Nanomechanics av ​​Drug-target Interaksjoner og antibakteriell resistens Detection

Summary

Ervervet resistens mot antibiotika er et stort offentlig helsevesen problem og er i dag rangert av WHO som en av de største trusler mot menneskers liv. Her beskriver vi bruken av cantilever-teknologi for å kvantifisere antibakteriell resistens, kritisk for oppdagelsen av nye og kraftige midler mot multimedikament resistente bakterier.

Abstract

Den frittbærende sensor, som fungerer som en transduser av reaksjoner mellom modell bakterielle cellevegg matrise immobilisert på dens overflate og antibiotika medikamenter i oppløsning, har vist betydelig potensial i biokjemiske sensing programmer med enestående sensitivitet og spesifisitet ^1-5. De narkotika-target interaksjoner generere overflaten stress, forårsaker cantilever å bøye, og signalet kan analyseres optisk når den er opplyst av en laser. Endringen i overflaten stresset målt med nano-skala presisjon gjør forstyrrelser av biomekanikk av modell bakteriell cellevegg mål å spores i sanntid. Selv om den gir betydelige fordeler, har flere cantilever sensor arrays aldri blitt brukt i kvantifisere narkotika-target binding interaksjoner.

Her rapporterer vi om bruken av silisium flere cantilever arrays belagt med alkanethiol selvkonfeksjonerte monolayers etterligne bakteriell cellevegg matrise til kvantitativt study antibiotika binding interaksjoner. For å forstå effekten av vancomycin på mekanikken av bakterielle cellevegg strukturer ^1,6,7. Vi har utviklet en ny modell ¹ som foreslår at cantilever bøying kan beskrives ved to uavhengige faktorer, i), nemlig en kjemisk faktor, som er gitt ved en klassisk adsorpsjon Langmuir isotermen, hvorfra vi beregner den termodynamiske likevekts-dissosiasjons-konstant (K _d) og ii) en geometrisk faktor, i alt vesentlig et mål på hvor bakterielle peptid reseptorer er fordelt på den frittbærende flate. Overflaten fordeling av peptid reseptorer (p) blir brukt til å undersøke avhengigheten av geometri og ligand lasting. Det er vist at en terskelverdi P ~ 10% er kritisk for sensing programmer. Under der er det ingen påviselig bøyningssignal mens over denne verdien, øker bøyningssignal nesten lineært, avslører at stress er et produkt av en lokal kjemisk binding factor og en geometrisk faktor kombinert med mekanisk tilkobling av reagerte regioner og gir et nytt paradigme for design av kraftige midler for å bekjempe supervirus infeksjoner.

Introduction

De molekylære anerkjennelse paradigme underbygger store deler av biologi og medisin. I farmakologi, for eksempel målet er å forstyrre en patologisk sti ved å målrette en sentral deltaker i en biokjemisk prosess som transglycoslyation eller transpeptidation som katalyserer tverrbindingen av bakterielle cellevegg peptider. Stoffet design er derfor redusert til å definere en passende molekyl å målrette en bestemt bakteriell docking området for å indusere en perfekt passform. Et klassisk eksempel emulere suksessen med denne tilnærmingen er vancomycin (Van), som retter seg mot den peptidoglycan celleveggen, en konservert strukturelt trekk ved en bakterie. I en begynnende grampositiv bakterie, består peptidoglykanet matrise av peptider som ender i de sekvens Lysin-D-alanin-D-alanin, tjoret via en C55 lipid linkergrupper ^8-10 her betegnet D-Ala. Disse utsatte peptider på peptidoglycan forløpere er grunnleggende formekanisk beskyttelse av de bakterielle celler mot harde miljøkrefter, og viktigere, er ikke funnet i humane celler, noe som gjør dem til ideelle mål for antibiotika medikamenter. Van bindes spesifikt til C-terminalen av de bakterielle cellevegg-peptider danner en moderat sterk Van-peptid sammensatt som vist i figur 1.. Dette samspillet mellom Van og utsatte peptider blokkerer handlingene til transpeptidases og transglycosylases, som katalyserer cross-linking av celleveggene ^1, effektivt stoppe dem fra fornetning og derfor nanomechanically svekker bakteriecellen fører til døden sin ved brudd ^{1,6, 7.}

Fremveksten av vancomycin-resistent Enterococcus (VRE) er et økende helseproblem ¹¹ og fordi Resistensen i enterokokker oppstår på grunn av liten endring av et amid linKage til en ester ⁸ sammenhengen, denne utrolig enkle strukturelle endringer på overflaten av bakterien sletter en enkelt hydrogen obligasjon fra Van 's docking nettsted med påfølgende endring av bindende lomme. Viktigere denne prosessen endrer pentapeptid terminal alanin er tilstede i vankomycin mottakelige Enterococcus (VSE) til et lysin-D-alanin-D-laktat ^10,12, her betegnet D-Lac, noe som gir en betydelig reduksjon i Van-D-Lac bindingsaffinitet ved tre størrelsesordener rendering Van terapeutisk ineffektive mot Enterokokkinfeksjoner ^1, Den alarmerende vekst av antibiotikaresistente bakterier er derfor driver utviklingen av innovative tilnærminger til å akselerere og gjenopprette den antibakterielle aktiviteten av antibakterielle midler eller oppdagelsen av flere kraftige legemidler mot multiresistensproteiner bakteriell infeksjoner.

in situ henvisning til differensiell måling som tillater dem å detektere spesifikt medikament-target interaksjoner og, i kraft av deres fabrikasjon via standard halvlederoppgavekjøring ruter, de er mottagelig for masseproduksjon og parallellisering for high-throughput screening av flere tusen av medikamenter i timen. I particUlar flere cantilever sensor arrays er nyttige verktøy for å studere antibiotikaresistens til vancomycin - fordi motstand mot vancomycin er egentlig et mekanisk problem ^1,6,7. Reaksjonene mellom en modell bakterielle cellevegg målet og Van i oppløsning kan detekteres ved å overvåke endringer i de klinisk relevante stress forårsaket av medikament-target bindende vekselvirkninger. Den genererte stress fra overflaten reaksjoner som manifesterer seg i en cantilever bøyningssignal analyseres optisk ved å belyse hvilke sensorer med en laserstråle. Videre ved å skreddersy den mottakelige belegg av bakterielle overflate målmolekylene på toppen av cantilever sensor, i nærheten av et ubegrenset antall analytter (Van), de spesifikke biokjemiske interaksjoner og biomekanikk av modell bakteriell cellevegg matrise overvåkes i sanntid. Bortsett fra den molekylære anerkjennelse arrangementet, er det flere faktorer som kan føre cantilever sensorer for å deflect, som omfatter - temperatursvingninger, uspesifikke binding eller endringer i brytningsindeksen av løsningen. For å veie opp for uspesifikke signaler, in situ differensialmålinger utføres der bøying av både måle-og referanse cantilevers er kontinuerlig overvåket for å analysere spesifikke interaksjoner. Videre kan deteksjon ømfintlighet overfor uthengende sensorer som er avhengig av overflate-kjemi og geometri bli forbedret ved å justere overflaten tetthet p (hvor p er definert som forholdet mellom arealet okkupert ved å ta opp molekyler til hele toppen overflateareal av cantilever omfattet av den totale befolkningen av molekyler som bestemmes av X-ray fotoelektron spektroskopi (XPS) ^1.

Her Denne protokollen detaljer hvordan vancomycin eller annen antibiotika binding til bakterielle cellevegg forløper analoger (mucopeptides) ved klinisk relevante konsentrasjoner i bufret løsning ennd blod serum kan påvises ved hjelp label-free cantilever teknologi. Ferske gull flater brukes fordi selvkonfeksjonerte monolayers (SAMs) har en tendens til lett danne stabile lag på rent gull ^13,14. SAMs vanligvis består av korte molekyler med en tiol-enheten kovalent bundet ved gull-overflaten mens det ønskede fange enheten på den andre enden er fritt tillates å interagere med analytten mål i løsning. Tioler er et fleksibelt system spesielt fordi mange tiolforbindelser med forskjellige kjemiske endegrupper er kommersielt tilgjengelige eller kan lett syntetiseres i laboratoriet. Imidlertid bør man være forsiktig for å sikre at molekyler med en tiolgruppen må ha riktige endegrupper, for eksempel i et protein eller peptid konjugering, bør aminogruppen vender inn for reaksjonen med karboksyl-gruppen av tiolgruppen tjoret på overflaten for å forekomme. Her var tiol direkte konjugert med tripeptidanaloger mimetics av ​​bakteriell lipid II fra bacterial cellevegg målene syntetisert ved fast-fase-metoden ved hjelp av kommersielt tilgjengelig forhåndslagret Wang-D-Ala og Wang-D-Lac harpikser og standard Fmoc-beskyttende gruppe kjemi ^15.. Selv om denne beskrivelsen er fokusert til vancomycin, klart det kan bli utvidet til andre antibiotika og faktisk videre studier er invitert av forskere fra ulike felt særlig i biokjemi, farmakologi, og materialvitenskap for enkelt å ta i bruk denne protokollen for sine egne eksperimenter.

Protocol

En. Utarbeidelse av cantilevers

1. Ved hjelp av Teflon pinsett fordype valgt antall cantilever chips (hver cantilever måler 500 mikrometer lange, 100 mikrometer brede og 0,9 mikrometer tykke) til en nylaget piraja løsning (ved 1:1 H ₂ SO ₄ og H ₂ O ₂₎ i 20 min .
2. Etter ca 20 min fjerne cantilever chips fra piraja løsning og skyll dem grundig med avionisert vann og umiddelbart overføre til en nylaget piraja løsning. Gjenta trinn 1.1 ovenfor hvis chips inneholder flekker av smuss ellers fortsette til neste trinn.
3. Etter en grundig rengjøring i avionisert vann, skyll med ren etanol og tørkes cantilever chips på en varmeplate ved 75 ° C for å fjerne ethvert spor av vann. Inspisere dem ved hjelp av et optisk mikroskop for å bekrefte deres renslighet.
4. Overfør de rensede cantilever chipsene til en fordampningskammeret og pumpe ned, rettet mot å oppnå et vakuumtrykk på 10 mbar ^-7.
5. Så snart det nødvendige vakuum er oppnådd, belegge en side av hvert cantilever matrise med et 2 nm titan først å fungerer som et vedheft lag før et ekstra lag med 20 nm gull tykk. For å bekrefte deres tykkelse, bruker kvartskrystall monitor plassert rett over målet kilde.
6. La gull belagt cantilever sensorbrikker i kammeret i 1-2 timer for å avkjøle under vakuum før åpning.
7. Overfør fersk inndampet chips til et vakuum lagringsbeholder fylt med argon for å hindre enhver form av forurensninger.

2. Cantilever Chip Funksjonalisering

1. Først ordne mikro-kapillarrør på en funksjonalisering trinn ² i henhold til den frittbærende tonehøyde størrelse på 250 ym.
2. Deretter injiserer 2 mM etanoliske oppløsninger av overflate-tiol målmolekyler, dvs. bakterielle mucopeptides (D-Ala og D-Lac), og en 'inert 'alkanethiol ender i trietylenglykol (PEG) kjent for å motstå biomolekylære adsorpsjon. ^16. Hver av de kapillære slangene bør inneholde et assortert overflate fangst molekyler bestemmes tilfeldig for å unngå bruker bias.
3. Neste inkuberes i 20 min de cantilevers i microcapillaries fylt med tiol løsninger som inneholder overflaten fange molekyler. Sikre at løsningene av overflaten fange molekyler er begrenset til enkelte cantilever sensor for å unngå eller minimere kryss-forurensing. Hvis denne prosessen er ansatt riktig, bør det systematisk endre nylagde gull belagt cantilevers i kjemisk aktive sensorer dannet ved at SAMs av bakterielle mucopeptide mål å danne på gull lakkerte overflater som reseptorer.

3. Løsning Forberedelser

1. Løs opp 0,1 M mono-og di-grunnleggende natrium fosfat salter i ultrarent vann (18,2 MΩ · cm resistivitet) og bland to gi en pH-verdi på 7,4.
2. Legg 0,002% av PS80 til bufret løsninger for å minimere aggregering effekter forårsaket av uspesifikke interaksjoner av stoffet molekyler til glass.
3. Fortynne legemidler med fersk bufret løsninger på de ønskede ulike konsentrasjoner som gjør at beregning av K _d.
4. Filtrere nylagde stoff løsninger ved hjelp av 0,2 mikrometer filter og sonicate i 5 min ved romtemperatur før sletting med argon.
5. Gjenta fremgangsmåten med medikamentet i bufret serum ved hjelp av hel serum. Forsiktig vortex i 15 min med ytterligere 5 min å sikre fullstendig løseligheten.

4. Surface Stress Detection

1. Legg en funksjonalisert cantilever sensor chip i en væske flyt celle kammer.
2. Juster laserpunktet på den frie ende av hver sensor og bekrefte justeringen ved å varme opp det flytende kammer for en ° C. Alle åtte gull belagt cantilever sensor arrays bør gjennomgå omfattendessive nedadgående bøyning på grunn av bimetall effekt forårsaket av forskjellene i ekspansjonshastigheter av silisium og gull.
3. Etter oppvarming i ca 10 min, la cantilevers avkjøles i ytterligere 10 min.
4. Beregn bøying variasjon på maksimalt bøying signaler mellom individuelle cantilever sensorer og hvis det relative standardavviket til bøying signaler er ≤ 5% deretter godta justeringen som ønskelig ellers gjenta prosessen.
5. Deretter måle resonans frekvenser i alle åtte cantilevers å beregne sine våren konstanter. Hvis variasjonen av fjærkonstant mellom hver utkraging sensor innenfor en brikke er ≤ 1% så godta brikken som har ensartede mekaniske egenskaper på annen måte erstatte den frittbærende chip sensor.
6. Deretter bruker en fluidteknisk system (modell Genie Plus) via en seks-veis ventil for å oppnå den flytende utveksling innenfor strømningscellen mens datainnsamling bør oppnås ved hjelp av en automatisert så LabViewftware.
7. Å overvåke cantilever bøying data, bruk følgende måleprotokollene: i) injisere enten buffer løsning eller serum uten stoffet for kontrollmåling som varer i 5-30 min å etablere en baseline, ii) injiserer narkotika løsning for 30-60 min, iii) injisere 10 mM HCl vask for 10-60 min for å dissosiere komplekset bundet medikament, iv) til slutt injiseres et ytterligere vasketrinn med buffer-oppløsning for en annen 5-30 minutter for å regenerere overflaten peptider, og for å gjenopprette den opprinnelige signal. Alltid sørge for at alle signaler er ervervet under konstant væske strømningshastighet på 30-180 mL / min og ved fast temperatur på 25 ° C i et temperaturkontrollert kabinett.
8. De absolutte bøying signaler av alle åtte utkraginger skal overvåkes ved hjelp av seriemessig multiplekset optisk stråle-metoden med en enkelt posisjonssensitiv detektor.
9. Å analysere bøying signaler fra hver konsentrasjon av stoffet, er de resulterende differensial bendings omgjort til en differensial stress mellom de øvre og nedre sider av den frittbærende ved hjelp Stoneys ligning.

Representative Results

Stress endring målt med nano-skala presisjon med enestående følsomhet for en enkelt H-bindingen sletting, er utnyttet til å spore forstyrrelser av modell bakterielle cellevegg biomekanikk i sanntid (figur 2a-d). Grensen for medikament deteksjonsfølsomheten for Van ble undersøkt ved seriefortynne dets konsentrasjon i trinn fra 1,000 uM til 10 nM ≤, avslører 10 nM (~ 15 ng / ml) som den lavest påvisbare konsentrasjon som gir opphav til et gjennomsnitt på ~ -9 ± 2 nm som de differensielle bøying signaler (figur 2c). Evnen til å oppdage antibiotika under fysiologiske miljø ble undersøkt videre i serum ved en klinisk relevant konsentrasjonsområde av 3-27 mikrometer ^17. Ved injeksjon av 7 uM Van i serum (90% kalvefosterserum pluss 10% natriumfosfatbuffer, pH 7,4) på tvers av alle cantilevers under identiske forhold, det annet signal forDala i serum var 105 ± 4 nm mens for DLac belagte cantilevers ble ingen bøying observert (figur 3). De betydelige bøying signaler observert for Dala belagt (vancomycin utsatt) cantilevers er forårsaket av sterke medikament-target binding interaksjoner. Men for DLac belagt (vancomycin resistente) cantilevers, tilstedeværelse av bakken-state frastøting av oksygen lone pair og den reduserte NH obligasjon i vancomycin bindende lomme ^10,12 bidrar til svekkelsen av narkotika-target binding interaksjoner som resulterer i mindre eller ingen cantilever bøying, spesielt for lavere vankomycin konsentrasjoner (figur 3). Men for høy vancomycin konsentrasjon, ser vi målbare bøying signaler for DLac. Videre er vår eksperimentell design viktig for in situ referering hvor alt cantilevers belagt med både dala og DLac samtidig er utsatt til samme analytt i sanntid.

For å forstå den nøyaktige rolle i kjemi og geometri, har vi designet en modell ^en som beskriver sammenhengen mellom løsemiddel interaksjoner og overflate mekanikere. Dette frembringer på overflaten stress:

for p> pc og null ellers (1)

Det første leddet i ligning (1) er Langmuir Adsorption Isoterm, sto for narkotika-target bindende hendelser og det andre leddet er kraften loven skjema som beskriver de store mekaniske konsekvenser av stresset nettverk formasjon. Den konstante et tilsvarer maksimal overflatetemperatur stress når alle tilgjengelige bindende områder er okkupert og K _d er overflaten likevekt dissosiasjon consDette kan være viktig på cantilever. Analysen som vist i figur 4 er resultatet av den globale tilpasning av ligning (1) lagt over målte differensielle stress-avslørende signaler, en ~ 29.7 ± 1.0 eller 14.1 ± 3,0 mN / m og K _d ~ 1,0 ± 0,3 eller 800 ± 310 uM av D-Ala eller DLac peptider, hvor a er et mål på overflaten stress når alle de tilgjengelige bindings-seter er opptatt. Den forbedrede følsomhet av cantilever var innstilt ved systematisk å variere den peptid tettheter p, mens overvåking spenningsforholdene data som en funksjon av p mens antibiotikum som fastsatt til 10, 100 og 250 uM, respektivt (figur 5). Fremgangsmåten ble gjentatt med stress som en funksjon av Van konsentrasjoner mens peptid tettheter satt til p ~ 100%.

<img alt = "Figur 1" fo: content-width = "5in" src = "/ files/ftp_upload/50719/50719fig1.jpg" />
Figur 1. Cantilever påvisning av antibiotikaresistens overflate binding interaksjoner. a) Skjematisk fremstilling av en cantilever sensor array og modusen som narkotika-target interaksjoner blir oppdaget nanomechanically. b) Kjemisk binding interaksjon mellom et stoff molekyl (Van) og bakteriell mucopeptide analog (D-Ala eller D-Lac). c) Den mekanismen som en mutert vancomycin mottakelige bakterier (VSE) kjøper motstand mot vancomycin ved å slette en eneste H-bindingen i bindingen lommen. Klikk her for å se større figur .

Figur 2. Sporing forstyrrelser av modellen bakterielle cellevegg biomekanikk i sanntid. a) Absolutte bøying signaler av D-Ala, D-Lac-og PEG-belagte cantilevers i fosfatbuffer og 250 uM vancomycin. Den differensielle PEG referansesignaler er vist i svarte linjer. B) Differansen bøying signaler av D-Ala og D-Lac belagte cantilevers i fosfatbuffer og 250 uM vancomycin. C) Den differensielle cantilever avlede en doseavhengig signal som en funksjon av tiden i nærvær av vancomycin konsentrasjoner i størrelsesorden 10 nM (gul linje), 100 nm (rød linje) og 1000 nm (mørk rød linje) hhv. d) differensialen cantilever nedbøyning signaler for tre D-Ala belagt cantilever sensorer som funksjon av tiden i nærvær av 10nM vancomycin. Klikk her for å se større figur .

Figur 3. Sporing av forstyrrelser av modellen bakterielle cellevegg biomekanikk i sanntid for en D-Ala og D-Lac belagte cantilevers i nærvær av 7 mikrometer vancomycin i kalv fosterets serum.

Figur 4. Gransker nanomechanics av narkotika-target interaksjoner. Plot viser den målte differensial overflaten stressrespons for D-Ala (svarte sirkler) og D-Lac (røde sirkler) belagt cantilevers som en funksjon av vancomycinkonsentrasjon i løsningen [Van]. Dataene er beskrevet ved ligning (1) (heltrukne linjer). ^Ett

Figur 5. Optimalisering av nanomechanical deteksjonsfølsomheten av reseptor-ligand interaksjoner ved å undersøke avhengigheten av reseptoren lasting og geometri via blandede monolag. Målte differensielle overflate stressresponsene av cantilever sensorer slik som en funksjon av D-Ala overflatedekning, s. i nærvær av faste vankomycin konsentrasjoner i Løsningen på 10 mikrometer (sort linje), 100 mikrometer (rød linje) og 250 mikrometer (grønn linje).

Discussion

Disse resultatene viser at cantilever rekke sensorer har følsomhet til å oppdage og kvantifisere endringer i narkotika-target binding interaksjoner spesielt i vancomycin motstand knyttet til sletting av en enkelt H-bindingen fra stoffets binding lomme. Vi viser en nanomolar følsomhet av Van i samsvar med tidligere overflate-plasmonresonans (SPR) studier ^18,19, og avsløre at cantilever metoden kan direkte oppdage og kvantifisere stoffet molekyler i blodet ved klinisk relevante konsentrasjoner som rutinemessig anvendes i klinisk praksis. Våre data tyder på at differensial overflaten stress kan være beskrevet av et produkt skjema ligning (1), dvs. (i) et kjemisk begrep som beskriver de spesifikke medikament-target bindende hendelser, og (ii) et geometrisk begrep som beskriver den mekaniske forbindelsen mellom kjemisk reagerte overflate områder, som innebærer at de lokale kjemiske interaksjoner kople fra den globale mekanikeral interaksjoner av bommene. Mens den kjemiske betegnelsen er gitt av den klassiske Langmuir adsorpsjon isotermen, avslører den geometriske sikt en percolative mekanisme av narkotika-target indusert overflaten stresse endringer. Den kritiske terskel PC ~ 10% (fig. 5) var nødvendige for å påvise den differensielle cantilever bøying, som viser at overflaten stress er transdusert kollektivt når en relativt stor overflate fraksjon er okkupert av antibiotiske molekyler. For p ≥ pc, den mekaniske forbindelsen mellom kjemisk forvandlet overflate områder er etter hvert etablert, og på kort rekkevidde frastøtende interaksjoner som steric interaksjoner mellom nodene i nanomechanical nettverket gir opphav til økende nedover bøying av hele cantilever. Det er spekulert i at vår nanomechanical perkolasjon modell kan spille en viktig rolle i den glykopeptid antibiotika virkningsmekanisme i reelle bakterier. Disse funnene markere den høye følsomheten til cantilever teknologi for studying antibiotika 'virkningsmekanisme og representerer en ny forskning verktøy for å studere narkotika for å forbedre forståelsen av driften av antibiotika på nano-skala for å informere og muliggjøre oppdagelse av kraftige medisiner for å kontrollere problemene med supervirus infeksjoner. For å forberede cantilever system for reproduserbare og følsomme målinger, har vi adressert et sett av mål i protokollen, særlig for prøven lasting i microfluidic celle og standard operasjonsprosedyrer for å tillate kvantitative nanomechanical påvisninger.

Betydningen av cantilever teknologi med hensyn til eksisterende metoder

Oppsummert peker vi på at mens denne teknologien ble foreslått mer enn 25 år siden, har det ikke funnet sin vei inn i klinikken på grunn av mangel på forsiktig og repeterende målinger på medisinsk relevante mål. Her kan vi vise de prosedyrer som etablerer relevansen av å bruke nanomechanical cantilevers å undersøke mekanikeral påvirkning av antibiotika på bakteriens cellevegg-mål og for å detektere antibakteriell resistens. Konvensjonelle medikament screeningsmetoder krever noen form for fluorescerende eller radioaktiv merking av et reporter molekyl til å måle bindingen av en analytt til målet, ofte i forbindelse med en konkurrerende eller enzymatisk bindingsanalyse og protein-analyser ^20. Merking av biomolekyler er ikke bare tidkrevende og dyrt, men etiketten kan også forstyrre den molekylære interaksjonen ved hindrer binding nettstedet, som fører til falske negativer. I tillegg, fluorescerende forbindelser har ofte hydrofobe som kan føre til bakgrunnsnivået bindende og falske positiver. På grunn av disse begrensninger, er det en økende interesse i nye etikett-frie teknikker som tillater praktisk talt en hvilken som helst molekylær komplekset skal skjermes med minimal analysen utvikling. De mest etablerte label-fri overflate teknologi i dag er SPR og Quartz Crystal mikrovekt (QCM). I motsetning til SPR som måler the dielektrisitetskonstanten, en etikett - fritt utkragende teknologi finner overflate belastningen som genereres av en ligand-reseptor-interaksjon, som kan direkte måle nanomechanical kreftene som genereres av den spesifikke bindingen av ligander til overflate reseptorer. Det unike med disse sensorene er at deres følsomhet ikke baserer seg på dielektriske egenskaper forårsaket av massen endres på grunn av analytten binder det på SPR og QCM men heller på en minste endring i indusert in-plane overflate stress, noe som gjør at teknologien unikt egnet for å studere de nanomechanics av stoffet molekyler ved klinisk relevante antibiotika konsentrasjoner (3-27 mm) ^17. Cantilevers er også spesielt godt egnet til lite molekyl (slik som DNA-fragmenter og medikamenter) deteksjon under fysiologiske tilstander, inkludert komplekse miljøer som er i stor grad ut fra den farmasøytiske industri og vil derfor tjene som en komplementær verktøy i medisiner. Cantilever teknologi har med hell blitt brukt ifelt av genomikk ^3,5, gass sensing ^21, proteomikk ^22, og narkotika ^en. Videre er cantilevers fabrikkert ved hjelp av lave kostnader silisium-teknologi og på grunn av kompatibiliteten med microfabrication prosesser, kan cantilevers lages små for økt følsomhet og parallellisering i store matriser av sensorer for flere narkotika sammensatte screening og høyere gjennomstrømning informasjon-rik screening-analyser. Forbedringer i instrumentering og eksperimentell utforming vil tillate en lang rekke interaksjoner som skal analyseres i sanntid for å hjelpe forhånd letingen etter en ny generasjon av superdrugs for å takle problemene med multimedikamentresistente infeksjoner.

Kritiske trinnene i protokollen

Utviklingen av robuste måleprotokollene er sentralt for anvendelser av denne teknologien. For å oppnå et tilfredsstillende medikament-target kvantitative målinger, og for å bestemme den laveste konsentrasjon av antibiotika that kunne påvises i buffer eller blod serum, kritiske trinnene i protokollen ble adressert. Den første oppgaven innebærer tuning og optimalisering av overflaten fangst kjemi for å forbedre cantilever deteksjon spesifisitet og sensitivitet. Undeniably, er overflaten stresset transduksjon en kollektiv fenomen, som krever en relativt stor del av overflaten som skal dekkes for å opprette forbindelse mellom kjemisk reaktive regioner. Vi viser at ved å variere densiteten av under-laget peptider, en kritisk terskel ~ p ≥ 10%, bestemmes hvor overflaten stresset skala som en funksjon av peptid tetthet og ellers null (figur 5). Det er viktig at forsøk er utformet for å undersøke den ensartethet for stress langs utkraget for å sikre maksimal signal nedbøyninger for slike målinger. I tillegg effektive overflaten regenerering protokoller må være på plass, og dermed lar flere syklus målinger og for å redusere kostnadene for hver test. Mens utforme en reseptor overflate ved hjelp av tiolert hydrofob ende, er orienteringen av reseptormolekyl og avstanden mellom dem viktig å tillate selvstendig sammenstilling av tett pakning på grunn av van-der-Waals-interaksjoner mellom molekylene for å minimere ikke-spesifikke interaksjoner. Videre bør fangstinnstillingene molekyler inneholder en polyetylenglykol (PEG) linker for å tillate noen del av avføling matrise for å være hydrofil å hindre innsetting av molekyler i det analytt-løsning fra å reagere direkte med den ubelagte overflate gull. De PEG linker molekyler må opptre som avstandsstykker for å redusere steric begrensninger og derfor la oppløsningen analytter å samhandle spesielt med overflate reseptorer å indusere målbare overflaten stresset endring. Den frittbærende matrise sensoren må analyseres med minst en in-situ måling og referanse signalet vist i sanntid er et differensial nedbøyning, oppnådd ved å subtrahere mediets absolutte avbøyning av referansen cantilever fra sEnsing cantilevers. Dermed en referanse cantilever er viktig å ta hensyn til uspesifikke interaksjoner som temperaturendringer, endringer i brytningsindeks eller interaksjoner på funksjonalisert undersiden av bommene. Optimalisering av strømningshastigheten (~ 30-150 mL / min) danner et kritisk trinn i den protokoll fordi det sikrer effektiv utveksling av væsker og en tilstrekkelig jevn massetransporten av løsning materialer. Utformingen av en væske celle må tillate optimalt volum (5-80 mL) for høy gjennomstrømning å aktivere perfekt flytende utveksling for å overvinne massetransport begrensninger. Strømningshastigheten er spesielt kritisk når du utfører kinetiske målinger ^23. Store volum væskekamrene krever ukontrollerbare høye strømningshastigheter som fører til store prøvevolumstørrelser krav, som unødvendig øker prisen på analysen. Tidligere har vi brukt gravitasjonsstrømning å injisere ulike prøver i målingen flytende kammer. Gravitasjonsstrømning har den fordel at det doer ikke krever noen mekaniske deler og derfor ikke innføre ekstra støy i systemet. Imidlertid er dens betydelige ulempe at den bare virker pålitelig ved forholdsvis høye strømningshastigheter (~ 200 mL / min). Selvfølgelig ville et lavere strømningshastighet (≤ 1 mL / min) kreve et begrenset prøvevolum pr tidsenhet, men på den annen side gjør det reaksjonene mye langsommere og derfor krever lengre kontakttider. Videre har gravitasjonsstrømning en stor varians i dens strømningshastighet at det avhenger av høydeforskjellen mellom innløpet og utløpet, som minker som prøveløsninger forbrukes i løpet av eksperimentet. For å unngå gravitasjonsstrømning problemer, bør en sprøytepumpe benyttes. Fordelen ved bruk av en sprøytepumpe er at den tillater en konstant strømningshastighet over en lengre periode slik at de eksperimenter som skal realiseres på en mer kontrollert miljø.

Begrensninger av protokollen

Den store utfordringen i å skaffe en reproduserbar end spesifikk biologisk deteksjon ved hjelp av cantilever sensorene ligger i å sikre at egenskapene til reseptoren lag er biokjemisk "aktiv" og ensartet for hvert assay. Hemmeligheten til eksperimentell suksess er i en forsiktig forbehandling av sensor chip med en standardisert rengjøring og immobilisering protokoll med linker kjemi for å orientere reseptor molekyler i sin aktive konformasjon. I vår nåværende oppsett, functionalize vi cantilever arrays bruker lite glass kapillærer, som kan være gjenstand for noen ulemper, og kan være problematisk i enkelte tilfeller. Disse glass kapillærer som er åpne i begge ender, og derfor prøven løsningsmidler kan lett fordampe. Hvis for eksempel temperaturen av funksjonalisering stadium ikke styres nøyaktig, kan fordampningshastigheten variere betydelig på forskjellige tider spesielt dersom man bruker flyktige løsemidler som etanol. Det er også en mulighet for liten variasjon i inkubasjonstid fra en utkraging til en annen given at sensormidlet væsker må lastes etter hverandre inn i kapillærene. Den annen begrensende faktor i kapillar funksjonalisering er mangelen på evne til å sikre at kantilever blir alltid satt inn i kapillarene på nøyaktig samme måte. I tillegg, noen ganger cantilevers må bli trukket ut noe fra kapillærer for å forhindre kryss-kontaminering i de flytende prøvene kan flyte på brikken legeme. Vi kan løse disse problemene ved å bruke blekkskrivere spotters som et alternativ overflatebehandling prosedyre å belegge cantilevers. Selv om det ville tillate nøyaktig kontroll av prøven belegg med mulighet for å skalere opp for store matriser, er den felles ulempe at de små dråper som avsettes på utkraget kan fordampe i løpet av sekunder og krever en kontrollert fuktighetsmiljø. Derfor kan den inkubasjonstiden ikke en enkel måte reguleres, noe som kan være ønskelig for enkelte anvendelser. Den subtile samspillet mellom de faktorer som sample volume, inkubasjonstid og avdampning har direkte innvirkning på eksponering av cantilevers til funksjonalisering prøven og omsorg må tas for å sikre optimale overflate kjemi for cantilever analyser som enhver liten variasjon i reseptoren molekylær tetthet vil ha en stor effekt på cantilever reaksjon.

Eksperimentelle design modifikasjoner (dvs. alternative teknikker eller materialer)

For å overvinne den store utfordringen i å skaffe reproduserbar belegg prosedyre for den fremtidige utviklingen av cantilever teknologien, er ulike strategier er nødvendig som ville bruke cantilevers integrert i microfluidic kanaler. Tanken er at spesielle cantilever chips bør utformes slik at hver cantilever er plassert i sin egen kanal for å tillate online in situ Funksjonalisering prosedyrer der kanalene er adressert individuelt. Disse eksperimentelle design modifikasjoner ville tillate coating prosess som skal utføreed i en kontrollert og lukket miljø hvor eksponering for oppløsningsmidlet blir nøyaktig overvåket av inkubasjonstiden og strømningshastigheten for automatisert immobilisering av fangst molekyler på leddede chips. De samme kanaler kan deretter bli brukt for selve bindingsforsøk hvor alle cantilevers kan utsettes for den samme analytt-løsning. Foruten cantilever funksjonalisering prosedyren, ville cantilever avlesning mekanismen også må forbedres. Den optiske strålen nedbøyning metoden er svært følsom, og det har vært brukt med hell i Atomic Force Mikroskopi (AFM) teknologi i mange år. Likevel, for de frittstående cantilever sensor programmer den optiske avlesning har noen ulemper, for eksempel ikke det tillater målinger i ugjennomsiktige væsker som blod, kan justeringen av en rekke lasere være tidkrevende og langtekkelig og gjeldende konfigurasjon kan ikke differensiere mellom vipping og vertikale nedbøyninger. Dermed fremtidige utviklingen av cantileveh teknologi vil måtte vurdere aspekter ved den generelle sensor design (f.eks cantilever geometri) og cantilever avlesning for robuste måleprotokollene både i felt og laboratorium miljøer. Manalis og kolleger ²² har utviklet nye typer hul cantilever sensorer der cantilevers har en innebygd microfluidic kanal inne i bjelken, slik at enheten skal brukes i et vakuum med høy kvalitet faktorer. I denne modusen utkraginger fungere som mikrovekt ^22, og derfor er det ikke lenger nødvendig å ha et asymmetri mellom de to sider i forhold til funksjonalisering, således fangstinnstillingene molekyler kan physisorbed eller covalent bundet direkte på silisium, vanligvis ved hjelp av SAMs eller silanes ^24. De cantilevers kan også bli modifisert med et tynt polymerlag som er så konjugeres til antistoffer ²⁵ til biokjemisk sensing.

Feilsøking

En felles problem forbundet med cantilever målingene er innføring av luftbobler i den mikrofluidteknisk strømningscellen. Forsiktighet må utvises for å sikre at ingen luftbobler innføres i flytende celle mens montering av brikken. Signal drifting er også et annet vanlig problem forårsaket av forskjeller i temperatur på prøvene. De cantilevers må være likevekt å stabilisere seg før målingene er foretatt. Alle buffere, analytter og regenerering oppløsninger må være lagret i samme rom som den frittbærende instrument for å tillate at alle løsningene som har den samme temperatur. Selv om sprøytepumpe kan gi svært nøyaktige og ekstremt lave hastigheter, er det generelt forbundet med mekanisk støy i cantilever målinger. Det er derfor viktig å tenke ut en enkel og effektiv støyreduksjon for å unngå unødig støy i blokker de signaler. Støyen redusering består av små flytende reservoar som ligger mellom sprøytepumpen og væsken celle, som absorberer than mekanisk støy fra pumpen. På grunn av den følsomme natur av optisk detektor, bør den frittbærende målesystem ideelt sett drives i et lukket oppsett for å blokkere eventuelle tilfeldig lys fra å forstyrre den optisk avlesnings-systemet. I tillegg kan kvaliteten på sense-lagene reduseres betydelig dersom et stort antall vasketrinn er utført på utkraget som begrenser levetiden for sensorbrikken.

Alternative eller fremtidige søknader etter mestre denne teknikken

Cantilevers belagt med SAMs som terminerer i en amino-eller carboxyl-gruppe kan benyttes som pH-sensorer. De funksjonelle endegrupper eller protonate deprotonate avhengig av løsningens pH-verdi og kan generere en overflateladning som fører den frittbærende å bøye ^24.. Gitt at cantilever sensorene kan spore narkotika-target interaksjoner knyttet til destabilisering av celleveggen av livets bakterier ^1,6,7, vil de derfor bidra isøk og for utvikling av en ny generasjon av antibiotika for å bekjempe narkotika-resistente infeksjoner. I fremtidige cantilevers ville bli brukt som mikrovekter å måle masse og vekstrater på enkeltceller ^26. Cantilever teknologien vil være gunstig for studiet av cellulære responser til ulike vekstfaktorer eller narkotika. Det vil også tilby en roman verktøy for rask påvisning av flere biomarkører, som har umiddelbar relevans i medisinske og point-of-care-applikasjoner. Gitt allsidighet, liten størrelse, og robusthet av cantilever sensorer, vil de danne en følsom skjerm av skadelige miljøfaktorer. De har allerede vist sin følsomhet i å oppdage giftige og skadelige gasser som kan flykte fra laboratoriet og industrielle produksjonsenheter i miljøet, slik som flussyre ²⁷ eller hydrogencyanid ^28.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Scentris		Scentris, Veeco Instruments, Inc	Not in production
Six-way valve		MVP, Hamilton, Reno, NV	Enables multiple concentration injection
EB Evaporator		BOC Edwards Auto 500, UK	Electron beam is preferable because of deformation of cantilevers caused by thermal heating problems
Storage vessel		Agar Scientific, UK	Keeps gold coated films fresh
Glass capillary		King Precision Glass, Claremont, CA, USA	For capillary functionalization of the cantilever arrays
Pump		Model Genie Plus, Kent Scientific, Torrington, CT, USA	Good for controlled flow rate of liquid samples in microfluidic channels
0.2-4.5 μm Filters	1511940001	Merck Millipore	For sample filtering
Cantilever chips		London Centre for Nanotechnology (LCN)	Highly sensitive
Sodium phosphate monobasic	10049-21-5	Sigma-Aldrich, UK	For making buffer solutions
Sodium phosphate dibasic	7558-79-4	Sigma-Aldrich, UK	For making buffer solutions
Polysorbate 80 (PS80) or Tween 80	9005-65-6	Sigma-Aldrich, UK	Used in buffer solutions to prevent nonspecific interactions on glassware
DI water		Millipore Co., Billerica, MA, USA	Used for making solutions
Whole serum	GEM-700-110-H	Sera Laboratories International Ltd, UK	Used in measurements that mimic physiological conditions
Vancomycin (Van)	1404-93-9	Sigma-Aldrich, UK	Drug used
Sulfuric acid	7664-93-9	Sigma-Aldrich, UK	Used for glassware cleaning procedures
Hydrogen peroxide	7722-84-1	Sigma-Aldrich, UK	Used for glassware cleaning procedures
D-Ala and D-Lac		London Centre for Nanotechnology (LCN)	Surface receptors coated on the cantilever for detecting drug-target interactions
LabView		National Instruments Co., Austin, TX, USA	Software used for instrumental interface to allow controlled measurements