Summary
Изображений живых клеток инфекций alphaherpes вируса позволяет анализ динамики событий направленного транспорта и межклеточного распространения. Здесь мы представляем методики, которые используют рекомбинантные вирусные штаммы, экспрессирующие флуоресцентных белков слияния для облегчения визуализации сборки вирусной инфекции во время первичных нейронов.
Abstract
Прогресс в живой клетке флуоресценции микроскопии, а также конструирование рекомбинантных вирусных штаммов, экспрессирующих флуоресцентные белки слияния позволили визуализации в реальном времени транспортировки и распространение вирусной инфекции alphaherpes нейронов. Полезность новых флуоресцентных слитых белков вирусной мембраны, оболочки, и капсид, в сочетании с изображений живых клеток, которые были определены сборки вирусной частицы проходят транспорта в пределах аксонов. Похожие инструменты были успешно использованы для анализа межклеточных распространения вирусных частиц для количественной оценки количества и разнообразия вирионов передается между клетками. Важно отметить, что методы изображений живых клеток антероградной транспорта и распространением производят огромное количество информации, включая перенос частиц скоростей, распределение частиц, и временной анализ локализации белков. Наряду с классическими методами вирусного генетического, эти методологии обеспечили критические идеив важные механистической вопросы. В этой статье мы подробно описать методы визуализации, которые были разработаны, чтобы ответить на основные вопросы alphaherpes транспорта вирусов и распространения.
Introduction
Инфекция периферической нервной системы (ПНС) на alphaherpes вирусов, таких как вирус простого герпеса (ВПГ) -1, -2, и вирус псевдобешенства (PRV) включает в себя несколько сложных и строго регулируется шаги в течение жизненного цикла вируса. Транспортировка в нейроны ПНС имеет решающее значение во время событий первичной вирусной инфекции и последующего между хозяином распространения. Молекулярных механизмов, которые регулируют два компонента жизненного цикла вируса, направленного транспорта вирусной сборки от клеточных тел в аксоны (антероградной транспорта) и последующей передачи вирионов в чувствительные клетки (антероградной распространению) имеют важное значение для понимания патогенеза вируса герпеса.
Транспорта и выход вирусных частиц в нейронах зависит от сборки зрелых инфекционных 1,2 вириона. Ранее фиксированная анализов, в том числе иммунофлюоресценции (ИФ) и электронной микроскопии (ЭМ), были использованы для изучения состояния частиц сборки и протЭйн-взаимодействий, связанных с транспортом и распространении вириона 3-6. Однако динамичный характер транспортировки вирионов и экспериментальные артефакты введен химической фиксации посрамлены интерпретации неподвижных изображений в 7,8. В последнее время количество вирусных-флуоресцентных слитых белков были описаны для HSV и PRV, которые имеют незначительное воздействие на функцию белка. Зеленого флуоресцентного белка (GFP) и красного флуоресцентного белка (mCherry или MRFP) флуорофоров часто в паре, чтобы позволить отображение двух из трех структурных компонентов зрелых вирионов: капсид, оболочки и гликопротеин 9-11. Живых изображений сотовый антероградной транспорта с использованием двойного меченых вирусов визуализирует состояние сборки вирусных частиц во время транспортировки. Похожие флуорофором выразив вирусные штаммы используются для визуализации число и разнообразие вирусных геномов после распространения 12,13. Свойств флуоресцентных белков (см. обзор в 14,15) в значительной степени влияютвозможность визуализации вирусными или клеточными сборок. Внутренние свойства флуоресцентного белка, в том числе самостоятельно взаимодействий и стабильности, следует учитывать при разработке и тестировании нового белка слияния для сохранения дикого типа функциональности.
В сочетании с флуоресцентным белком слияния, два хорошо известных в системах пробирке культуру клеток используют для изображений живых клеток герпетической инфекции: диссоциированными 16 и разобщенным 17 (рис. 1А) крысы верхний шейный ганглий (SCG) нейронов. В обеих системах, эмбриональные SCG являются рассеченные, диссоциирован на одну клетку тела, и высевают для культивирования в пробирке 18. SCG нейронов являются частью вегетативной нервной системы и могут быть легко культивировать и дифференцированы по нейронной фактора роста (NGF) в зрелую поляризованного естественных условиях бывшего государства. Диссоциированных нейронов SCG образуют разветвленную сеть аксонов, который позволяет Fили визуализации вирусные частицы, поскольку они подвергаются антероградной транспорта 6. Разобщенным SCG культур обеспечивают гидравлической изоляции нейронов клетки тела (S ящиком) и дистальных концах аксона (N ящиком) 19. Ряд подробных протоколов для построения и использования обособленных нейронов с использованием оригинальных 20 или модифицированный Campenot камер 17 были опубликованы ранее. Гидравлической изоляции обеспечивает селективное инфекции тела нейронов и обнаружение вирионы потомства после транспортировки к изолированным концах аксона. Покрытие эпителиальных клеток над Термини до инфицирования обеспечивает клетки-реципиента для распространения вирусной инфекции.
Есть много важных элементов, важных для всех живых изображений экспериментов клетки, но наиболее актуальными для нашей протоколы: автоматизированный сбор изображений, флуоресцентное освещение, скорость визуализации и экологического контроля. Для всех изображений экспериментов, мы используемперевернутый, автоматизированные, эпифлуоресцентной микроскопом освещения (рис. 1В). Микроскоп построена вокруг Nikon Затмение Ti базы и использует ряд контролируемых компьютером моторизованных систем быстро перенастроить микроскопом во время автоматизированного захвата изображений. Для флуоресцентной подсветкой, мы используем широкий спектр ртутных ламп, которые могут быть ослаблены с фильтры нейтральной плотности вдоль освещения пути. Возбуждение фильтры ограничивают спектр флуоресцентного освещения и когда в паре с многоходовой дихроичных зеркал и флуоресцентных фильтров выбросов визуализировать конкретные флуоресцентные соединения. Возбуждения и излучения фильтры установлены в независимое, быстрое переключение фильтра колеса для быстрого последовательного приобретения различных флуоресцентных каналов. Скорость получения изображения еще более усиливается с чувствительной и быстрой EM-CCD камеры, полезны для обнаружения сигналов низкой интенсивности и малой изображение время чтения. Экологический контроль на MicroscОПЕ достигается со сценой верхней нагревается инкубатора и объективной линзы нагреватель для поддержания образцов при повышенных температурах при влажной и CO 2 атмосфере, обогащенной передается в инкубаторе. Микроскоп хранится в затемненной комнате с температурой окружающей среды поддерживается около 25 ° C и внешнего освещения минимизированы плотные шторы на всех окнах. Следующие протоколы описывают использование этой системы для антероградной транспорта и распространение анализов.
Число альтернатив существуют для контроля за переменными изображений живых клеток. Контролем микроскопа настройки может быть выполнена вручную или с помощью автоматических систем зависит от собственного программного обеспечения. Флуоресценция освещения может быть достигнута галогеном, светодиод или лазерных источников. Скорость визуализации модифицируют скорость переключения фильтра и время вывода сигнала с парными системы обнаружения. Экологический контроль может быть достигнут с специализированное оборудование на Мимикроскопе этапе, закрытый со всех или части микроскопа в подогретый и увлажненный ящика, или путем повышения температуры в помещении, где микроскопии будет выполнена. Каждый из этих вариантов имеет свои преимущества и недостатки, связанные с затратами и производительностью.
В последующем протоколе, мы подробно использование изображений живых клеток для изучения быстрого антероградной транспорта и антероградной alphaherpes распространение вирусов с использованием рекомбинантных вирусных штаммов. В режиме реального времени изображений живых клеток визуализирует капсида, оболочки, и / или гликопротеина совместной локализации на динамических структурах проходят аксоны транспорта в пределах 11. Ночевка интервальная съемка изображений из обособленных нейронов культур визуализирует аксональное выхода вирионов и заражение восприимчивых клетках 12. Протоколы, представленные здесь, были оптимизированы для использования с нашей конкретной системы визуализации, но представлены в широком смысле по отношению к четырем элементам изображений живых клеток. В ходе обсуждения мыбудет более подробно некоторые оптимизации, которые необходимы для успешного экспериментирования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Раздел 1 - Условия окружающей среды управления для живых клеток флуоресцентной микроскопии
- За 30 мин до любого изображения эксперимента подключить и начать потепление столике микроскопа верхней инкубатора.
- Включите микроскоп проходящего и epifluorescent источников света, и автоматизированное управление оборудованием. Открытое программное обеспечение управления микроскопом, NIS Elements, для подключения к микроскопу и начинают охлаждение EM-CCD камерой.
- Прикрепите объектив теплее соответствующих целей (либо 60X или 100X иммерсионное масло). Примечание: Выбор объектива основана на эксперименте типа. 100X дифференциального интерференционного контраста (DIC) является лучшим для отслеживания транспортировки антероградной сборки вирионов в то время как цель 60X фаза подходит для визуализации антероградной распространения. Меньшем увеличении, ненефтяной целей погружения не потребуется объектив теплее, поскольку они не прямой контакт с образцом.
- Прикрепите верхнюю ступень инкубатора на моторизованных этапе миль микроскопе. Обеспечить надлежащее вставку, который будет содержать образец находится в месте. Прикрепить увлажненный воздух из линии управления инкубатора на входной порт на сцене верхней инкубатора.
- Включите инкубатор и объектива теплее управления и отрегулируйте температуру настройки ранее проверены условия, характерные для объективного и изображаемого образца (см. обсуждение).
- Откройте клапан на 5% CO 2/95% атмосферных бак обеспечить CO 2 дополнен воздуха на сцене верхней инкубатора. Скорость потока должна быть в пределах от 60 до 80 мл газа в минуту. Ускорение темпов приведет к обширным обезвоживание образца, несмотря на увлажнение камеры.
- Добавить линзы нефтепродуктов на объектив и сразу же поместить культуру, которая будет изображена в стадию Топ инкубатора.
- Разрешить уравновешивания температуры в культуре в течение как минимум 10 мин. Один час является предпочтительным, особенно на ночь визуализации описаны в разделе 3.
- Шесть-восемь часов до обработки изображений, заражают 35 мм покровным дном тарелки зрелого, диссоциированных нейронов SCG 1 × 10 6 бляшкообразующих единиц вируса интереса (см. Таблицу 1, например, вирусов) по методу, описанному в Тейлор и др. др.. 2012a 11. Если тестирование более одного вируса, смещенной прививки на 30-60 мин, чтобы обеспечить визуализацию последовательных образцах при аналогичный после инфекции раза.
- Вставьте блюдо в стадию Топ инкубаторе в течение как минимум 10 минут перед запуском любой эксперимент. В то время как температура в равновесие, фокальной плоскости сдвига и окажет негативное воздействие на любые изображения экспериментов.
- Использование проходящем свете и окуляр микроскопа, найти клетку тела нейронов, которая имеет четко изолированы аксональное расширение. Вместо этого можно использовать соответствующие флуоресценции освещения найти клетки, экспрессирующие обнаруженияТаблица количества флуоресцентных белков. Важно, чтобы ограничить воздействие на образец флуоресцентного освещения, на этом этапе и последующих шагах, из-за света индуцированной повреждением клеток и отбеливания флуоресцентные белки.
- Ослабление флуоресценции освещения для снижения интенсивности возбуждающего света, к которому клетки подвергаются. Engage ослабления света нейтральной плотности (ND) фильтры в пути света флуоресценции освещения. Для фильмов продолжительностью более 1 мин, минимум ND4 должна быть использована для предотвращения фото-отбеливание флуоресцентных белков и обширная фото-повреждение аксонов. Высоко флуоресцентные структуры как правило, может быть визуализированы с ND8 фильтр на место.
- Использование программного обеспечения микроскопа (рис. 2 и дополнительные Фильм 1А), переключение света путь к EM-CCD камерой.
- Определить оптимальные сроки обработки изображений и условия для каждого флуоресцентного канала.
- Инициировать окно реального изображения, используя кнопку "Играть". </ Li>
- Определить оптимальные параметры экспозиции камеры для каждого флуоресцентного белка. Не превышать 300 мс на канал в качестве двигательного аберраций быстро движущихся структур вириона произойдет. Использование усиления ЭМ камеру к установке 300 (рекомендованная производителем максимальное усиление), для минимизации воздействия времени и улучшения обнаружения тусклых сигналов. Правильное время экспонирования должно получить изображение с низкой интенсивностью фон и высокие специфические сигналы.
- После установки экспозиции и найти хорошо определенной области аксона, программное обеспечение должно быть сконфигурированы для выполнения автоматизированного захвата изображений. Остановить окна живых изображений, чтобы предотвратить образца отбеливания.
- В программное обеспечение NIS Elements, выберите 6D - определение / Выполнить эксперимент приложения из "Приложения" выпадающего меню.
- В окне приобретения Н.Д., перейдите на вкладку Время которое определит частоту получения изображений. Установить интервал "Без задержки" и продолжительностью до 5 мин. Thэлектронной обеспечение будет приобрести изображение фиксируется максимальной частоты для продолжительностью 5 мин.
- Выбор "Lambda" на вкладке, который дает возможность выбора заданной аппаратной конфигурации, используемые для нескольких флуоресцентных захвата изображений. Нажмите на первом боксе и в последующем выпадающее меню, чтобы выбрать подходящую конфигурацию оборудования. Повторите для всех флуоресцентных белков для включения в образ.
- Убедитесь, вкладки для "Позиции XY", "Z-серии» и «Большие изображения" не выбраны.
- Над вкладками, выберите флажок "Сохранить в файл", чтобы автоматически сохранять изображения на жесткий диск во время сбора. Настройте расположение и имя файла выходного файла эксперимента. В последовательном Эксперименты выполнены, программное обеспечение будет добавить порядковый номер в конце назначенного файла.
- После того как все вкладки были выбраны. Начать эксперимент, нажав кнопку "Run-сейчас".
- Оптимизации скорости получения изображений через настройки экспозиции и мнимойРазмер E. С помощью небольшой области изображения-области будет в состоянии позволить сократить время частота кадров приобретения. Определить области интереса помощи функции ROI в NIS-Elements, выбрав район между 25% и 50% от общей площади изображения. Кроме того, сокращение времени экспозиции увеличится частота кадров приобретения, но снижает качество сигнала (см. обсуждение).
Раздел 3 - Ночь Покадровый Визуализация антероградной События Spread
- Четыре часа до изображений, заразить разобщенным нейронов культуры построена на 35 мм μ-Блюдо. Инокулируйте тела нейронов с 1 × 10 6 бляшкообразующих единиц вируса интереса (см. Таблицу 1, например, вирусов) по методу, описанному в Taylor и соавт. 2012b 12.
- Аккуратно культуры блюдо в стадию Топ инкубатора. Убедитесь, что положение цели установлен на стороне тарелки. Медленно довести цель в фокус, обеспечеING цель не толкает вверх в образце. После того как фокусировка поле было определено, медленно перемещать цель в центр чашки, около внутреннего барьер демаркации внутренней стороне аксон отсека. Во время движения, обеспечения глубины фокуса поддерживается и не подталкивать вверх в образце. Прогиб пластиковой поверхности объективной приведет к повреждению аксонов и пластика.
- Добавить приблизительно 2 мл теплой (~ 37 ° C), забуференный фосфатом физиологический раствор в чашку с культурой снаружи кольца тефлона. Это окружает нейронов культуры с кольцом PBS, чтобы минимизировать образец обезвоживание и обеспечивают теплоизоляцию.
- Разрешить температуры для уравновешивания в течение минимум 1 час до начала автоматизированного захвата изображений (3.8). Шаги 3.5 через 3,7 может быть настроен в это время.
- Ограничить интенсивность освещения до минимально возможного уровня, привлекая все фильтры нейтральной плотности. Это позволит частые захвата изображений ОвеR длительного периода времени без чрезмерного фото-повреждения. Сокращение освещения приведет к низким отношением сигнал, требующий более длительных экспозиций (см. обсуждение).
- Использовать исторические настройками экспозиции или до экспериментальной установки генерировать параллельные блюдо зараженных эпителиальных клеток, экспрессирующих целевые флуоресцентные белки установить параметры экспозиции, как описано в разделе 2.5.
- После установки экспозиций для необходимых каналов, настало время для настройки программного обеспечения для автоматизированного захвата изображений. Остановить окна живых изображений ограничить образца отбеливания.
- В программных элементов (рис. 2 и дополнительные фильм 2), выберите 6D - определение / Выполнить эксперимент приложения из "Приложения" выпадающего меню, чтобы открыть окно ND Приобретения.
- В окне Приобретение Н.Д., перейдите на вкладку Время. Установить интервал "5 мин". Установить срок до 20 часов. Поле петель будут автоматически рассчитаны на количество повторений Prograм будет выполнять.
- Выберите "Лямбда" на вкладке. Нажмите на первом боксе и в последующем выпадающем меню выберите соответствующую конфигурацию лямбда для фазового контраста. Повторите эти действия для последующей позиции, выбрав соответствующие конфигурации для каждого флуоресцентного белка для включения в образ.
- Выберите "Большие изображения" на вкладке, которая определяет параметры нескольких изображений должны быть объединены в один большой поля зрения. Хорошего размера области состоит из 5 х 2 изображения с помощью 7% перекрытием строчкой. Это позволит обеспечить максимальное число клеток в положение для включения в образ, не влияя на частоту получения изображений. Кроме того, снимите флажок "Закрыть активным затвором во время Сценическое движение». Эта опция повышает скорость приобретения не закрывая ставни между изображениями.
- Выбор "XY позиции" вкладку для идентификации нескольких позициях, которые будут последовательно отображается в параллельном ходе ночной фильма. Выбор позиций, которые определяют центр РоINT для каждой большой площади изображения. Выберите 6-8 положение изображения в образце. Хороший район изображение будет иметь небольшие скопления клеток в тесном прикладывание к четко определенной аксонов. Клетки не должны быть сложены друг на друга и аксон комплектации должны быть минимизированы. Точки фокусировки является ядро клетки. Установите цель таким образом, что четко определены ядерной оболочки видно для большинства клеток.
- Убедитесь, что "Z-серии" на вкладке снят.
- Настройте автоматическое сохранение функции, как описано выше в разделе 2.6.5.
- Проверьте экспозицию и положение настройки, нажав "1 петле времени". Оцените полученные изображения для нижней подсветкой свет, фокус, и кадрирования. Если фокус сместился, сбросить фокус для каждой позиции на вкладке XY. Подождите 10 минут и повторите этот шаг, пока фокус не будет стабильным.
- После выполнения всех настроек были проверены и испытаны, инициировать автоматизированного эксперимента, нажав кнопку "Запустить сейчас".
Раздел 4 - Обработка изображений и экспорт
Экспорт данных
- Наборы данных, полученных в ходе живых клеток изображений транспорта или распространение события должны быть экспортированы из программных элементов в NIS часто используемые типы файлов для последующего использования в презентациях и публикациях (Справочная Фильм 3). Чтобы экспортировать фильмы открыть соответствующий сырой. Nd2 файла в элементах NIS и выберите "Split-компонент" целью визуализировать желаемое флуоресцентных каналов. Воспроизведение файлов с подходящей скоростью; 5 кадров в секунду является хорошей отправной точкой для визуализации быстрого транспорта.
- Содержат временную метку, чтобы представить часы реального времени во время воспроизведения видеозаписи. Щелкните правой кнопкой мыши на изображении и выбрать, добавить ND-информации. Цифровой счетчик появится в верхнем левом углу.
- Редактировать метки времени для отображения информации. Щелкните правой кнопкой мыши на прилавке и выберите Редактировать ND-информации. В последующие всплывающем окне, редактировать текст, отражающий томографаминг параметров, которые важны. Изменить шрифт, цвет и размер для ясности.
- Перейти в меню "Правка" и найти "Создать вид снимок" или нажмите клавишу "X" ключ. Эта команда открывает »взгляд снимок" окна. Выбор "применяется ко всем кадрам", чтобы генерировать 8-битных, RGB, экспорт готовый файл, содержащий флуоресцентный каналов из всего фильма.
- Сохранить как. AVI файлов для кросс-платформенной совместимости. Установка скорости воспроизведения при 200 мс на кадр. . AVI файлы, порожденные элементами NIS может быть дополнительно сжимается с другим программным обеспечением преобразования в нужный тип файла.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Антероградный транспорта
Применения настоящего Протокола к инфекциям диссоциированных культурах с SCG PRV 348, рекомбинантный штамм PRV выражения GFP-US9 и GM-mCherry белки слияния мембран, способствовал визуализации антероградной транспорта вирионов (рис. 3 и 4 Справочная фильма). Включение этих слитых белков в вирусные частиц приводит к их обнаружение на транспортировку Puncta, и вышеупомянутые условия визуализации минимизировать смещение каждого флуорофора на движущуюся частицу во время переключения фильтра. В трех минутах изображения окна, многочисленные транспортировки Puncta обычно наблюдаются и больших размеров выборки для колокализации анализы быстро произведенной. Ранее мы уже количественно колокализации GFP-US9, вирус alphaherpes аксональное таргетинга белка, с другими структурными белками использовании этого подхода 11. Аналогичный анализ других двойных recombinanт PRV штаммы были также описаны 11, и недавно было документировано совместно транспортных белков PRV с флуоресцентно меченого белка хозяина двигатель в дальнейшее расширение этого протокола 21. Используя быстрое переключение фильтра колес и парных многоходовой дихроичных зеркал обеспечивает быстрое последовательное получение двух или более флуоресцентных каналов. Мы в настоящее время может достичь двух-канального последовательного приобретения со скоростью до 0,8 кадров в секунду. Для одного микроскопии видео канал, который ограничен только флуоресценции время экспозиции и чтения времени на камере, мы можем достичь приобретения скорости более 6 кадров в секунду.
Антероградный Spread
Для визуализации событий антероградной распространения, области, представляющие интерес визуализируются каждые 5 до 10 мин в течение 20 часового периода, в течение которого вирионов будет транспортировать вниз и выход из аксонов, заражая соседние эпителиальных клеток. Представитель кадр из большого изображенияпредставлена на рисунке 4A и дополнительные Фильм 5. Обратите внимание на пространственно разделенных природы флуоресцентного белка экспрессирующих клеток свидетельствует о первичной инфекции от аксонов. Инфицированные клетки могут быть отслежены в обратном направлении во время фильма, чтобы визуализировать флуоресцентный капсид, который инициировал вирусной инфекции. Эти отдельные клетки могут быть выделены из большого кадра и отслеживаться без существенной потери детализации. Представитель кадра (фиг.4В) от дополнительного фильма 6 изображает времени после вирионов сдали на хранение флуоресцентный капсида в цитоплазму.
Анализ данных
Диапазон различных анализов могут быть выполнены на живых клеток изображений наборов данных, включая частицы слежения, колокализации исследований и количественное определение события вириона распространения. Мы часто выполняем наши анализы непосредственно в программное обеспечение NIS Elements или использованием подключаемого модуля расширения доступны для ИмаГэй программный пакет, который позволяет. nd2 типа файлов поддержки. Различные гипотезы и экспериментальные установки необходимых уникальных аналитических методов. Наша группа описанных методов оценки колокализации флуоресцентных белков на динамических структурах 11,21 и покадровой количественной оценки отдельных частиц распространение событий 10,12,22. Методологий описать в этой рукописи и наши предыдущие исследования являются гибкими и могут быть применены к различным вирусным инфекциям, а также транспорта клеточных структур, например митохондрий 23.
Рисунок 1. Схема микроскопии создан для изображений живых клеток. А) типы культуры, используемые для исследования антероградной транспорта (диссоциированных) и антероградной распространение (камерные) соответственно. Панель 1 Фаза контраст образ зрелой, диссоциированных верхних шейных ганглиев (SCG). Панель 2 представляет собой схематическое изображение системы разобщенным культуры, изображенный на панели 3 с SCG нейронов помещали в левый отсек с аксонального проекции расширения под внутренними барьерами в крайнем правом отсеке. B) перевернутой epifluorescent микроскопа и этап конфигурация верхней инкубатор использованы для экспериментов видеомикроскопии. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Рисунок 2. NIS-Elements программным интерфейсом. Скриншот стандартного интерфейса пользователя в NIS-Elements отображается. Воспроизведение и остановка кнопки управления живыми окна изображения изображающие текущей конфигурации оборудования для работы с изображениями, а также то, что в настоящее время в образ. В верхней панели ряд оптических конфигураций, реализующих заданный аппаратным SEфитинги для настройки микроскопа для транс-освещенных или флуоресценции. Управление камерой и экспозиции позволит конфигурировать камеру обнаружения для оптимизации качества изображения и скорости. Все эксперименты координируются с помощью элементов управления ND Приобретения. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Рисунок 3. Живых изображений сотовый СКГ аксонов в 8 ч после инфицирования PRV 348. PRV 348 инфицированных нейронов выразить GFP-US9 и GM-mCherry белки слияния мембран. Антероградный-транспортных структур в дистальных аксонов визуализируются в двух флуоресцентных каналов, GFP и mCherry. Антероградной-транспортной структуры (белые стрелки) прогрессирует в течение аксонов, как показано на последовательных изображений, полученных от Справочная кино 4. Двух флуоресцентных белков spatiсоюз зачета из-за последовательного приобретения флуоресцентных каналов и быстрое движение вирусных структур. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Рисунок 4. Ночевка интервальная съемка изображений антероградной событий распространение с зараженного аксоны к кластерам эпителиальных клеток во время многоцветной инфекции. Представитель изображения с единой позиции, большое изображение плиточные покадровой фильм вириона передачи от инфицированной PRV 427 аксонов в принимающие эпителиальных клеток.) объединенного изображения передаваемого, YFP и RFP флуоресцентные изображения на инфекцию время поста, где клетки-реципиенты начинают выражать YFP-CAAX и VP26-MRFP слитых белков. Во второй панели, YFP и RFP каналы показаны вместе. Обратите внимание на большое количество MRFP Puncta Assoные с аксона путей. Они собрались вирионы проходят перевозки на большие расстояния в пределах аксонов (Справочная Фильм 2). Белая коробка представляет прочих интересных показано в разделе B. B) представитель образ получатель эпителиальных клеток, содержащих заражение сборки капсида (См. также Справочная Фильм 3). Панель 1 слияния проходящей и RFP каналов. Панель 2 канала RFP одиночку. Панель 3 канала с RFP схематическое представление ячейки контура (сплошная белая линия), ядро (хэшируется белая линия), а аксоны (синие линии). Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Справочная Фильм 1. Настройка программного обеспечения для быстрого и последовательного приобретения аксонов вирионов. Шаги, связанные с определением параметров экспозиции, настройка управления ND приобретение, и приобретение быстрым кадра приобретения MoVIE флуоресцентных вирионы проходят аксональное транспорт представлен. Культуру нейронов SCG была заражена PRV 427 восемь часов до визуализации. Щелкните здесь для просмотра фильма .
Справочная Фильм 2. Настройка программного обеспечения для ночных изображений аксона к клетке распространения. Шаги, связанные с настройкой управления ND приобретением для ночных изображений аксона к клетке событий распространением представлены. Нажмите здесь, чтобы посмотреть фильм .
Справочная Фильм 3. Конверсия. Nd2 файлов в форматах фильмов презентабельно. Шаги, связанные с преобразованием исходных данных. Nd2 файлы в любую. Или AVI. Форматах MOV файлов для презентации с использованием общих видеоплееры. Нажмите ееэлектронной для просмотра фильма.
Справочная кино 4. Живых изображений сотовый СКГ аксонов в 8 ч после инфицирования PRV 348. Нажмите здесь, чтобы посмотреть фильм .
Справочная Фильм 5. Большая площадь образ ночь визуализации аксона к клетке распространения. Нажмите здесь, чтобы посмотреть фильм .
Справочная Фильм 6. Увеличенная площадь овернайт интервальная съемка изображений аксона к клетке распространения. Нажмите здесь, чтобы посмотреть фильм .
| Напрягаться | Генотип | Утилита |
| PRV 341 | GFP-US9 (мембраны) / MRFP-Vp26 (капсида) Вирион транспортных экспериментов 11 | |
| PRV 348 | GFP-US9 (мембраны) / GM-mCherry (мембрана) | Вирион транспортных экспериментов 11 |
| PRV 427 | MRFP-VP26 (капсида) / YFP-CAAX (сотовой плазмы мембраны) | Антероградный эксперименты распространение 10 |
Таблица 1. Полезная рекомбинантных штаммов PRV выразив флуоресцентных белков слияния.
| Название | Компания | Номер по каталогу |
| 35 мм со стеклянным дном культуры блюдо | Маттек Corporation; Ashland, MA | P35G-1.5-20-C |
| 35 мм μ-Блюдо | ООО Ibidi США, Верона, WI | 81156 |
| Микроскоп тела | Nikon Instruments Инк | NiКон Затмение Ti |
| Моторизованный столик микроскопа XY | До Научно; Rockland, MA | H117 ПроСкан Flat Top |
| Моторизованный фильтр колес | До Научные | HF110 10 позиция колесо фильтров |
| Флуоресцентные источника освещения | Lumen динамики; Торонто, Онтарио Канада | X-Cite 120Q |
| Multi-ценция наборы фильтров | Chroma технологий корпорации; Bellows Falls, Вермонт | 89000 Sedat Quad - ET 89006 ECFP / EYFP / mCherry - ET |
| EM-CCD камеры | Андор технологий США; South Windsor, CT | iXon3 897 |
| Chamlide стадии верхнего экологические инкубатор | Живая клетка инструментов; Сеул, Южная Корея | TC-L-10 |
| Цель обогреватель объектива | Bioptecs; Батлер, PA | 150803 Контроллер150819-12-08 нагревателя |
| Анализ программного обеспечения | Nikon Instruments Инк; Melville, NY | NIS Elements |
Таблица 2. Специфических реагентов и оборудования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Цель изображений живых клеток наблюдает биологические процессы, как они происходят без существенного изменения актом наблюдения. Эта цель достигается за счет оптимизации трех переменных: экологический контроль, скорость обработки изображений, и флуоресцентной подсветкой. Эти взаимозависимые переменные должны быть сбалансированы для достижения жизнеспособного условия визуализации. Протоколов представлен использовать конкретные условия для получения репрезентативных результатов. Мы кратко обсудим экологического контроля и наблюдения повреждений до подробного изложения конкретных методов представлены.
Установление и поддержание соответствующих биологических условий на микроскоп имеет решающее значение для успешного мониторинга клеточных событий. Достижение целевых условий зависит от ряда переменные, характерные для микроскопа и инкубатор конфигурации. Все инкубатора параметры должны быть проверены с использованием независимого измерения температуры макет образца в инкубаторе принятыв нескольких позициях, включая, точки контакта цели, в середине чашки для культивирования, и край чашки для культивирования. Параметры должны быть оптимизированы, чтобы минимизировать области, которые более чем на 1 ° С выше, чем 37 ° С, а также поддержание температуры, близкой к температуре 37 ° С в точке контакта цели. Каждое блюдо культуры и объективной конфигурация, используемая для работы с изображениями должна быть испытана и утверждена до эксперимента. В идеале все образцы будет контролироваться температуры во время съемки, но это доказывает непрактичным для ряда систем и сложным, когда биологически опасных агентов работают. Проверка условий инкубации важно, так как инкубации образцов при слишком низкой или слишком высокой температуре может привести к искусственной или быстрых результатов сотовой деградации.
Выявление и минимизация результаты, вытекающие из наблюдений повреждений важно для развития протокола. Частое освещение может изменить биологические процессы, IRReversibly инактивировать флуоресцентных молекул, или индуцировать ряд клеточных путей смерти. Неактивированные температуры имеет важное значение для воспроизведения биологически сходных условиях на этапе верхней аналогичны стандартным культуре ткани инкубаторе. Контроль за последствия частого освещения является более трудным и часто требует итерационного проб и ошибок практики. Сравнение параллельных образцов, хранившихся в культуре ткани инкубатора для морфологических различий или биологически соответствующих изменений можно определить, если живых клеток условиях изображений приводит к значительной клеточной токсичности. В экспериментах, описанных здесь, мы провели мониторинг производительности вирусной инфекции через титр вируса, а также степень распространение вируса между клетками.
Для достижения реального времени изображения быстро транспорта в пределах аксоны требуется оптимизация изображения скорость приобретения наряду с интенсивностью флуоресценции освещения. Скорость получения изображения определяется Верблюднастройках и микроскопа аппаратных средств, особенно при сборе нескольких флуоресцентных каналов последовательно. Интенсивность освещения влияет на качество флуоресцентных сигналов и скорость приобретения. Большая интенсивность освещения позволяет упростить визуализацию флуоресцентных белков, особенно для тех, которые включают в частицы, в небольших количествах. Тем не менее, образец будет быстрее и отбеливателя страдают от расширения фототоксическими повреждения. Сокращение подсветки через фильтры нейтральной плотности требует большего времени экспозиции, снижения частоты получения изображений и потенциально может привести к пространственной деформации флуоресцентный структур из-за их перемещение во время обнаружения. Поиск правильного баланса освещенности изображения с частотой приобретения во многом зависит от флуоресцентного сигнала белка и скорость моторики структуры изучаются. Необходимо только, чтобы получать достаточно сигнал отличить флуоресцентный структур выше фона, а непроизводят высокую контрастность изображения, которые требуют большего времени экспозиции.
Ночевка интервальная съемка изображений использует похожую аппаратную конфигурацию в реальном времени живых клеток изображений, но во многом зависят от накопленных фото-повреждений, связанных с долгосрочными, частое освещение флуоресценции. В отличие от изображений в реальном времени, необходимость ограничения интенсивности флуоресценции освещение имеет первостепенное значение, и все другие переменные модифицируются с учетом этого ограничения. Ограничение интенсивности воздействия дает возможность более частого освещения нескольких флуоресцентных каналов без существенного повреждения отображаемого клеток. Антероградная аксон-клетка распространение события являются во времени и пространстве разрозненных, так что изображение большой площади необходимо захватить как многие из этих редких событий, насколько возможно.
В ряде публикаций обеспечили тщательный обзор и рекомендации для живых изображений сотовый практики 24-26. Протоколах подробно здесь RepresЛОР наши лучшие попытки минимизировать влияние флуоресценции на репликацию вируса, транспорта и распространения при сохранении существенных признаков вирусной инфекции. Сочетание этих протоколов с тщательной разработке флуоресцентных белков слияния и надежный нейрональной культуре, ответил на мои фундаментальные вопросы герпесвирусной инфекции и патогенез.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нам нечего раскрывать.
Acknowledgments
LWE РК и поддерживаются американским Национальным институтом здоровья гранты NS033506 R37-16 и R01 NS060699-03. MPT при поддержке Американского онкологического общества последующей исследовательской стипендии (PF-10-057-01-MPC). Советы и знания д-р Мэтью Лиман и доктор Орен Kobiler сыграли важную роль в проектировании конфигурации микроскопа и методов визуализации живой клетке. Мы также выражаем благодарность Нилу Барлоу и Брайан Т. Каин из Nikon Instruments за техническую помощь в приобретении, установке и производительности микроскопа.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm glass bottom culture dish | MatTek Corporation; Ashland, MA | P35G-1.5-20-C | |
| 35 mm μ-Dish | Ibidi USA LLC, Verona, WI | 81156 | |
| Microscope body | Nikon Instruments Inc. | Nikon Eclipse Ti | |
| Motorized microscope X-Y stage | Prior Scientific; Rockland, MA | H117 ProScan Flat Top | |
| Motorized filter wheels | Prior Scientific | HF110 10 position filter wheel | |
| Fluorescent illumination source | Lumen Dynamics; Mississauga, Ontario Canada | X-Cite 120Q | |
| Multi-band Fluorescence filter sets | Chroma Technology Corp.; Bellows Falls, VT | 89000 Sedat Quad - ET 89006 ECFP/EYFP/mCherry - ET | |
| EM-CCD camera | Andor Technology USA; South Windsor, CT | iXon3 897 | |
| Chamlide stage top environmental incubator | Live Cell Instruments; Seoul, South Korea | TC-L-10 | |
| Objective lens heater | Bioptecs; Butler, PA | 150803 Controller 150819-12-08 Heater | |
| Analysis software | Nikon Instruments Inc.; Melville, NY | NIS Elements |
References
- Johnson, D. C., Baines, J. D. Herpesviruses remodel host membranes for virus egress. Nature reviews. Microbiology. 9 (5), 382-394 (2011).
- Mettenleiter, T. C., Klupp, B. G., Granzow, H. Herpesvirus assembly: a tale of two membranes. Current Opinion in Microbiology. 9 (4), 423-429 (2006).
- Saksena, M. M., Wakisaka, H., et al. Herpes simplex virus type 1 accumulation, envelopment, and exit in growth cones and varicosities in mid-distal regions of axons. Journal of Virology. 80 (7), 3592-3606 (2006).
- Snyder, A., Wisner, T. W., Johnson, D. C. Herpes Simplex Virus Capsids Are Transported in Neuronal Axons without an Envelope Containing the Viral Glycoproteins. Journal of Virology. 80 (22), 11165-11177 (2006).
- Snyder, A., Polcicova, K., Johnson, D. C. Herpes simplex virus gE/gI and US9 proteins promote transport of both capsids and virion glycoproteins in neuronal axons. Journal of Virology. 82 (21), 10613-10624 (2008).
- Tomishima, M. J. A conserved alpha-herpesvirus protein necessary for axonal localization of viral membrane proteins. The Journal of Cell Biology. 154 (4), 741-752 (2001).
- Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. A., Giepmans, B. N. G. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nature Methods. 9 (2), 152-158 (2012).
- Kratchmarov, R., Taylor, M. P., Enquist, L. W. Making the case: Married versus Separate models of alphaherpes virus anterograde transport in axons. Reviews in Medical Virology. 22 (6), 378-391 (2012).
- Antinone, S. E., Smith, G. A. Two modes of herpesvirus trafficking in neurons: membrane acquisition directs motion. Journal of Virology. 80 (22), 11235-11240 (2006).
- Del Rio, T., Ch'ng, T. H., Flood, E. A., Gross, S. P., Enquist, L. W. Heterogeneity of a fluorescent tegument component in single pseudorabies virus virions and enveloped axonal assemblies. Journal of Virology. 79 (7), 3903-3919 (2005).
- Taylor, M. P., Kramer, T., Lyman, M. G., Kratchmarov, R., Enquist, L. W. Visualization of an alphaherpesvirus membrane protein that is essential for anterograde axonal spread of infection in neurons. mBio. 3 (2), (2012).
- Taylor, M. P., Kobiler, O. Alphaherpesvirus axon-to-cell spread involves limited virion transmission. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2012).
- Kobiler, O., Brodersen, P., Taylor, M. P., Ludmir, E. B., Enquist, L. W. Herpesvirus replication compartments originate with single incoming viral genomes. mBio. 2 (6), (2011).
- Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
- Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide. Trends in Cell Biology. 19 (11), 649-655 (2009).
- Ch'ng, T. H., Flood, E. A., Enquist, L. W. Culturing primary and transformed neuronal cells for studying pseudorabies virus infection. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). , 292-299 (2005).
- Curanovic, D., Ch'ng, T. H., Szpara, M., Enquist, L. Compartmented neuron cultures for directional infection by alpha herpesviruses. Current protocols in cell biology. Chapter 26 (Unit 26.4), (2009).
- Zareen, N., Greene, L. A. Protocol for culturing sympathetic neurons from rat superior cervical ganglia (SCG). J. Vis. Exp. (23), e988 (2009).
- Ch'ng, T. H., Enquist, L. W. Neuron-to-Cell Spread of Pseudorabies Virus in a Compartmented Neuronal Culture System. Journal of Virology. 79 (17), 10875-10889 (2005).
- Campenot, R. B., Lund, K., Mok, S. -A. Production of compartmented cultures of rat sympathetic neurons. Nature Protocols. 4 (12), 1869-1887 (2009).
- Kramer, T., Greco, T. M., Taylor, M. P., Ambrosini, A. E., Cristea, I. M., Enquist, L. W. Kinesin-3 Mediates Axonal Sorting and Directional Transport of Alphaherpesvirus Particles in Neurons. Cell Host & Microbe. 12 (6), 806-814 (2012).
- Smith, G. A., Gross, S. P., Enquist, L. W. Herpesviruses use bidirectional fast-axonal transport to spread in sensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98 (6), 3466 (2001).
- Kramer, T., Enquist, L. W. Alphaherpesvirus Infection Disrupts Mitochondrial Transport in Neurons. Cell Host & Microbe. 11 (5), 504-514 (2012).
- Swedlow, J. R., Platani, M. Live cell imaging using wide-field microscopy and deconvolution. Cell Structure and Function. 27 (5), 335-341 (2002).
- Kaech, S., Huang, C. F., Banker, G. Short-Term High-Resolution Imaging of Developing Hippocampal Neurons in Culture. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (3), (2012).
- Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy - tips and tools. Journal of Cell Science. 122 (6), 753-767 (2009).
