח מוגבלים על כל חיישן שלוחה אדם, כדי למנוע או למזער זיהומים צולבים. אם תהליך זה הוא מועסק בצורה נכונה, הוא צריך לשנות את אופן שיטתי cantilevers מצופה הזהב שהוכן זה עתה לחיישנים כימיים פעילים שהוקמו על ידי המאפשר לטילים נ"מ של מטרות mucopeptide חיידקים להיווצר על משטחי זהב מצופים כמו קולטנים.

3. הכנות פתרון

ממיסים 0.1 מלחי פוספט נתרן מונו ודי בסיסיים-M במי ultrapure (18.2 MΩ · ס"מ התנגדות) ולא לערבבo להניב ערך ה-pH של 7.4.
הוסף 0.002% מPS80 לפתרונות שנאגרו כדי למזער את ההשפעות שנגרמו על ידי צבירת אינטראקציות ספציפיות של מולקולות תרופה לכלי הזכוכית.
לדלל תרופות עם פתרונות טריים שנאגרו לריכוזים השונים הרצויים שיאפשר חישוב של K _ד.
סנן את פתרונות סמים המוכנים טרי באמצעות מסנני 0.2 מיקרומטר וsonicate במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר לפני הקאה עם ארגון.
לחזור על התהליך עם תרופה בסרום שנאגרו באמצעות כל סרום. מערבולת בעדינות במשך 15 דקות עם 5 דקות נוספות על מנת להבטיח מסיסות מלאה.

4. איתור מתח פני השטח

טען שבב חיישן שלוחה פונקציונליות לתוך תא תא זרימת נוזל.
יישר את נקודת לייזר על גבי קצה החופשי של כל חיישן ולאשר את היישור על ידי חימום חדר הנוזל ל1 ° C. כל שמונה מערכי חיישן שלוחה המצופים הזהב צריכים לעבור compressive כלפי מטה כיפוף בגלל השפעת bimetallic נגרמת על ידי ההבדלים בשיעורי התרחבות של סיליקון וזהב.
לאחר חימום לכ -10 דקות, לאפשר לcantilevers להתקרר במשך 10 דקות נוספות.
לחשב את הווריאציה כיפוף באותות כיפוף המקסימאליים בין חיישני שלוחה בודדים ואם סטיית התקן היחסית של אותות כיפוף היא ≤ 5% לאחר מכן לקבל את היישור כרצוי אחרת לחזור על התהליך.
בשלב הבא, למדוד את תדרי התהודה של כל שמונה cantilevers לחשב קבועי האביב שלהם. אם הווריאציה של המעיין המתמיד בין כל חיישן שלוחה בתוך שבב היא ≤ 1% אז יקבלו את השבב כבעל תכונות מכאניות עקביות אחרת להחליף את חיישן שבב שלוחה.
בשלב הבא, להשתמש במערכת fluidic (דגם Genie פלוס) דרך שסתום שש דרך להשיג תמורת הנוזל בתוך תא הזרימה בזמן צריכה להיות מושגת באמצעות רכישת נתונים LabVIEW אוטומטי כךftware.
כדי לפקח על שלוחה כיפוף נתונים, להשתמש בפרוטוקולי המדידה הבאים: I) להזריק או פתרון חיץ או בסרום ללא תרופה למדידת טווח לשליטת 5-30 דקות להקים בסיס; II) להזריק פתרון תרופה במשך 30-60 דקות, III) להזריק 10 מ"מ HCl לשטוף עבור 10-60 דקות כדי לנתק מורכב תרופה חייבת; IV) סוף סוף להזריק צעד שטיפה נוסף באמצעות פתרון חיץ לדקות 5-30 אחרת להתחדש פפטידים על פני השטח ולשחזר את אות קו הבסיס. תמיד להבטיח כי כל אותותיו נרכשים תחת קצב זרימת נוזל מתמיד של 30-180 μl / דקות ובטמפרטורה קבועה של 25 מעלות צלזיוס בקבינט בטמפרטורה מבוקרת.
את אותות כיפוף המוחלטים של כל שמונה cantilevers צריכים להיות במעקב באמצעות זמן סדרת multiplexed שיטת אלומה אופטית עם גלאי רגיש עמדה אחת.
כדי לנתח את אותות כיפוף מכל ריכוז של תרופה, את כפיפות דיפרנציאלי כתוצאה מכך הם הפכו לstres דיפרנציאליותים בין הצדדים העליונים והתחתונים של שלוחה באמצעות המשוואה של Stoney.

Representative Results

שינוי המתח נמדד באמצעות דיוק בקנה מידה ננו עם רגישות חסרת תקדים למחיקת H-אג"ח בודד, מנוצל כדי לעקוב אחר השיבושים ביומכניקה קיר תא חיידק מודל בזמן אמת (איורים 2 א, ד). המגבלה של רגישות גילוי סמים ולאן נחקרה על ידי דילול סדרה ריכוזיה בצעדים מ1,000 מיקרומטר ≤ 10 ננומטר, חושף 10 ננומטר (~ 15 ng / ml) כריכוז הנמוך ביותר לזיהוי והוליד ממוצע של ~ -9 ± 2 ננומטר כמו כיפוף אותות דיפרנציאליים (איור 2 ג). היכולת לזהות אנטיביוטיקה תחת הסביבה פיזיולוגית הייתה עוד יותר נחקר בסרום בטווח ריכוז רלוונטי קליני של 3-27 מיקרומטר ^17. על הזריקה של 7 מיקרומטר ואן בסרום (90% נסיוב עגל העוברי בתוספת 10% pH חיץ פוספט נתרן 7.4) על פני כל cantilevers בתנאים זהים, את אות ההפרש עבורDala בסרום היה 105 ± 4 ננומטר ואילו עבור cantilevers מצופה DLac, לא נצפה כיפוף (איור 3). את אותות כיפוף הניכרים שנצפו למצופה dala (vancomycin רגישה) cantilevers נגרמים על ידי יחסי גומלין מחייבים תרופה היעד החזקים. עם זאת למצופה DLac (vancomycin עמיד) cantilevers, הנוכחות של דחיית מצב קרקע של הזוג הבודד חמצן ואת קשר NH המופחת בכיס ^10,12 vancomycin המחייבת תורם להיחלשות של אינטראקציות מחייבות סמים היעד שהתוצאה פחות או כיפוף לא שלוחה, במיוחד לריכוזים נמוכים יותר vancomycin (איור 3). עם זאת, לריכוז גבוה וונקומיצין, אנו צופים אותות כיפוף מדידים לDLac. יתר על כן, עיצוב הניסיון שלנו הוא חשוב להתייחסות באתר שבו כל cantilevers מצופה שניהם dala וDLac חשוף בו זמנית לאותו אנליטי בזמן אמת.

כדי להבין את תפקידו המדויק של כימיה וגיאומטריה, תכננו ¹ מודל המתאר את הקשר בין אינטראקציות ממס משטח מכניקה. זה מייצר את מתח פני השטח:

משוואת 1 עבור p> מחשב ואפס אחר (1)

כהונתו הראשונה במשוואה (1) היא אנגמיור ספיחת Isotherm, והיווה אירועים מחייבים סמים היעד והקדנציה השנייה היא צורת שלטון החוק המתארת את ההשלכות מכאניות בקנה מידה גדולה של היווצרות רשת לחוץ. הקבועה מתאים למתח פני השטח מרבי כאשר כל אתרי הקישור הנגישים הם כבושים וK _D הוא חסרונות דיסוציאציה שיווי המשקל על פני השטחTANT על שלוחה. הניתוח כפי שמוצג באיור 4 הוא התוצאה של ההתאמה הגלובלית של משוואה (1) על גבי אותות מתח דיפרנציאלי מדודים חושפים; ~ 29.7 ± 1.0 או 14.1 ± 3.0 Mn / מ 'ו-K _ד ~ 1.0 ± 0.3 או 800 ± 310 מיקרומטר לפפטידים DLac D-עלא או, שבו מקביל מידה של משטח לחץ, כאשר כל אתרי הקישור הנגישים תפוסים. הרגישות המוגברת של שלוחה הייתה מכוונת על ידי שיטתי משתנה עמ צפיפויות פפטיד תוך ניטור נתוני הלחץ כפונקציה של p קבוע ואילו ריכוזי אנטיביוטיקה בגיל 10, 100, ו -250 מיקרומטר, בהתאמה (איור 5). התהליך חזר על עצמו עם מצבי לחץ כפונקציה של ריכוז ואן בזמן קבוע את צפיפויות פפטיד בעמ '~ 100%.

<IMG alt = "איור 1" עבור: תוכן-width = src "5IN" = "/ files/ftp_upload/50719/50719fig1.jpg" />
איור 1. גילוי שלוחה של אינטראקציות מחייבות משטח אנטיביוטי. ייצוג סכמטי) של מערך שלוחה חיישן והמצב שבו אינטראקציות סמים היעד מזוהות nanomechanically. ב) מחייבת אינטראקציה כימית בין מולקולת תרופה (ואן) והאנלוגי mucopeptide החיידקים (D-עלא או D-Lac). ג) המנגנון שבו מוטציה חיידקים רגישים Vancomycin (VSE) רוכש עמידות לוונקומיצין ידי מחיקת H-אג"ח בודד בכיס המחייב. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 2. מעקב אחר השיבושים ביומכניקה קיר תא חיידק המודל בזמן אמת. א) אותות כיפוף מוחלטים של cantilevers מצופה PEG בחיץ פוספט וונקומיצין 250 מיקרומטר D-עלא, D-Lac ו. את אותות התייחסות PEG דיפרנציאלי מוצגים בקווים שחורים. ב) אותות כיפוף הפרש של cantilevers מצופי D-Lac בחיץ פוספט וונקומיצין 250 מיקרומטר. ג) סטיית שלוחה ההפרש של אות תלויה במינון כפונקציה של זמן D-עלא ו בנוכחות ריכוזי vancomycin בבסדר הגודל של 10 ננומטר (קו צהוב), 100 ננומטר (קו אדום) ו -1,000 ננומטר (קו אדום כהה) בהתאמה. ד) אותות סטיית שלוחה ההפרש לשלושה חיישני שלוחה מצופי D-עלא כ פונקציה של זמן בנוכחות 10vancomycin ננומטר. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 3. מעקב של השיבושים ביומכניקה מודל חיידקי דופן התא בזמן אמת לcantilevers מצופי D-Lac בנוכחות vancomycin מיקרומטר 7 בסרום עוברי עגל D-עלא ו.

איור 4. חוקר את nanomechanics של אינטראקציות סמים היעד. מגרש מראה את תגובת לחץ משטח ההפרש הנמדדת עבור D-עלא (עיגולים שחורים) וcantilevers מצופה כפונקציה של ונקומיצין D-Lac (עיגולים אדומים)ריכוז בתמיסה [אן]. הנתונים שתוארו על ידי משוואה (1) (קווים מוצקים). ¹

איור 5. אופטימיזציה של רגישות זיהוי nanomechanical של קולטן ליגנד אינטראקציות על ידי חוקר את התלות של העמסת קולט וגיאומטריה באמצעות monolayers מעורבת. תגובות דחק משטח דיפרנציאלי המדודות של חיישני שלוחה כפונקציה של D-עלא פני השטח כיסוי, עמ 'בנוכחות ריכוזים קבועים בvancomycin פתרון ב10 מיקרומטר (קו שחור), 100 מיקרומטר (קו אדום), וכ -250 מיקרומטר (קו ירוק).

Discussion

תוצאות אלו מראות כי יש חיישני מערך שלוחה רגישות כדי לזהות ולכמת את שינויים באינטראקציות מחייבות סמים היעד במיוחד בהתנגדות vancomycin קשורה למחיקה של H-אג"ח אחת מהכיס המחייב של התרופה. אנחנו מראים רגישות זיהוי nanomolar של ואן בהסכם עם קודמים Surface Plasmon תהודה (SPR) ^18,19 לימודים, ומגלים כי שיטת שלוחה ישירות יכולה לזהות ולכמת את מולקולות תרופה בדם בריכוזים רלוונטיים קלינית כפי שהוחלה באופן שגרתי בפרקטיקה קלינית. הנתונים שלנו מראים כי פני השטח מתח ההפרש יכול להיות מתואר על ידי משוואת צורת מוצר (1), כלומר (i) מונח כימי המתאר את האירועים ספציפיים סמים יעד מחייב, וכן (ii) טווח גיאומטרי המתאר את הקישוריות בין מכאנית כימי הגיב פני אתרים, רומז כי אינטראקציות הכימיות המקומיות לנתק מהמכונאי הגלובליאינטראקציות al של שלוחה. בעוד המונח הכימי ניתן על ידי הקלסית אנגמיור ספיחת האיזותרמה, המונח הגיאומטרי חושף מנגנון percolative של שינויי מתח המשטח המושרה סמים היעד. מחשב הסף הקריטי ~ 10% (איור 5) היו דרושים כדי לאתר שלוחה ההפרש כיפוף, מראים כי פני השטח לחץ transduced קולקטיבי, כאשר כל חלק משטח גדול יחסית היא נכבשה על ידי מולקולות אנטיביוטיות. עבור p ≥ מחשב, הקישוריות בין מכאנית שינו כימי על פני השטח אתרים מוקם בהדרגה, ואת האינטראקציות קצרות הטווח הדוחים כגון אינטראקציות סטריות בין הצמתים של רשת nanomechanical מעוררת גובר כלפי מטה כיפוף של כל שלוחה. הוא העריך כי מודל חלחול nanomechanical עשוי לשחק תפקיד חשוב במצב האנטיביוטיקה glycopeptide פעולה בחיידקים אמיתיים. ממצאים אלה מדגישים את הרגישות הגבוהה של טכנולוגיה לשלוחה שלtudying המצב "אנטיביוטיקה של פעולה ולייצג את כלי מחקרי חדשני לחקר תרופות כדי לשפר את ההבנה של פעילותה של אנטיביוטיקה בקנה מידת ננו ליידע ולאפשר גילוי של תרופות רבי עוצמה כדי לשלוט בבעיות של זיהומי superbug. כדי להכין את מערכת שלוחה למדידות לשחזור ורגישות, יש לנו לטפל במערך של מטרות בפרוטוקול, ובמיוחד לטעינת מדגם בתא microfluidic ונהלי הפעלה סטנדרטית כדי לאפשר לתגליות nanomechanical כמותיים.

משמעות של טכנולוגית שלוחה ביחס לשיטות קיימות

לסיכום מציין כי בעוד טכנולוגיה זו הוצעה לפני יותר מ -25 שנים, היא לא מצאה את דרכה למרפאה בגלל חוסר מדידות מדוקדקות וחוזרות על עצמו על מטרות רפואיות הנוגעות בדבר. כאן אנו מדגימים את הנהלים שקובעים את הרלוונטיות של שימוש cantilevers nanomechanical לחקור מכונאיהשפעה של אנטיביוטיקה אל על יעדי קיר תא החיידק ולזהות התנגדות אנטיבקטריאלי. שיטות הקרנת סמים קונבנציונליות דורשות איזה סוג של תיוג פלורסנט או רדיואקטיבי של מולקולת כתב למדוד את הכריכה של אנליטי ליעד שלו, לעתים קרובות בקשר עם assay מחייב תחרותי או אנזימטי ומבחני חלבון ^20. התיוג של מולקולות ביולוגיות הוא לא רק זמן רב ויקר, אבל התווית יכולה גם להפריע לאינטראקציה המולקולרית על ידי הפרעה לאתר הקישור, מה שמוביל לתוצאות שליליות כוזבות. בנוסף, תרכובות ניאון הן לעתים קרובות הידרופובי אשר יכול להוביל לתוצאות חיוביות מחייב ושקר רקע. בשל מגבלות אלה, קיים עניין גובר בטכניקות ללא תווית חדשות המאפשרות כמעט לכל קומפלקס מולקולרי שיוקרנו בפיתוח assay מינימאלי. משטח טכנולוגיות נטולות תווית הוותיקות ביותר כיום הן SPR וקוורץ קריסטל microbalance (QCM). בניגוד לSPR כי מדד הקבוע דיאלקטרי דואר, תווית - טכנולוגית שלוחה החופשית מזהה את מתח פני השטח שנוצר על ידי אינטראקציה יגנד קולטן, שיכול למדוד ישירות את כוחות nanomechanical שנוצרו על ידי הקשירה הספציפית של ligands לקולטנים על פני. הייחוד של החיישנים האלה הוא שהרגישות שלהם אינה מסתמכת על מאפיינים דיאלקטרי הנגרמים על ידי שינוי המסה בשל אנליטי מחייב כמו בSPR וקרן התאגידית אלא על שינוי מושרה זעיר במשטח לחץ במטוס, מה שהופך את הטכנולוגיה מתאימה באופן ייחודי ללימודים את nanomechanics של מולקולות תרופה בריכוזים אנטיביוטיקה רלוונטיים קליני (3-27 מיקרומטר) ^17. Cantilevers גם מתאים במיוחד גם למולקולה קטנה (כגון שברי DNA ותרופות) זיהוי בתנאים פיסיולוגיים, כולל סביבות מורכבות אשר היא במידה רבה הבסיס לתעשיית תרופות ולכן ישמשו ככלי משלים בגילוי תרופות. טכנולוגיית שלוחה יושמה בהצלחה בתחומי ^3,5 הגנומיקה, גז חישה ^{21, 22,} proteomics ותרופות ^1. יתר על כן, cantilevers מיוצרים באמצעות טכנולוגיית הסיליקון עלות נמוכה ובשל התאימות שלהם עם תהליכי microfabrication, ניתן מיניאטורי cantilevers לרגישות משופרת ועמות למערכים גדולים של חיישנים להקרנה מתחם סמים מרובים ומבחני מיון עשירים במידע גבוה יותר תפוקה. שיפורים של המכשור ותכנון ניסוי יאפשר מגוון רחב של אינטראקציות להיות מנותחים בזמן אמת כדי לעזור לקדם את החיפוש אחר דור חדש של superdrugs כדי להתמודד עם הבעיות של multidrug זיהומים עמידים.

צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול

הפיתוח של פרוטוקולי מדידה חזקים הוא מרכזי ליישומים של טכנולוגיה זו. כדי להשיג מדידות סמים היעד כמותי משביעות רצון וכדי לקבוע את הריכוז הנמוך ביותר של אנטיביוטיקה לאהכובע יכול להיות מזוהה במאגר או דם צעדי סרום, קריטיים בתוך הפרוטוקול טופלו. המשימה הראשונה כרוכה בכוונון ואופטימיזציה של תהליכים כימיים על פני השטח ללכוד כדי לשפר את הספציפיות איתור שלוחה וברגישות. ללא ספק, התמרה מתח פני השטח היא תופעה קולקטיבית, הדורש שבריר גדול יחסית של פני השטח כדי להיות מכוסות כדי ליצור קישוריות בין אזורי תגובה כימית. אנו מראים כי על ידי שינוי הצפיפות של פני שטח פפטידים הבסיסיים, סף קריטי ~ p ≥ 10%, שבו נקבע קנה המידה מתח פני השטח כפונקציה של צפיפות פפטיד ואפס אחר (איור 5). חשוב שהניסויים נועדו לחקור את האחידות של מתח לאורך cantilevers כדי להבטיח deflections האות המרבי למדידות רגישות. בנוסף, פרוטוקולי התחדשות משטח יעילים צריכים להיות במקום, ובכך מאפשרים מדידות מחזור מרובות וכדי להפחית את העלויות עבור כל tesלא. בעוד בעיצוב פני השטח באמצעות קולט הסוף הידרופובי thiolated, נטייה של מולקולת הקולטן והמרווח ביניהם היא חיונית כדי לאפשר להרכבה עצמית של אריזה צפופה בשל אינטראקציות ואן דר--אלס בין המולקולות כדי למזער את האינטראקציות ספציפיות. יתר על כן, את המולקולות ללכוד אמורות להכיל פוליאתילן גליקול (PEG) מקשר, כדי לאפשר לחלק מסוים של מטריצת החישה להיות הידרופילי כדי למנוע כניסה של מולקולות בפתרון אנליטי מלהגיב ישירות עם משטח הזהב ללא ציפוי. מולקולות מקשר PEG חייבת לפעול כמפרידים להפחית אילוצים סטריים ולכן מאפשרים את analytes הפתרון לאינטראקציה ספציפי עם קולטנים על פני כדי לגרום שינוי מתח משטח measureable. חיישן מערך שלוחה חייב להיות assayed עם לפחות במדידת התייחסות באתרו והאות מוצגת בזמן אמת היא סטיית ההפרש, שהושג על ידי הפחתת הסטייה המוחלטת של שלוחה מההתייחסות שלensing cantilevers. לפיכך שלוחה התייחסות היא חיונית כדי להסביר את אינטראקציות ספציפיות כגון שינויי טמפרטורה, שינויים במדד או אינטראקציות על החלק התחתון של שלוחה nonfunctionalized שבירה. אופטימיזציה של קצב הזרימה (~ 30-150 μl / min) מהווה שלב קריטי בפרוטוקול כי זה מבטיח חילופי יעיל של נוזלים ותחבורה המונית יציבה מספקת של חומרי פתרון. העיצוב של תא נוזל חייב לאפשר נפח אופטימלי (5-80 μl) לספיקות מהירות כדי לאפשר חילופי נוזל מושלמים כדי להתגבר על מגבלות תחבורה המוניות. קצב הזרימה הוא קריטי במיוחד בעת ביצוע מדידות הקינטית ^23. תאים נוזלי נפח גדול דורשים ספיקה גבוהה בלתי נשלטת שמובילות לדרישות נפח דגימה גדולות, שלא לצורך מגדילה את המחיר של assay. בעבר השתמשנו זרימה הכבידה להזריק מדגמים שונים לתוך תא נוזל המדידה. יש זרימה הכבידה את היתרון שזה האיילהזה לא דורש שום חלקים מכאניים ולכן אינו מציג את רעש נוסף למערכת. עם זאת, החסרון המשמעותי שלו הוא שזה עובד רק באופן מהימן ספיקות גבוהות יחסית (~ 200 μl / min). ברור, קצב זרימה נמוך יותר (≤ μl / 1 דקות) ידרוש מדגם כרכים מוגבלים ליחידה זמן, אבל מצד השני זה גורם לתגובות איטיות יותר ולכן דורש עוד פעמים ליצירת קשר. יתר על כן, יש זרימה הכבידה שונות גדולות ובקצב הזרימה שלו כפי שהוא תלוי על הבדלי הגובה בין הכניסה והיציאה, שיורדת ככל שהפתרונים לדוגמא שנצרכים במהלך הניסוי. כדי להימנע מבעיות תזרים הכבידה, יש להשתמש במשאבת מזרק. היתרון של שימוש במשאבת מזרק הוא שהיא מאפשרת קצב זרימה קבוע לאורך תקופה ארוכה של זמן ומאפשר הניסויים להתממש בסביבה מבוקרת יותר.

מגבלות של הפרוטוקול

האתגר העיקרי בהשגת לשעתקזיהוי ביולוגי ספציפי ד באמצעות חיישני שלוחה טמון בהבטחת שאת המאפיינים של שכבת קולט הם ביוכימית "פעילים" ואחידים לכל assay. סוד הצלחה הוא בניסוי מקדים מדוקדקת של שבב החיישן עם ניקוי סטנדרטי ופרוטוקול immobilization עם chemistries מקשר כדי לכוון את מולקולות הקולטן בקונפורמציה הפעילה שלהם. בהגדרה הנוכחית שלנו, אנו functionalize מערכי שלוחה באמצעות זכוכית נימים קטנות, שיכול להיות נושא למספר חסרונות, ויכול להיות בעייתי במקרים מסוימים. זכוכית נימים אלה הן פתוחות בשני קצותיו, ולכן הממסים המדגם יכולים להתאדות בקלות. לדוגמה, אם הטמפרטורה של שלב functionalization אינה נשלט באופן מדויק, שיעור האידוי יכול להשתנות באופן משמעותי בזמנים שונים ובמיוחד בעת שימוש בממסים נדיפים כמו אתנול. יש גם אפשרות של שינוי קל בזמן הדגירה משלוחה אחת לאחרת גרםIven שיש נוזלי החישה להיות טעונים ברציפות אל תוך הנימים. הגורם המגביל האחר בfunctionalization נימים הוא חוסר היכולת להבטיח כי cantilevers תמיד מוכנסים לתוך נימי הדם באותו אופן בדיוק. בנוסף, לפעמים cantilevers צריך להיות שלף מעט מנימי הדם על מנת למנוע זיהום צולב כמו הדגימות נוזליות יכולות לזרום על גוף השבב. אנחנו יכולים לפתור את הבעיות הללו על ידי העסקת תצפיתני הזרקת דיו כהליך ציפוי פני השטח חלופי לcantilevers מעיל. למרות שזה היה מאפשר שליטה המדויקת של ציפוי מדגם עם האפשרות לדרוגה עד למערכים גדולים, החסרון הנפוץ ביותר הוא שהטיפין הקטנות שמופקדות על cantilevers יכולות להתאדות תוך שניות ודורש סביבת לחות מבוקרת. לכן, לא יכול להיות מותאם בקלות זמן הדגירה, אשר עשוי להיות רצוי עבור יישומים מסוימים. הגומלין העדין של הגורמים כגון מדגם VOlume, זמן דגירה ושיעור אידוי יש השפעה ישירה על החשיפה של cantilevers למדגם functionalization ויש להקפיד על מנת להבטיח chemistries משטח המותאם במיוחד למבחנים כשלוחה לכל שינוי קטן בצפיפות המולקולרית קולט יהיה השפעה גדולה על שלוחה תגובה.

שינויי עיצוב ניסיוני (כלומר טכניקות חלופיות או חומרים)

כדי להתגבר על האתגר הגדול בקבלת הליך ציפוי לשעתק לפיתוח העתידי של טכנולוגית שלוחה, אסטרטגיות שונות נדרשות שהייתי משתמשת cantilevers משולב בערוצי microfluidic. הרעיון הוא ששבבי שלוחה מיוחדים צריכים להיות מתוכננים כך שכל שלוחה היא להציב לתוך ערוץ משלה באינטרנט, כדי לאפשר בהליכי functionalization באתר שבו ערוצי מטופלות בנפרד. שינויי עיצוב ניסיוניים אלו יאפשר תהליך ציפוי יש לבצעאד בסביבה מבוקרת וסגורה שבו החשיפה לממס היא פיקוח דווקא על ידי זמן הדגירה וקצב זרימה לקיבוע אוטומטי של מולקולות ללכוד על שבבי שלוחה. את אותם ערוצים ואז יוכל לשמש עבור הניסויים מחייבים בפועל שבו כל cantilevers עלול להיחשף לאותו הפתרון אנליטי. חוץ מהליך functionalization שלוחה, מנגנון readout שלוחה הייתי גם צריך שיפור. שיטת סטיית קרן האור האופטית היא רגישה מאוד ונעשה בו שימוש בהצלחה בטכנולוגיה מיקרוסקופית כוח אטומי (AFM) במשך שנים רבות. עם זאת, עבור יישומי חיישן שלוחה עמד החופשיים יש את ההודעה האופטית כמה חסרונות, למשל הוא אינו מאפשר מדידות בנוזלים אטומים כגון דם, היישור של מערך של לייזרים יכול להיות זמן רב ומייגע והתצורה הנוכחית לא יכולה להבדיל בין deflections הטיה והאנכי. כך הפיתוח העתידי של cantilevאה הטכנולוגיה תצטרך לשקול היבטים של עיצוב החיישן הכללי (גיאומטריות שלוחה למשל) ואת ההודעה לשלוחת פרוטוקולי מדידה חזק גם בשדות וסביבות מעבדה. Manalis ועמיתים לעבודה ²² פיתחו סוגים חדשים של חיישני שלוחה חלולים שבו יש להם את cantilevers מוטבע בתוך ערוץ microfluidic הקורה, ומאפשרים למכשיר להיות פעל בחלל ריק עם גורמים באיכות גבוהה. במצב זה, cantilevers לפעול כmicrobalance ^22, ולכן זה כבר לא צורך יש סימטריה בין שני הצדדים ביחס לfunctionalization, ובכך ניתן physisorbed המולקולות ללכוד או קוולנטית מחוברות ישירות על סיליקון, בדרך כלל באמצעות טילים נ"מ או Silanes ^24. יכול גם להיות שונה cantilevers עם שכבת פולימר דקיקה שלאחר מכן מוצמד לנוגדנים ²⁵ לחישה ביוכימיים.

פתרון בעיות

פרו משותףblem קשור עם מדידות שלוחה הוא המבוא של בועות אוויר לתוך תא זרימת microfluidic. יש להקפיד על מנת להבטיח כי אין בועות אוויר מוכנסות לתא הנוזל בעת הרכבה השבב. אות הנסחפת הוא גם בעיה נפוצה אחרת הנגרמת על ידי ההבדלים בטמפרטורה של דגימות. את cantilevers חייב להיות equilibrated לייצב לפני מדידות מתבצעות. כל המאגרים, analytes ופתרונות התחדשות חייבים להיות מאוחסנים באותו החדר כמכשיר שלוחה לאפשר לכל פתרונות יש את אותה טמפרטורה. למרות שמשאבת המזרק יכולה לספק ספיקות מאוד מדויקות ומאוד נמוכות, זה מזוהה בדרך כלל עם רעש מכאני במדידות שלוחה. לכן חשוב לתכנן מפחית רעש פשוט ויעיל, כדי למנוע רעש מיותר באותות הסטייה. מפחית הרעש מורכב ממאגר הנוזל קטן הממוקם בין משאבת המזרק ונוזל התא, אשר סופג לאהוא רעש מכאני מהמשאבה. בגלל האופי רגיש של גלאי אופטיים, מערכת מדידת שלוחה אידיאלית צריכה להיות מופעלת בהתקנה המצורפת כדי לחסום את כל אורות תועים מלהתערב במערכת readout האופטית. בנוסף, את האיכות של שכבות החישה יכולה להקטין באופן משמעותי, אם מספר גדול של שלבי כביסה מבוצע על cantilevers מגביל את חייו של שבב החיישן.

יישומים אלטרנטיביים או בעתיד לאחר שליטה בטכניקה זו

Cantilevers מצופה טילים נ"מ המסתיימים באמינו או carboxyl קבוצה יכול לשמש כחיישני pH. קבוצות הקצה הפונקציונליות protonate או deprotonate בהתאם-pH של התמיסה ויכולות ליצור משטח טעינה שמובילה שלוחה לכופף ^24. בהתחשב בכך שחיישני שלוחה יכולים לעקוב אחר אינטראקציות סמים הקשורים ליעד היציבות של דופן התא של חיידקי חיים ^1,6,7, הם כן יעזרו בהחיפוש ולפיתוחו של דור החדש של אנטיביוטיקה כדי להילחם בזיהומים עמידים לתרופות. בcantilevers העתיד הייתי לשמש כMicrobalances למדוד את המסה ושיעורי צמיחה של תאים בודדים ^26. טכנולוגיית שלוחה תוכיח מועילה למחקר של תגובות תאיות לגורמי גדילה שונים או תרופות. זה יהיה גם להציע כלי חדשני לזיהוי מהיר של סמנים ביולוגיים מרובים, שבו יש רלוונטיות מיידי ביישומים רפואיים ונקודה של טיפול. בהתחשב צדדיות, הגודל קטן, ואת החוסן של חיישני שלוחה, הם יהיו בצורת מסך רגיש לגורמים סביבתיים מזיקים. הם כבר הוכיחו את רגישותם באיתור גזים רעילים ומזיקים שיכול לברוח מהמעבדה ויחידות ייצור תעשייתי לסביבה, כגון חומצה הידרופלואורית ²⁷ או ²⁸ מימן ציאניד.

Disclosures

אין ניגודי אינטרסים מוצהר

Acknowledgments

ג'וזף וו Ndieyira נתמכה על ידי הנדסת מדעים הפיזיקליים מועצה למחקר (EPRSC), מרכז למחקר רב תחומי בננוטכנולוגיה (IRC), חברה המלכותית (RS) וייעוץ ביאנו (BNC). אנו מודים, אלחנדרה Donoso Barrera, Dejian ג'ואו, מנואל Vögtli, מתיו באצ'לור, מתיו א קופר, טורסטן Strunz, טרבור Rayment וגבריאל Aeppli לדיונים מועילים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Scentris		Scentris, Veeco Instruments, Inc	Not in production
Six-way valve		MVP, Hamilton, Reno, NV	Enables multiple concentration injection
EB Evaporator		BOC Edwards Auto 500, UK	Electron beam is preferable because of deformation of cantilevers caused by thermal heating problems
Storage vessel		Agar Scientific, UK	Keeps gold coated films fresh
Glass capillary		King Precision Glass, Claremont, CA, USA	For capillary functionalization of the cantilever arrays
Pump		Model Genie Plus, Kent Scientific, Torrington, CT, USA	Good for controlled flow rate of liquid samples in microfluidic channels
0.2-4.5 μm Filters	1511940001	Merck Millipore	For sample filtering
Cantilever chips		London Centre for Nanotechnology (LCN)	Highly sensitive
Sodium phosphate monobasic	10049-21-5	Sigma-Aldrich, UK	For making buffer solutions
Sodium phosphate dibasic	7558-79-4	Sigma-Aldrich, UK	For making buffer solutions
Polysorbate 80 (PS80) or Tween 80	9005-65-6	Sigma-Aldrich, UK	Used in buffer solutions to prevent nonspecific interactions on glassware
DI water		Millipore Co., Billerica, MA, USA	Used for making solutions
Whole serum	GEM-700-110-H	Sera Laboratories International Ltd, UK	Used in measurements that mimic physiological conditions
Vancomycin (Van)	1404-93-9	Sigma-Aldrich, UK	Drug used
Sulfuric acid	7664-93-9	Sigma-Aldrich, UK	Used for glassware cleaning procedures
Hydrogen peroxide	7722-84-1	Sigma-Aldrich, UK	Used for glassware cleaning procedures
D-Ala and D-Lac		London Centre for Nanotechnology (LCN)	Surface receptors coated on the cantilever for detecting drug-target interactions
LabView		National Instruments Co., Austin, TX, USA	Software used for instrumental interface to allow controlled measurements