Summary
Live cell imaging van alphaherpes virusinfecties maakt analyse van de dynamische gebeurtenissen van gerichte transport en intercellulaire verspreiding. Hier presenteren we methodieken die recombinante virale stammen die fluorescerende fusie-eiwitten tot visualisatie van virale assemblages tijdens infectie van primaire neuronen te faciliteren.
Abstract
Vooruitgang in levende cellen fluorescentie microscopie technieken, alsmede de constructie van recombinante virale stammen die fluorescerende fusie-eiwitten tot expressie zijn real-time visualisatie van transport en verspreiding van alphaherpes virusinfectie van neuronen geactiveerd. Het nut van nieuwe fluorescente fusie-eiwitten om virale membraan, tegument en capsids, in combinatie met live cell imaging, geïdentificeerd virusdeeltje assemblages ondergaan vervoer binnen axonen. Dergelijk gereedschap zijn met succes toegepast voor analyse van cel-cel verspreiding van virale deeltjes naar het aantal en de diversiteit van virions overgedragen tussen cellen te kwantificeren. Belangrijk is dat de technieken van live cell imaging van anterograde transport en verspreiding produceren een schat aan informatie, waaronder deeltjes-transport snelheden, verdelingen van deeltjes, en temporele analyses van eiwit lokalisatie. Naast klassieke virale genetische technieken, zijn deze methodieken verstrekt kritische inzichtenin belangrijke mechanistische vragen. In dit artikel beschrijven we in detail de beeldvormende methoden die werden ontwikkeld om de fundamentele vragen van alphaherpes virus transport en de verspreiding beantwoorden.
Introduction
Infectie van het perifere zenuwstelsel (PNS) van alphaherpes virussen zoals herpes simplex virus (HSV) -1, -2, en pseudorabies virus (PRV) omvat verschillende complexe en sterk gereguleerde stappen in de virale levenscyclus. Vervoer binnen neuronen van de PNS is cruciaal tijdens de gebeurtenissen van zowel de primaire virale infectie en daaropvolgende inter-host-spread. De moleculaire mechanismen die twee componenten van de virale levenscyclus moduleren; gericht transport van virale assemblages weg van cellichamen binnen axonen (anterograde transport) en de daaropvolgende overdracht van virusdeeltjes aan gevoelige cellen (anterograde spread) zijn van belang om inzicht te herpesvirus pathogenese.
Het transport en wegtrekken van virale deeltjes in neuronen afhankelijk montage van een volwassen infectieus virion 1,2. Eerder vaste assays, zoals immunofluorescentie (IF) en elektronenmicroscopie (EM), werden gebruikt om het deeltje samenstel staat en prot bestuderenein interacties in verband met het vervoer virion en verspreiden 3-6. Maar het dynamische karakter van het vervoer virionen en experimentele artefacten geïntroduceerd door chemische fixatie overtuigde de interpretatie van vaste beelden 7,8. Recent zijn een aantal virale fluorescerende fusie-eiwitten is beschreven voor HSV en PRV die verwaarloosbaar effect op proteïne functie. Green Fluorescent Protein (GFP) en rood fluorescerende eiwitten (mCherry of mRFP) fluoroforen worden vaak gekoppeld aan beeldvorming van twee van de drie structurele componenten van een rijpe virion toe: capside, tegument en glycoproteïne 9-11. Live cell imaging van anterograde vervoer met behulp van dual-gelabelde virussen visualiseert de assemblage staat van virale deeltjes tijdens het transport. Soortgelijke fluorofoor expressie virale stammen worden gebruikt om het aantal en de verscheidenheid van virale genomen na verspreiding 12,13 visualiseren. De eigenschappen van de fluorescerende eiwitten (beoordeeld in 14,15) grote invloedhet vermogen om virale of cellulaire samenstellingen visualiseren. De intrinsieke eigenschappen van de fluorescente eiwit, waaronder zelf-interacties en stabiliteit moet worden beschouwd bij het ontwerpen en testen van nieuwe proteïne fusies voor het behoud van wildtype functionaliteit.
In combinatie met fluorescerende eiwitfusies, twee goed gekarakteriseerd in vitro celkweek systemen worden ingezet voor live cell imaging van herpes virus infectie: los 16 en gecompartimenteerd 17 (Figuur 1A) rat superieure cervicale ganglia (SCG) neuronen. In beide systemen, embryonale SCG's worden ontleed, gedissocieerd om eencellige organismen, en vergulde voor in vitro kweken van 18. SCG neuronen zijn onderdeel van het autonome zenuwstelsel en kunnen gemakkelijk worden gekweekt en gedifferentieerd neuronale groeifactor (NGF) tot een volwassen gepolariseerde toestand ex vivo. Gedissocieerd SCG neuronen vormen een uitgebreid netwerk van axonen die f maaktof visualisatie van virale deeltjes onderworpen worden anterograde transport 6. Verzuilde SCG culturen bieden fluïdische isolement van de neuronale cel lichaam (S compartiment) en distale axon-uiteinden (N compartiment) 19. Een aantal gedetailleerde protocollen voor de aanleg en het gebruik van verzuilde neuronen met behulp van originele 20 of gemodificeerde Campenot kamers 17 eerder openbaar werden gemaakt. Vloeibare isolatie zorgt voor selectieve infectie van neuronale cellichamen en detectie van nieuwe virusdeeltjes na vervoer naar afgelegen axon-uiteinden. Plating epitheelcellen over de uiteinden voorafgaand aan infectie biedt ontvangende cellen voor verspreiding van de virale infectie.
Er zijn vele essentiële elementen van belang voor alle live cell imaging experimenten, maar het meest relevant zijn voor onze protocollen zijn: automatische beeldopname, tl verlichting, snelheid van de beeldvorming, en milieu-controle. Voor alle grafische experimenten, gebruiken weeen omgekeerde, geautomatiseerd epifluorescentie microscoop verlichting (Figuur 1B). De microscoop is opgebouwd rond de Nikon Eclipse Ti basis en maakt gebruik van een aantal computergestuurde gemotoriseerde systemen om snel opnieuw configureren van de microscoop tijdens automatische beeldopname. Voor fluorescentie verlichting, maken we gebruik van een breed-spectrum kwik booglamp die verzwakt met grijsfilters langs het pad verlichting kan zijn. Excitatiefilters beperken het spectrum van TL-verlichting en wanneer deze is gekoppeld met multi-pass dichroïsch spiegels en fluorescentie-emissie filters specifieke fluorescerende verbindingen visualiseren. De excitatie en emissie filters zijn gemonteerd in onafhankelijke, snel schakelen filter wielen te snel opeenvolgende acquisitie van verschillende fluorescentie kanalen mogelijk. De snelheid van de beeldopname wordt verder versterkt met een gevoelige en snelle EM-CCD-camera, handig voor de detectie van lage intensiteit signalen en korte imago gelezen keer. Milieu-controle op de Microscope wordt bereikt met een fase top verhit incubator en een objectieflens kachel monsters handhaven bij verhoogde temperaturen terwijl een bevochtigde en CO2 verrijkte atmosfeer wordt doorgegeven aan de incubator. De microscoop wordt bewaard in een verduisterde ruimte met omgevingstemperatuur onderhouden dicht bij 25 ° C en buiten licht geminimaliseerd met verduisterende gordijnen voor alle ramen. De volgende protocollen beschrijven het gebruik van dit systeem voor anterograde transport en verspreiding assays.
Een aantal alternatieven te controleren voor de variabelen van live cell imaging. De besturing van microscopie instellingen handmatig of via automatische systemen afhankelijk eigen software uitgevoerd. Fluorescentie verlichting kan worden bereikt met halogeen, LED of laser bronnen. De snelheid van beeldvorming wordt gewijzigd door de snelheid van de filter schakeling en de tijd om het signaal met de gepaarde detectiesysteem visualiseren. Milieu-controle kan met gespecialiseerde hardware worden gerealiseerd op de microscope fase behuizing van alle of een deel van de microscoop in een verwarmde en bevochtigde box, of door verhogen van de temperatuur van de ruimte waar microscopie wordt uitgevoerd. Elk van deze alternatieven heeft voor-en nadelen van kosten en prestatie.
In de daaropvolgende protocol, we detail het gebruik van beeldvorming van levende cellen snel anterograde vervoer en anterograde verspreiding van virussen alphaherpes studie door het gebruik van recombinante virale stammen. Real-time live cell imaging visualiseert capside, tegument, en / of glycoproteïne co-lokalisatie op dynamische structuren ondergaan vervoer binnen axonen 11. Overnachting timelapse beeldvorming van verzuilde neuronale culturen visualiseert axonale virion uitstappen en infectie van gevoelige cellen 12. De protocollen die hier gepresenteerd zijn geoptimaliseerd voor gebruik met onze specifieke imaging systeem, maar worden gepresenteerd in brede zin ten opzichte van de vier elementen van live cell imaging. In de discussie die wezal nader enkele optimalisatie die nodig zijn voor een succesvolle experimenten is.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Sectie 1 - Environmental Control Voorwaarden voor live-cell fluorescentie microscopie
- 30 min voorafgaand aan de beeldvorming experiment verbinden en de opwarming van de microscoop podium top incubator.
- Schakel de microscoop, verzonden en epifluorescerende lichtbronnen, en geautomatiseerde hardware controles. Open de microscoop besturingssoftware, NOS Elements, om verbinding met de microscoop en beginnen met het koelen van de EM-CCD-camera.
- Hechten Lens warmere passende doelstelling (ofwel 60X of 100X olie-immersie). Opmerking: Selecteer objectief op basis van het type experiment. De 100X differentieel interferentie contrast (DIC) is het beste voor het bijhouden van anterograde transport virion assemblages, terwijl de 60x fase objectief is geschikt voor anterograde verspreiding visualiseren. Lagere vergroting, hoeft niet-olie-immersie doelstellingen vereisen een lens warmer als ze geen direct contact maken met het monster.
- Bevestig podium top incubator op het gemotoriseerde fase van mi croscope. Zorgen voor de juiste inzetstuk dat zal houden het monster op zijn plaats is. Bevestig de bevochtigde lucht lijn van de incubator controle aan de ingangspoort van de podium top incubator.
- Schakel de incubator en de lens warmere controles en temperatuur instellingen aanpassen om eerder geverifieerde voorwaarden specifiek voor de objectieve en monster in beeld wordt gebracht (zie bespreking).
- Open de regelklep op de 5% CO 2/95% atmosferische tank om de CO 2 aangevuld toevoeren om het podium top incubator. De stroomsnelheid moet tussen 60 en 80 ml gas per minuut. Hogere snelheden zal resulteren in een uitgebreide steekproef uitdroging ondanks het bevochtigen kamer.
- Voeg lens olie aan objectief en onmiddellijk plaats de cultuur die wordt afgebeeld in het stadium top incubator.
- Laat evenwicht van de temperatuur in de cultuur ten minste 10 minuten. Een uur heeft de voorkeur, vooral voor overnachting beeldvorming in hoofdstuk 3 beschreven.
- Zes tot acht uur vóór beeldvorming infecteren van een 35 mm dekglaasje-onderste schaal van volwassen, gedissocieerd SCG neuronen met 1 x 10 6 plaque vormende eenheden van het virus van belang (zie tabel 1 bijvoorbeeld virussen) volgens de in Taylor et beschreven werkwijze al.. 2012a 11. Als het testen van meer dan een virus, off-set inentingen door 30-60 min om voor beeldvorming van opeenvolgende monsters op hetzelfde tijdstip na infectie.
- Plaats schotel in podium top incubator voor een minimum van 10 minuten voordat u een experiment. Terwijl de temperatuur evenwicht houdt, wordt het brandvlak verschuiven en zal een negatieve elke imaging experimenten beïnvloeden.
- Met behulp van doorvallend licht en het oculair van de microscoop, het vinden van een neuronale cel lichaam dat een duidelijk geïsoleerd axonale extensie heeft. U kunt ook de juiste fluorescentie verlichting met een cel die detectie vindentafel hoeveelheden fluorescerende eiwitten. Het is belangrijk om de blootstelling van het monster te beperken tot fluorescentieverlichting, bij deze stap en de volgende stappen, door licht geïnduceerde celschade en bleken van fluorescerende eiwitten.
- Verzwakken fluorescentieverlichting de intensiteit van excitatielicht waaraan de cellen worden blootgesteld verminderen. Engage licht verzachtende Neutral Density (ND) filters in de fluorescentie verlichting lichtpad. Voor films langer dan 1 min, minimaal ND4 duren moeten worden gebruikt om te voorkomen fotoblekingsreactie van fluorescente eiwitten en uitgebreide foto-beschadiging van axons. Sterk fluorescerende structuren kan doorgaans worden gevisualiseerd met een ND8 filter op zijn plaats.
- Met behulp van de microscoop software (Figuur 2 en aanvullende Movie 1A), schakelt het licht-pad naar de EM-CCD-camera.
- Bepaal een optimale beeldvorming en-condities voor elk fluorescerende kanaal.
- Start een live-beeld-venster met behulp van de "Play" knop. </ Li>
- Bepaal de optimale belichtingsinstellingen camera voor elke fluorescerend eiwit. Neem niet meer dan 300 msec per kanaal als motionele aberraties van snel bewegende virion structuren zal optreden. Maken gebruik van de EM winst van de camera om een instelling van 300 (door de fabrikant geadviseerde maximale winst), om de blootstelling te minimaliseren en te verbeteren detectie van dim-signalen. Juiste belichting tijden moeten produceren een beeld met een lage achtergrond intensiteit en hoge specifieke signalen.
- Na het instellen van vorderingen en het vinden van een goed gedefinieerde regio axon, moet de software worden geconfigureerd om automatische beeldopname te voeren. Stoppen met de live-imaging venster om monster te voorkomen bleken.
- In de NOS Elements-software, selecteer de 6D - Definieer / Run Experiment toepassing van de "Applications" drop down menu.
- In het venster ND overname, klikt u op het tabblad Time die de frequentie van het beeld overname zal bepalen. Stel de Interval op "No Delay" en de Duration tot 5 min. The software zal dan verwerven afbeelding frames op de hoogste frequentie mogelijk voor de duur van 5 minuten.
- Selecteer het tabblad "Lambda", die de selectie van de vooraf ingestelde hardware-configuraties gebruikt voor meerdere fluorescerende afbeelding overname stelt. Klik op het eerste vak en in de daarop volgende drop down menu om een geschikte hardwareconfiguratie selecteren. Herhaal voor alle fluorescente proteïnen te beelden.
- Zorg ervoor dat de lipjes voor "XY posities", "Z-serie" en "Grote Afbeelding" zijn de-geselecteerd.
- Boven de tabbladen, selecteert u het vakje "Save to File" om afbeeldingen automatisch tijdens acquisitie op de harde schijf op te slaan. De locatie en de bestandsnaam van het experiment output bestand configureren. Als opeenvolgende experimenten worden uitgevoerd, zal de software een volgnummer toe te voegen aan het einde van de aangewezen bestandsnaam.
- Zodra alle tabbladen zijn geselecteerd. Initiëren het experiment door te klikken op de "Run-nu" knop.
- Optimaliseren van het beeld overname prijs via belichtingsinstellingen en image grootte. Met behulp van een klein gebied van het beeld-staat gebied zal vaak versnellen kader overname tarieven. Definieer de regio van belang het gebruik van de ROI instrument in NIS-Elements, het selecteren van een gebied tussen de 25% en 50% van het totale beeldgebied. Als alternatief zal kortere belichtingstijden verhogen kader overname tarieven, maar vermindert de kwaliteit van het signaal (zie bespreking).
Sectie 3 - Overnight Time-lapse beeldvorming van Anterograde Spread Evenementen
- Vier uur voor de beeldvorming, infecteren van een gecompartimenteerde neuronale cultuur gebouwd op een 35 mm μ-Dish. Inoculeer neuronale cellichamen met 1 x 10 6 plaque vormende eenheden van het virus van belang (zie tabel 1 bijvoorbeeld virussen) volgens de in Taylor et al. beschreven werkwijze. 2012b 12.
- Plaats voorzichtig cultuur schotel op het podium top incubator. Zorg ervoor dat de positie van het doel wordt ingesteld op de zijkant van de schotel. Langzaam breng de doelstelling in beeld, ensurING de doelstelling niet opdrijven in de steekproef. Zodra het veld focus is geïdentificeerd, langzaam het doel in het midden van de schotel, in de buurt van de interne barrière markeren van de interne kant van het axon compartiment. Bij het verplaatsen, zorgen voor de focus diepte wordt onderhouden en te vermijden duwen tot in de steekproef. Doorbuiging van het plastic oppervlak van de doelstelling zal de axonen en de kunststof beschadigen.
- Voeg ongeveer 2 ml warm (~ 37 ° C) fosfaat gebufferde zoutoplossing om de kweekschaal buitenzijde van de teflon ring. Dit omgeeft de neuronale kweek met een ring van PBS te proeven uitdroging minimaliseren en thermische isolatie.
- Laat u de temperatuur voorafgaande evenwicht voor een minimum van 1 uur aan de start van geautomatiseerde beeldacquisitie (3.8). Stappen 3.5 tot 3.7 kan worden ingesteld gedurende deze tijd.
- Beperk de intensiteit van de verlichting tot het laagst mogelijke niveau door deel te nemen alle grijsfilters. Dit zal frequent beeldaanwinst over lange perioden zonder bovenmatige foto-schade. Het verminderen van verlichting zal resulteren in lage signaal, waarbij langere blootstellingen (zie bespreking).
- Gebruik historische belichtingsinstellingen of voorafgaand aan de experimentele set-up genereren een parallelle gerecht van geïnfecteerde epitheliale cellen die het doelwit fluorescerende eiwitten om de belichting vast te stellen, zoals beschreven in paragraaf 2.5.
- Na het instellen van de posities voor de nodige kanalen, is het tijd om de software voor automatische beeldopname configureren. Stoppen met de live-imaging venster te proeven bleken te beperken.
- In Elements software (Figuur 2 en aanvullende movie 2), selecteert u de 6D - Definieer / Run Experiment toepassing van de "Applications" drop-down menu om het venster ND Overname brengen.
- ND-venster Acquisition, klikt u op het tabblad Tijd. Stel de Interval op "5 min". Stel de Looptijd tot 20 uur. De lussen veld wordt automatisch berekend voor het aantal herhalingen het program zal presteren.
- Selecteer het tabblad "Lambda". Klik op het eerste vak en in de daarop volgende drop down menu selecteert u de juiste lambda configuratie voor fase contrast. Herhaal voor de volgende posities, de juiste configuraties voor elke fluorescente proteïne te beelden selecteren.
- Selecteer de "Grote Afbeelding" tab, waarin de parameters van meerdere beelden worden gecombineerd in een groter gezichtsveld bepaalt. Een flinke gebied bestaat uit 5 x 2 beelden met behulp van een 7% stiksels overlap. Dit zal zorgen voor het maximale aantal cellen per positie af te beelden zonder impact op de frequentie van de beeldopname. Ook deselecteer de checkbox voor "Close Active Shutter tijdens Stage beweging". Deze optie verhoogt de snelheid van de overname door geen luiken tussen de afbeeldingen sluiten.
- Selecteer de tab "XY posities", naar meerdere posities die sequentieel worden afgebeeld in parallel in de loop van de nacht film identificeren. Selecteer posities die het middelpunt po definiërenint voor elke grote beeldgebied. Selecteer 6-8 afbeelding posities in de steekproef. Een goed imago gebied zal kleine clusters van cellen in nauwe appositie om duidelijk omschreven axonen. De cellen moeten niet worden gestapeld bovenop elkaar en axon bundeling moet worden geminimaliseerd. Het punt van aandacht is de kern van de cel. Plaats het doel zodat een duidelijke kernenvelop gezien de meerderheid van de cellen.
- Zorg ervoor dat het tabblad "Z-serie" is geselecteerd.
- Configureren van de auto-save functie, zoals hierboven in paragraaf 2.6.5 beschreven.
- Test de belichting en positie-instellingen door te klikken op "1 keer loop". Evalueer de resulterende beelden voor doorvallend licht verlichting, focus en framing. Als focus is verschoven, reset de focus voor elke positie onder het tabblad XY. Wacht 10 minuten en herhaal deze stap totdat nadruk is stabiel.
- Nadat alle instellingen zijn gecontroleerd en getest, inleiding van de geautomatiseerde experiment door te klikken op de "Run Now" knop.
Sectie 4 - Image Processing en Export
Gegevens exporteren
- Datasets verkregen bij live-cell imaging van het vervoer en het uitrijden evenementen moeten van de NOS Elements-software worden geëxporteerd naar veelgebruikte bestandstypen voor later gebruik in presentaties en publicaties (aanvullende Movie 3). Om te exporteren in NIS Elements films opent u de bijbehorende grondstoffen. Nd2 bestand en selecteer de "split-component" oog op de gewenste fluorescerende kanalen visualiseren. Afspelen van het bestand op een geschikte snelheid; 5 frames per seconde is een goed uitgangspunt voor de visualisatie van snel transport.
- Onder andere een tijdstempel om een real-time klok tijdens het afspelen van films vertegenwoordigen. Klik met de rechtermuisknop op de afbeelding en selecteer, Voeg ND-informatie. Een digitale teller verschijnt in de linker bovenhoek.
- Bewerk de tijdstempel om informatie weer te geven. Klik met de rechtermuisknop op de teller en selecteer Bewerken ND-informatie. In de daarop volgende pop-up venster, bewerkt u de tekst aan de verbeelding weer te gevenng parameters die van belang zijn. Wijzig lettertype, kleur en grootte voor de duidelijkheid.
- Ga naar het menu "Bewerken" en vinden "Create view snapshot" of druk op de toets "x". Deze opdracht opent het "snapshot view" venster. Selecteer "gelden voor alle frames" om een 8-bits, RGB, export-klaar bestand met de tl-kanalen uit de hele film te genereren.
- Opslaan als een. Avi-bestand voor cross-platform compatibiliteit. Stel weergave snelheid 200 msec per frame. De. Avi-bestanden gegenereerd door NIS Elementen kunnen vervolgens verder worden gecomprimeerd met andere conversie software in het gewenste bestandstype.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Anterograde Transport
De toepassing van dit protocol om infecties van gedissocieerde SCG culturen met PRV 348, is een recombinante PRV stam die GFP-US9 en GM-mCherry membraan fusie-eiwitten, de visualisatie van de anterograde vervoer van virusdeeltjes (figuur 3 en aanvullende Movie 4) vergemakkelijkt. Incorporatie van deze fusie-eiwitten in de virale deeltjes resulteert in hun detectie op transport puncta, en de eerder genoemde beeldvorming voorwaarden minimaliseren van de offset van elke fluorofor op een bewegend deeltje tijdens filter schakelen. In een drie-minuten imaging window, zijn tal van transport puncta vaak waargenomen en grote steekproefomvang voor colocalization analyses worden snel gegenereerd. We hebben eerder gekwantificeerd het colocalization van GFP-US9, de alphaherpes virus axonale targeting eiwit, met andere structurele eiwitten met behulp van deze aanpak 11. Vergelijkbare analyses van andere dual recot PRV-stammen zijn ook beschreven 11 en recent werk heeft de co-transport van PRV eiwitten gedocumenteerd met een fluorescent gelabeld gastheer motor eiwit in een verdere uitbreiding van dit protocol 21. Gebruik te maken van snel schakelen filter wielen en gepaarde multi-pas dichroïsch spiegels maakt een snelle opeenvolgende aankoop van twee of meer fluorescerende kanalen. We kunnen op dit moment bereiken twee-kanaals opeenvolgende acquisitie met snelheden tot 0,8 frames per seconde. Voor single channel video microscopie, die wordt alleen beperkt door de fluorescentie belichtingstijd en read-tijd van de camera, kunnen we bereiken overname groter dan 6 beelden per seconde.
Anterograde Spread
Tot anterograde spread gebeurtenissen te visualiseren, zijn interessegebieden gevisualiseerd om de 5 tot 10 minuten voor een uur tijd 20, gedurende welke tijd virusdeeltjes zal vervoeren naar beneden en uittreden van axonen, het infecteren van de nabijgelegen epitheelcellen. Een vertegenwoordiger frame van de grote afbeelding zijneen wordt getoond in Figuur 4A en aanvullende film 5. Let op de ruimtelijk gescheiden aard van het fluorescerende eiwit tot expressie brengen, wijst op primaire infectie van axonen. Geïnfecteerde cellen kunnen achteruit worden gevolgd tijdens de film aan de fluorescerende capsids dat de virale infectie gestart visualiseren. Deze individuele cellen kunnen worden geïsoleerd uit het grote frame gevolgd zonder significant verlies van detail. De vertegenwoordiger frame (Figuur 4B) vanaf Aanvullende Movie 6 beeldt een tijd nadat virusdeeltjes de fluorescerende capsid hebben gestort in het cytoplasma.
Data Analysis
Een reeks verschillende analyses kunnen worden uitgevoerd op live-cell imaging datasets inclusief deeltje tracking, colocalization studies en kwantificering van virion spreiding evenementen. We voeren vaak onze analyses direct in de NOS Elements software of het gebruik van een plug-in extensie beschikbaar voor de ImaGej softwarepakket dat mogelijk maakt. nd2 bestandstype ondersteunen. Verschillende hypotheses en experimentele opstellingen vereisen unieke analysemethoden. Onze groep heeft methoden beschreven voor het beoordelen colocalization van fluorescente eiwitten op dynamische structuren 11,21 en time-lapse kwantificering van de individuele deeltjes verspreiden gebeurtenissen 10,12,22. De methoden beschreven in dit manuscript en onze eerdere studies zijn flexibel en kunnen worden toegepast op verschillende virale infecties alsmede het transport van cellulaire structuren, bijvoorbeeld mitochondria 23.
Figuur 1. Schematische voorstelling van microscopie opgezet voor live cell imaging. A) werkzaam types Cultuur voor studies van respectievelijk anterograde vervoer (gedissocieerd) en anterograde spread (chambered). Paneel 1 is een fase contrast imago van een volwassen, los Superior Baarmoederhalskanker ganglia (SCG). Paneel 2 is een schema van de compartimenten kweeksysteem afgebeeld in paneel 3 met SCG neuronen uitgeplaat in het linker compartiment met axonale uitsteeksels zich onder de interne belemmeringen tegen de rechterkant compartiment. B) De omgekeerde microscoop en epifluorescerende fase top incubator gebruikte configuratie voor video-microscopie experimenten. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 2. NIS-Elements software-interface. Een screenshot van een standaard user interface in NIS-Elements wordt weergegeven. De Play-en Stop-knoppen regelen het venster levend-afbeelding van de huidige hardware-configuraties voor beeldvorming evenals wat momenteel wordt afgebeeld. Over het bovenpaneel zijn een reeks van optische configuraties die vooraf hardware se implementerentellingen aan de microscoop voor trans-verlichte of fluorescentie detectie configureren. De camera controle en belichtingsinstellingen toestaan configuratie van de camera detectie om de beeldkwaliteit en snelheid te optimaliseren. Alle experimenten worden gecoördineerd met behulp ND Acquisitie controles. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 3. Live cell imaging van SCG axonen bij 8 uur na infectie met PRV 348. PRV 348 geïnfecteerde neuronen drukken de GFP-US9 en GM-mCherry membraan fusie-eiwitten. Anterograde-transport structuren binnen distale axonen zijn gevisualiseerd in twee TL-kanalen, GFP en mCherry. Een anterograde-transport structuur (witte pijl) vordert binnen de axon zoals afgebeeld in de opeenvolgende beelden genomen vanaf Aanvullende Movie 4. De twee fluorescerende eiwitten spatibondgenoot off-set als gevolg van opeenvolgende acquisitie van TL-kanalen en de snelle beweging van virale structuren. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 4. Overnachting timelapse beeldvorming van anterograde verspreiding gebeurtenissen van besmette axonen tot epitheelcellen clusters tijdens een multi-color infectie. Vertegenwoordiger beelden van een enkele positie, grote afbeelding betegeld time-lapse film van virion overdracht van PRV 427 besmette axonen in ontvangende epitheelcellen. A) Een samengevoegde afbeelding van de uitgezonden, YFP en RFP fluorescentie beelden tegelijk na infectie waar de ontvangende cellen beginnen de YFP-CAAX en VP26-mRFP fusie-eiwitten te uiten. In het tweede paneel, worden de YFP en RFP kanalen samen getoond. Let op het grote aantal mRFP puncta associated met de axon traktaten. Deze zijn gemonteerd virusdeeltjes ondergaan langeafstandsvervoer binnen axonen (aanvullende Movie 2). De witte doos vertegenwoordigt het gebied van belang benadrukt in deel B B) Vertegenwoordiger beeld van de ontvanger epitheelcellen bevatten infecteren capside assemblages (Zie ook aanvullende Movie 3). Paneel 1 is een samenvoeging van de verzonden en RFP kanalen. Paneel 2 is de RFP kanaal alleen. Paneel 3 is de RFP kanaal met een schematische weergave van de cel omtrek (stevige witte lijn), nucleus (hash witte lijn) en axonen (blauwe lijnen). Klik hier voor een grotere afbeelding te bekijken .
Aanvullende Movie 1. Software-instellingen voor een snelle, sequentiële verwerving van axonale virusdeeltjes. De stappen in verband met het bepalen van belichtingsinstellingen, configureren ND overname controles, en het verwerven van een snelle kader overname movie van fluorescerende virusdeeltjes ondergaan axonale transport wordt gepresenteerd. De SCG neuron cultuur was besmet met PRV 427 acht uur voorafgaand aan de beeldvorming. Klik hier om film te bekijken .
Aanvullende Movie 2. Software-instellingen voor overnachting beeldvorming van axon-tot-cel verspreiding. De stappen in verband met het configureren ND overname controles voor overnachting beeldvorming van axon-tot-cel verspreiding gebeurtenissen worden gepresenteerd. Klik hier om de film te bekijken .
Aanvullende Movie 3. Conversie van. Nd2 bestanden in presentabel filmformaten. De stappen in verband met het omzetten van de ruwe data. Nd2 bestanden in een van beide. Avi of. Mov-bestanden voor presentatie met behulp van gangbare video-spelers. Klik op haare naar de film te bekijken.
Aanvullende Movie 4. Live cell imaging van SCG axonen bij 8 uur na infectie met PRV 348. Klik hier om film te bekijken .
Aanvullende Movie 5. Grote beeldgebied overnachtende beeldvorming van axon-tot-cel verspreiding. Klik hier om film te bekijken .
Aanvullende Movie 6. Vergrote gebied van overnight timelapse beeldvorming van axon-tot-cel verspreiding. Klik hier om de film te bekijken .
| Spannen | Genotype | Utility |
| PRV 341 | GFP-US9 (membraan) / mRFP-VP26 (capside) Virion transport experimenten 11 | |
| PRV 348 | GFP-US9 (membraan) / GM-mCherry (membraan) | Virion transport experimenten 11 |
| PRV 427 | mRFP-VP26 (capside) / YFP-CAAX (cellulaire plasmamembraan) | Anterograde spread experimenten 10 |
Tabel 1. Nuttige recombinante PRV stammen die fluorescente fusieproteïne.
| Naam | Vennootschap | Catalogusnummer |
| 35 mm glazen bodem cultuur schotel | MatTek Corporation, Ashland, MA | P35G-1.5-20-C |
| 35 mm μ-Dish | Ibidi USA LLC, Verona, WI | 81156 |
| Microscoop lichaam | Nikon Instruments Inc | NiKon Eclipse Ti |
| Gemotoriseerde microscoop kruistafel | Voorafgaand Scientific; Rockland, MA | H117 ProScan Flat Top |
| Gemotoriseerde filter wielen | Voorafgaand Wetenschappelijke | HF110 10 positie filterwiel |
| Fluorescerende verlichtingsbron | Lumen Dynamics, Mississauga, Ontario Canada | X-Cite 120Q |
| Multi-band Fluorescentie filter sets | Chroma Technology Corp; Bellows Falls, VT | 89.000 Sedat Quad - ET 89.006 ECFP / EYFP / mCherry - ET |
| EM-CCD-camera | Andor Technology USA, South Windsor, CT | iXon3 897 |
| Chamlide podium top milieu-incubator | Wonen Cell Instrumenten; Seoel, Zuid-Korea | TC-L-10 |
| Objectief heater | Bioptecs; Butler, PA | 150803 Controller150819-12-08 Heater |
| Analyse software | Nikon Instruments Inc Melville, NY | NOS Elements |
Tabel 2. Specifieke reagentia en apparatuur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het doel van live cell imaging is het observeren van biologische processen zoals ze zich voordoen zonder significante verandering door de handeling van observatie. Dit doel wordt bereikt door het optimaliseren van drie variabelen: milieubeheer, snelheid van weergave en fluorescentieverlichting. Deze inter-afhankelijke variabelen moeten worden afgewogen om levensvatbare beeldvorming voorwaarden te bereiken. De protocollen gepresenteerd gebruik van specifieke voorwaarden aan de representatieve resultaten te produceren. We zullen kort milieucontroles en observationele schade te bespreken voordat waarin de specifieke methoden gepresenteerd.
Opzetten en onderhouden van relevante biologische omstandigheden op de microscoop is van cruciaal belang voor de succesvolle controle van cellulaire gebeurtenissen. Het bereiken doel omstandigheden is afhankelijk van een aantal variabelen specifiek voor de microscoop en incubator configuratie. Alle incubator instellingen moeten worden gevalideerd met behulp van een onafhankelijke temperatuurmeting van een mock monster in de incubator genomenop meerdere functies, waaronder: de bijzondere doelstelling contact, het midden van de kweekschaal en de rand van de kweekschaal. Instellingen worden geoptimaliseerd om gebieden die meer dan 1 ° C warmer minimaliseren dan 37 ° C en een temperatuur dichtbij 37 ° C op het punt van objectieve contact. Elke cultuur schotel en objectieve configuratie gebruikt voor beeldvorming moeten worden getest en gevalideerd voor experimenten. Idealiter zouden alle monsters gecontroleerd op temperatuur tijdens beeldvorming, maar dit blijkt onpraktisch voor een aantal systemen en wordt bemoeilijkt wanneer biologisch gevaarlijke stoffen worden toegepast. Validatie van incubatieomstandigheden is belangrijk omdat incuberen monsters te lage of te hoge temperatuur kan leiden tot artefacten results of snelle cellulaire degradatie.
Het identificeren en het minimaliseren van de resultaten die voortvloeien uit observationele schade is belangrijk voor protocolontwikkeling. Veelvuldig verlicht kan biologische processen, irr wijzigeneversibly inactiveren fluorescerende moleculen, of induceren een aantal cellulaire processen voor celdood. Validatie temperatuur belangrijk biologisch vergelijkbare omstandigheden on het podium top analoog aan die van een standaard weefselkweek incubator. Controle voor de effecten van veelvuldig verlicht is moeilijker en vereist vaak iteratieve trial and error praktijken. Het vergelijken van parallelle monsters in weefselkweek incubators voor morfologische verschillen of biologisch relevante wijzigingen bewaard kan bepalen of levend-cell imaging omstandigheden resulteert in aanzienlijke cellulaire toxiciteit. In de hier beschreven experimenten, hebben we de productiviteit van virale infectie gevolgd door virale titer en omvang van de virusverspreiding tussen cellen.
Het bereiken van real-time beeldvorming van snelle vervoer binnen axonen vereist het optimaliseren van het beeld overname snelheid langs de intensiteit van fluorescentie verlichting. De snelheid van de beeldvorming wordt bepaald door de camereen instellingen en de microscoop hardware, vooral bij het verzamelen van meerdere fluorescerende kanalen sequentieel. Verlichtingssterkte van invloed op de kwaliteit van de fluorescerende signalen en de snelheid van de overname. Greater lichtintensiteit vereenvoudigt visualisatie van fluorescerende eiwitten, met name voor diegenen die nemen in deeltjes in kleine hoeveelheden. Echter, zal bleekmiddel sneller en lijden aan verbeterde fototoxische schade het monster. Het verminderen van verlichting door middel van grijsfilters vereist langere belichtingstijden, het verminderen van de frequentie van de beeldopname en mogelijk veroorzaken van ruimtelijke vervorming van fluorescerende structuren vanwege hun beweging tijdens de detectie. Het vinden van de juiste balans van verlichtingssterkteverdeling met beeldverkrijgingstelsel frequentie sterk afhankelijk van de fluorescent proteïne signaal en de snelheid van de beweeglijkheid van de constructie bestudeerd. Het is alleen nodig om voldoende signaal naar de fluorescerende structuren onderscheiden boven de achtergrond verwerven, in plaatsproduceren van hoge contrast beelden die langere belichtingstijden nodig.
Overnachting Timelapse beeldvorming maakt gebruik van een soortgelijke hardwareconfiguratie als real-time live-cell imaging, maar wordt sterk beïnvloed door de geaccumuleerde foto-schade in verband met de lange termijn, veelvuldige fluorescentie verlichting. In tegenstelling tot de real-time beeldvorming, de noodzaak om de fluorescentie-intensiteit verlichting beperken van het grootste belang, en alle andere variabelen worden aangepast om rekening te houden met deze beperking. Het beperken van de intensiteit van de blootstelling zorgt voor meer frequente verlichting van meerdere fluorescerende kanalen zonder noemenswaardige schade aan de verbeelde cellen. Anterograde axon-cel verspreiding gebeurtenissen zijn tijd en ruimte ongelijksoortige, dus beeldvorming een groot gebied is van essentieel belang om zoveel mogelijk van deze zelden voorkomende gebeurtenissen mogelijk vast te leggen.
Een aantal publicaties hebben grondige overzichten en aanbevelingen voor live cell imaging praktijken 24-26. De protocollen die hier worden beschreven Represent onze beste pogingen om de gevolgen van fluorescentie beeldvorming op virale replicatie, vervoer, en de verspreiding te beperken met behoud van de essentiële kenmerken van virale infectie. De combinatie van deze protocollen met de zorgvuldige ontwikkeling van fluorescente fusie-eiwitten en robuuste neuronale culturen is mijn fundamentele vragen van het herpesvirus infectie en pathogenese beantwoord.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Wij hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
LWE en RK worden ondersteund door de US National Institutes of Health beurzen R37 NS033506-16 en R01 NS060699-03. MPT werd ondersteund door een American Cancer Society Postdoctoraal Research Fellowship (PF-10-057-01-MPC). Het advies en de kennis van dr. Matthew Lyman en Dr Oren Kobiler waren instrumentaal in het ontwerpen van de microscoop configuratie en live cell imaging methoden. Ook dank aan Neal Barlow en Brian T. Kain van Nikon Instruments voor hun technische bijstand bij de aanschaf, installatie en performance van de microscoop.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm glass bottom culture dish | MatTek Corporation; Ashland, MA | P35G-1.5-20-C | |
| 35 mm μ-Dish | Ibidi USA LLC, Verona, WI | 81156 | |
| Microscope body | Nikon Instruments Inc. | Nikon Eclipse Ti | |
| Motorized microscope X-Y stage | Prior Scientific; Rockland, MA | H117 ProScan Flat Top | |
| Motorized filter wheels | Prior Scientific | HF110 10 position filter wheel | |
| Fluorescent illumination source | Lumen Dynamics; Mississauga, Ontario Canada | X-Cite 120Q | |
| Multi-band Fluorescence filter sets | Chroma Technology Corp.; Bellows Falls, VT | 89000 Sedat Quad - ET 89006 ECFP/EYFP/mCherry - ET | |
| EM-CCD camera | Andor Technology USA; South Windsor, CT | iXon3 897 | |
| Chamlide stage top environmental incubator | Live Cell Instruments; Seoul, South Korea | TC-L-10 | |
| Objective lens heater | Bioptecs; Butler, PA | 150803 Controller 150819-12-08 Heater | |
| Analysis software | Nikon Instruments Inc.; Melville, NY | NIS Elements |
References
- Johnson, D. C., Baines, J. D. Herpesviruses remodel host membranes for virus egress. Nature reviews. Microbiology. 9 (5), 382-394 (2011).
- Mettenleiter, T. C., Klupp, B. G., Granzow, H. Herpesvirus assembly: a tale of two membranes. Current Opinion in Microbiology. 9 (4), 423-429 (2006).
- Saksena, M. M., Wakisaka, H., et al. Herpes simplex virus type 1 accumulation, envelopment, and exit in growth cones and varicosities in mid-distal regions of axons. Journal of Virology. 80 (7), 3592-3606 (2006).
- Snyder, A., Wisner, T. W., Johnson, D. C. Herpes Simplex Virus Capsids Are Transported in Neuronal Axons without an Envelope Containing the Viral Glycoproteins. Journal of Virology. 80 (22), 11165-11177 (2006).
- Snyder, A., Polcicova, K., Johnson, D. C. Herpes simplex virus gE/gI and US9 proteins promote transport of both capsids and virion glycoproteins in neuronal axons. Journal of Virology. 82 (21), 10613-10624 (2008).
- Tomishima, M. J. A conserved alpha-herpesvirus protein necessary for axonal localization of viral membrane proteins. The Journal of Cell Biology. 154 (4), 741-752 (2001).
- Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. G. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nature Methods. 9 (2), 152-158 (2012).
- Kratchmarov, R., Taylor, M. P., Enquist, L. W. Making the case: Married versus Separate models of alphaherpes virus anterograde transport in axons. Reviews in Medical Virology. 22 (6), 378-391 (2012).
- Antinone, S. E., Smith, G. A. Two modes of herpesvirus trafficking in neurons: membrane acquisition directs motion. Journal of Virology. 80 (22), 11235-11240 (2006).
- Del Rio, T., Ch'ng, T. H., Flood, E. A., Gross, S. P., Enquist, L. W. Heterogeneity of a fluorescent tegument component in single pseudorabies virus virions and enveloped axonal assemblies. Journal of Virology. 79 (7), 3903-3919 (2005).
- Taylor, M. P., Kramer, T., Lyman, M. G., Kratchmarov, R., Enquist, L. W. Visualization of an alphaherpesvirus membrane protein that is essential for anterograde axonal spread of infection in neurons. mBio. 3 (2), (2012).
- Taylor, M. P., Kobiler, O. Alphaherpesvirus axon-to-cell spread involves limited virion transmission. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2012).
- Kobiler, O., Brodersen, P., Taylor, M. P., Ludmir, E. B., Enquist, L. W. Herpesvirus replication compartments originate with single incoming viral genomes. mBio. 2 (6), (2011).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
- Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide. Trends in Cell Biology. 19 (11), 649-655 (2009).
- Ch'ng, T. H., Flood, E. A., Enquist, L. W. Culturing primary and transformed neuronal cells for studying pseudorabies virus infection. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). , 292-299 (2005).
- Curanovic, D., Ch'ng, T. H., Szpara, M., Enquist, L. Compartmented neuron cultures for directional infection by alpha herpesviruses. Current protocols in cell biology. Chapter 26 (Unit 26.4), (2009).
- Zareen, N., Greene, L. A. Protocol for culturing sympathetic neurons from rat superior cervical ganglia (SCG). J. Vis. Exp. (23), e988 (2009).
- Ch'ng, T. H., Enquist, L. W. Neuron-to-Cell Spread of Pseudorabies Virus in a Compartmented Neuronal Culture System. Journal of Virology. 79 (17), 10875-10889 (2005).
- Campenot, R. B., Lund, K., Mok, S. -A. Production of compartmented cultures of rat sympathetic neurons. Nature Protocols. 4 (12), 1869-1887 (2009).
- Kramer, T., Greco, T. M., Taylor, M. P., Ambrosini, A. E., Cristea, I. M., Enquist, L. W. Kinesin-3 Mediates Axonal Sorting and Directional Transport of Alphaherpesvirus Particles in Neurons. Cell Host & Microbe. 12 (6), 806-814 (2012).
- Smith, G. A., Gross, S. P., Enquist, L. W. Herpesviruses use bidirectional fast-axonal transport to spread in sensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3466 (2001).
- Kramer, T., Enquist, L. W. Alphaherpesvirus Infection Disrupts Mitochondrial Transport in Neurons. Cell Host & Microbe. 11 (5), 504-514 (2012).
- Swedlow, J. R., Platani, M. Live cell imaging using wide-field microscopy and deconvolution. Cell Structure and Function. 27 (5), 335-341 (2002).
- Kaech, S., Huang, C. F., Banker, G. Short-Term High-Resolution Imaging of Developing Hippocampal Neurons in Culture. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (3), (2012).
- Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy - tips and tools. Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).
