Summary
Imágenes de células vivas de las infecciones por virus alphaherpes permite el análisis de los eventos dinámicos de transporte dirigido y propagación intercelular. A continuación, presentamos metodologías que utilizan cepas virales recombinantes que expresan proteínas de fusión fluorescentes para facilitar la visualización de los conjuntos virales durante la infección de las neuronas primarias.
Abstract
Los avances en las técnicas de microscopía de fluorescencia de células vivas, así como la construcción de cepas virales recombinantes que expresan proteínas de fusión fluorescentes han permitido a la visualización en tiempo real del transporte y la propagación de la infección por el virus alphaherpes de las neuronas. La utilidad de las nuevas proteínas de fusión fluorescentes a la membrana viral, tegumento, y cápsidas, en conjunción con imágenes de células vivas, identificado conjuntos de partículas virales transportados dentro de los axones. Herramientas similares se han empleado con éxito para el análisis de la célula-célula repartidas de partículas virales para cuantificar el número y la diversidad de los viriones de transmisión entre las células. Es importante destacar que las técnicas de imágenes de células vivas del transporte y la propagación anterógrada producen una gran cantidad de información, incluyendo velocidades de las partículas de transporte, la distribución de las partículas, y los análisis temporales de la localización de la proteína. Junto a las técnicas genéticas virales clásicos, estas metodologías han proporcionado una visión críticaen importantes cuestiones mecánicas. En este artículo se describe en detalle los métodos de imagen que se desarrollaron para responder a las preguntas básicas de transporte de virus alphaherpes y propagación.
Introduction
La infección del sistema nervioso periférico (SNP) por alphaherpes virus tales como el virus del herpes simple (HSV) -1, -2, y el virus de la pseudorrabia (PRV) implica varios pasos complejos y altamente regulado durante todo el ciclo de vida viral. Transporte dentro de las neuronas del SNP es fundamental durante los acontecimientos de la infección viral primaria y posterior propagación inter-host. Los mecanismos moleculares que modulan dos componentes del ciclo de vida viral, el transporte dirigido de conjuntos virales de distancia desde los cuerpos celulares dentro de los axones (transporte anterógrado) y la transmisión posterior de los viriones a las células susceptibles (propagación anterógrada) son importantes para la comprensión del herpesvirus patogénesis.
El transporte y la salida de las partículas virales en las neuronas depende de montaje de un 1,2 virión infeccioso maduro. Ensayos previamente fijados, incluyendo inmunofluorescencia (IF) y microscopía electrónica (EM), se utilizaron para estudiar el estado de montaje de partículas y protinteracciones ein relacionados con el transporte y la propagación del virión 3-6. Sin embargo, la naturaleza dinámica de transporte de viriones y artefactos experimentales introducidas por fijación química confunde la interpretación de imágenes fijas 7,8. Recientemente, un número de proteínas de fusión viral-fluorescentes se han descrito para el VHS y PRV que tienen impactos insignificantes en la función de proteínas. Proteína Fluorescente Verde (GFP) y las proteínas fluorescentes rojas (mCherry o mRFP) fluoróforos a menudo se combina para permitir formación de imágenes de dos de los tres componentes estructurales de un virión maduro: cápside, tegumento, y glicoproteína 9-11. Imágenes de células vivas de transporte anterógrado con doble etiquetado virus visualiza el estado de ensamblaje de las partículas virales durante el transporte. Fluoróforo similares expresando cepas virales se utilizan para visualizar el número y la diversidad de los genomas virales siguientes propagación 12,13. Las propiedades de las proteínas fluorescentes (revisado en 14,15) afectan en gran medidala capacidad de visualizar conjuntos virales o celulares. Las propiedades intrínsecas de la proteína fluorescente, incluyendo la auto-interacciones y estabilidad, deben tenerse en cuenta al diseñar y probar nuevas fusiones de proteínas para la preservación de la funcionalidad de tipo salvaje.
En conjunción con fusiones de proteínas fluorescentes, dos bien caracterizados en sistemas de cultivo celular in vitro se emplean para la formación de imágenes en vivo de células de la infección por virus del herpes: disociado 16 y compartimentada 17 (Figura 1A) neuronas de los ganglios cervicales superiores de rata (SCG). En ambos sistemas, embrionario SCG se diseccionan, disociado de los cuerpos celulares individuales, y se sembraron en el cultivo in vitro 18. Las neuronas SCG son parte del sistema nervioso autónomo y pueden ser fácilmente cultivadas y diferenciadas por el factor de crecimiento neuronal (NGF) en una madura estado polarizado ex vivo. Neuronas SCG disociadas forman una extensa red de axones que permite fo la visualización de partículas virales que sean sometidos a transporte anterógrado 6. Culturas SCG en compartimientos proporcionan aislamiento de fluidos del cuerpo de las células neuronales (compartimento S) y terminales de axones distales (compartimiento N) 19. Una serie de protocolos detallados para la construcción y el uso de las neuronas compartimentada con 20 originales o modificadas Campenot cámaras 17 se han publicado con anterioridad. Aislamiento neumático permite la infección selectiva de los cuerpos de las células neuronales y la detección de viriones progenie después del transporte a terminales de axones aislados. Plating células epiteliales a través de los terminales antes de la infección proporciona células receptoras para la propagación de la infección viral.
Hay muchos elementos esenciales importantes para toda la experimentación imágenes de células vivas, pero los más relevantes para nuestros protocolos son: la adquisición automatizada de imagen, la iluminación fluorescente, la velocidad de formación de imágenes, y el control del medio ambiente. Para todos los experimentos de imagen, utilizamosun,, microscopio de epifluorescencia iluminación automatizado invertida (Figura 1B). El microscopio se basa en la base de Nikon Eclipse Ti y emplea una serie de sistemas motorizados controlados por el ordenador para reconfigurar rápidamente el microscopio durante la adquisición de imágenes automatizado. Para la iluminación de fluorescencia, se utiliza un amplio espectro lámpara de arco de mercurio que puede ser atenuado con filtros de densidad neutra a lo largo de la trayectoria de iluminación. Filtros de excitación limitan el espectro de la iluminación fluorescente y cuando se combina con espejos dicroicos múltiples pasadas y filtros de emisión de fluorescencia visualizar compuestos fluorescentes específicas. Los filtros de excitación y emisión se montan en ruedas independientes, cambio rápido de filtro para permitir una rápida adquisición secuencial de diferentes canales fluorescentes. La velocidad de adquisición de la imagen se ve reforzada con una cámara EM-CCD sensible y rápido, útil para la detección de señales de baja intensidad y corta imagen tiempos de lectura. Control ambiental de la microscOpe se consigue con una tapa etapa se calienta incubadora y un calentador de lente de objetivo de mantener las muestras a temperaturas elevadas mientras se pasa un ambiente humidificado y CO 2 enriquecido en la incubadora. El microscopio se mantiene en una habitación oscura con una temperatura ambiente mantenida cerca de 25 ° C y la luz fuera minimizada con cortinas en todas las ventanas. Los protocolos siguientes describen el uso de este sistema para el transporte anterógrado y ensayos de propagación.
Una serie de alternativas existen para el control de las variables de imágenes de células vivas. El control de la configuración de microscopía se puede realizar manualmente o por medio de sistemas automatizados que dependen de software propietario. Iluminación de fluorescencia se puede lograr con fuentes de láser de halógeno, o LED. La velocidad de formación de imágenes es modificado por la velocidad de conmutación de filtro y el tiempo para visualizar la señal con el sistema de detección emparejado. El control ambiental se puede lograr con hardware especializado en la millasetapa copio, recinto de la totalidad o parte del microscopio en una caja calentado y humidificado, o mediante la elevación de la temperatura de la habitación donde se llevará a cabo la microscopía. Cada una de estas alternativas tiene ventajas y desventajas relacionadas con el coste y el rendimiento.
En el protocolo posterior, que detalle el uso de imágenes de células vivas para estudiar el transporte rápido anterógrada y la propagación de los virus alphaherpes anterógrada a través de la utilización de cepas virales recombinantes. Imágenes de células vivas en tiempo real visualiza la cápside, tegumento, y / o glicoproteína co-localización de estructuras dinámicas que experimentan transporte dentro de los axones 11. Imágenes timelapse noche de cultivos neuronales compartimentadas visualiza axonal salida del virión y la infección de células susceptibles 12. Los protocolos que aquí se presentan se han optimizado para su uso con el sistema de imagen en particular, sino que se presenta en términos generales en relación con los cuatro elementos de imágenes de células vivas. En la discusión quevoluntad más detalle algunos de la optimización que es necesario para la experimentación con éxito.
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Protocol
Sección 1 - Condiciones de Control Ambiental para microscopía de fluorescencia en vivo de células
- 30 min antes de cualquier experimento de imágenes conectar y empieza a calentarse el microscopio etapa superior incubadora.
- Encienda el microscopio, las fuentes de luz transmitida y epifluorescencia y controles de hardware automatizado. Abra el software de control de microscopio, los elementos de NIS, para conectar con el microscopio y empiece a enfriarse la cámara EM-CCD.
- Coloque la lente más caliente al objetivo correspondiente (60X o 100X de inmersión en aceite) Nota:. Seleccione lente objetivo según el tipo de experimento. El contraste de interferencia diferencial 100X (CID) es mejor para el seguimiento de conjuntos de virión transporte anterógrado mientras que la fase de objetivo 60X es adecuado para visualizar propagación anterógrada. Bajo aumento, objetivos de inmersión no petroleras no requieren una lente más caliente, ya que no entran en contacto directo con la muestra.
- Conecte la etapa superior incubadora en la platina motorizada de mi copio. Asegurar la inserción adecuada que mantenga la muestra está en su lugar. Conecte la línea de aire húmedo desde el control de la incubadora al puerto de entrada de la etapa superior incubadora.
- Encienda la incubadora y la lente de controles más cálidos y ajustar la configuración de temperatura a las condiciones previamente verificados específicos para el objetivo y la muestra que se está fotografiado (véase el debate).
- Abra la válvula de control del 5% de CO 2/95% del depósito atmosférico para dar CO 2 del aire complementado a la etapa superior incubadora. La velocidad de flujo debe estar entre 60 y 80 ml de gas por minuto. Mayor velocidad se traducirá en una amplia muestra de deshidratación a pesar de la cámara de humidificación.
- Añadir el aceite de lente objetivo y colocar inmediatamente la cultura que serán fotografiadas a la etapa superior incubadora.
- Permitir el equilibrio de la temperatura en el cultivo durante un mínimo de 10 min. Se prefiere una hora, especialmente para formación de imágenes durante la noche se describe en la Sección 3.
- Seis a ocho horas antes de la imagen, infectar un plato de 35 mm cubreobjetos-parte inferior de maduros, las neuronas SCG disociadas con 1 x 10 6 unidades formadoras de placa del virus de interés (Véase la Tabla 1 para los virus ejemplo) utilizando el método descrito en Taylor et al. 2012a 11. Si va a probar más de un virus, off-set inoculaciones por 30-60 minutos para permitir la formación de imágenes de muestras secuenciales en similares tiempos después de la infección.
- Inserte plato a la etapa superior incubadora durante un mínimo de 10 minutos antes de ejecutar cualquier experimento. Mientras que la temperatura se equilibre, el plano focal está cambiando y va a afectar negativamente los experimentos de imagen.
- Con luz transmitida y el ocular del microscopio, encontrar un cuerpo celular neuronal que tiene una extensión axonal claramente aislados. También puede utilizar la iluminación fluorescente adecuado para encontrar una célula que expresa deteccióncantidades de mesa de proteínas fluorescentes. Es importante limitar la exposición de la muestra a la iluminación fluorescente, en este paso y pasos subsiguientes, debido a daño celular inducido por la luz y blanqueo de proteínas fluorescentes.
- Atenúa la iluminación de fluorescencia para reducir la intensidad de la luz de excitación a la que están expuestas las células. Involucrar a la luz atenuando densidad neutra (ND) filtros de la trayectoria de la luz de iluminación de fluorescencia. Para las películas que duran más de 1 min, un mínimo de ND4 deben ser usados para prevenir foto-blanqueo de proteínas fluorescentes y extensa foto-daño de los axones. Estructuras altamente fluorescentes normalmente se pueden visualizar con un ND8 filtro en su lugar.
- Utilizando el software de microscopio (Figura 2 y Suplementario Movie 1A), cambiar la trayectoria de la luz a la cámara EM-CCD.
- Determinar tiempos de imagen óptima y las condiciones para cada canal fluorescente.
- Inicie una ventana de la imagen en vivo mediante el botón "Play". </ Li>
- Determine los ajustes de exposición de cámara óptimos para cada proteína fluorescente. No exceder 300 ms por canal como aberraciones dinámicas sobre los rápidos estructuras virión movimiento ocurrirá. Utilizar la ganancia EM de la cámara a un ajuste de 300 (fabricante sugirió ganancia máxima), para reducir al mínimo el tiempo de exposición y mejorar la detección de señales débiles. Tiempos de exposición correctos deben producir una imagen con una baja intensidad de fondo y de señales de alta específicos.
- Después de la determinación de riesgos y la búsqueda de una región bien definida de axón, el software debe ser configurado para realizar la adquisición de imágenes automatizado. Detener la ventana de proyección de imagen en directo de la muestra para evitar el blanqueo.
- En el software de elementos NIS, seleccione el 6D - Definir / Ejecutar la aplicación Experimento en el menú "Aplicaciones" del menú desplegable.
- En la ventana de adquisición ND, haga clic en la ficha Hora que determinará la frecuencia de adquisición de imágenes. Establezca el intervalo de "Sin demora" y la duración a 5 min. Thsoftware e adquirirá entonces cuadros de imagen a la mayor frecuencia posible duración de 5 min.
- Seleccione la pestaña "Lambda", que permite la selección de las configuraciones de hardware predeterminados utilizados para la adquisición de imágenes fluorescente múltiple. Haga clic en la primera casilla y en la subsiguiente menú desplegable para seleccionar una configuración de hardware apropiada. Repita el procedimiento para todas las proteínas fluorescentes que se va a examinar.
- Asegúrese de que las pestañas de "posiciones XY", "Z-series" y "agrandar" son de-seleccionados.
- Encima de las pestañas, seleccione la casilla "Guardar en archivo" para guardar automáticamente las imágenes en el disco duro durante la adquisición. Configurar la ubicación y el nombre de archivo del archivo de salida experimento. A medida que se realizan experimentos secuenciales, el software añadirá un número secuencial al final del nombre de archivo designado.
- Una vez que todas las fichas han sido seleccionados. Iniciar el experimento haciendo clic en el botón "Run-Now".
- Optimizar la velocidad de adquisición de imágenes a través de los ajustes de exposición y imagtamaño e. Uso de una pequeña región de la zona de imagen-a menudo capaces de acelerar las velocidades de adquisición de marco. Definir la zona de interés con la función ROI en NIS-Elements, seleccionar un área de entre 25% y 50% del área total de la imagen. Por otra parte, los tiempos de exposición más cortos aumentarán las tasas de adquisición de marco, pero disminuye la calidad de la señal (véase el debate).
Sección 3 - Noche time-lapse de anterógrada Spread Eventos
- Cuatro horas antes de la imagen, infectar un cultivo neuronal compartimentada construida en un 35 mm μ-plato. Inocular los cuerpos celulares neuronales con 1 x 10 6 unidades formadoras de placa del virus de interés (Véase la Tabla 1 para los virus ejemplo) utilizando el método descrito en Taylor et al. 2012b 12.
- Coloque suavemente placa de cultivo en la etapa superior incubadora. Asegúrese de que la posición del objetivo se establece en el lado del plato. Lentamente el objetivo en el enfoque, garantición del objetivo no empuja hacia arriba dentro de la muestra. Una vez que el campo de enfoque ha sido identificado, mueva lentamente el objetivo en el centro del plato, cerca de la barrera interna demarcación de la parte interna del compartimiento de axón. Durante el movimiento, asegurar que se mantiene la profundidad de foco y evitar empujando hacia arriba en la muestra. La desviación de la superficie de plástico por el objetivo dañará los axones y el plástico.
- Añadir aproximadamente 2 ml de agua tibia (~ 37 ° C) solución salina tamponada con fosfato a la placa de cultivo fuera del anillo de teflón. Esta rodea la cultura neuronal con un anillo de PBS para reducir al mínimo la deshidratación de la muestra y proporcionar aislamiento térmico.
- Deje que la temperatura se equilibre durante un mínimo de 1 hora antes de iniciar la adquisición de imágenes automatizado (3.8). Pasos 3.5 a través de 3.7 se pueden configurar durante este tiempo.
- Restringir la intensidad de la iluminación al nivel más bajo posible mediante la participación de todos los filtros de densidad neutra. Esto permitirá la adquisición de imágenes frecuentes over períodos de tiempo largos sin excesivo foto-daño. La reducción de la iluminación se traducirá en una señal baja, que requieran exposiciones largas (véase el debate).
- Utilice los ajustes históricos de exposición o antes de montaje experimental generar un plato en paralelo de las células epiteliales infectadas que expresan las proteínas fluorescentes de destino para establecer los ajustes de exposición como se describe en la Sección 2.5.
- Después de ajustar la exposición para los canales necesarios, es el momento de configurar el software de adquisición de imágenes automatizado. Detener la ventana de proyección de imagen en directo para limitar muestra de blanqueo.
- En el software de elementos (Figura 2 y la película suplementario 2), seleccione la 6D - Definir / Ejecutar la aplicación Experimento en el menú "Aplicaciones" down menú para abrir la ventana de adquisición ND.
- En la ventana de adquisición ND, haga clic en la ficha Hora. Establezca el intervalo de "5 minutos". Ajuste de la duración de 20 horas. El campo de bucles se calcula automáticamente para el número de repeticiones, el program va a realizar.
- Seleccione la pestaña "Lambda". Haga clic en la primera casilla y en la subsiguiente menú desplegable, seleccione la configuración lambda apropiado para contraste de fase. Repita el procedimiento para las posiciones siguientes, la selección de las configuraciones adecuadas para cada proteína fluorescente a explorar.
- Seleccione la pestaña "Imagen grande", que determina los parámetros de varias imágenes que se combinan en un solo campo de visión más amplio. Un área de buen tamaño se compone de 5 x 2 imágenes utilizando un 7% de superposición costura. Esto permitirá que el número máximo de células por posición en ser fotografiado sin afectar la frecuencia de adquisición de la imagen. Además, desactive la casilla de verificación de "Shutter Cerrar activo durante el movimiento Stage". Esta opción mejora la velocidad de adquisición por parte de no cerrar persianas entre imágenes.
- Seleccione la pestaña "XY posiciones", para identificar múltiples posiciones que serán secuencialmente fotografiadas en paralelo durante el curso de la película durante la noche. Seleccione las posiciones que definen la po centroint para cada gran área de la imagen. Seleccionar 6-8 posiciones de la imagen en la muestra. Un buen área de la imagen tendrá pequeños grupos de células en estrecha aposición a los axones claramente definidos. Las células no deben ser apilados en la parte superior de cada otra y axón agrupación debería reducirse al mínimo. El punto de enfoque es el núcleo de la célula. Coloque el objetivo de tal manera que una envoltura nuclear se ve claramente definido para la mayoría de las células.
- Asegúrese de que la pestaña de "Z-series" no está seleccionada.
- Configurar la función de guardado automático como se describe en la Sección 2.6.5.
- Prueba de la exposición y la posición haciendo clic "1 bucle de tiempo". Evaluar las imágenes resultantes para la iluminación de luz transmitida, el enfoque y encuadre. Si el foco se ha desplazado, restablezca el enfoque para cada posición en la pestaña XY. Espere 10 minutos y repita este paso hasta que el enfoque es estable.
- Después de todos los ajustes se han verificado y probado, iniciar el experimento automático haciendo clic en el botón "Ejecutar ahora".
Sección 4 - Procesamiento de Imágenes y Exportación
Exportación de datos
- Los conjuntos de datos obtenidos durante la exploración de células vivas de eventos de transporte o propagación deben ser exportados desde el software de elementos NIS en tipos de archivo más utilizados para su posterior uso en presentaciones y publicaciones (Supplemental Movie 3). Para exportar películas abren la prima nd2 archivo adecuado. Elementos de NIS y seleccione la vista "split-componente" para visualizar los canales fluorescentes deseados. Reproducir el archivo a una velocidad adecuada, a 5 fotogramas por segundo es un buen punto de partida para la visualización de transporte rápido.
- Incluir una indicación de la hora de representar a un reloj en tiempo real durante la reproducción de películas. Haga clic derecho sobre la imagen y seleccionar Añadir ND-información. Un contador digital aparecerá en la esquina superior izquierda.
- Edite el sello de tiempo para mostrar la información. Haga clic derecho sobre la barra y seleccione Editar-ND información. En la siguiente ventana emergente, edite el texto para reflejar la imaginaciónng parámetros que son importantes. Editar fuente, el color y el tamaño para mayor claridad.
- Vaya al menú "Editar" y encontrar "Crear vista instantánea" o pulse la tecla "x". Este comando abre la ventana "visión instantánea". Seleccione "Aplicar a todos los fotogramas" para generar un 8 bits, RGB, archivo listo para exportar que contiene los canales fluorescentes de toda la película.
- Guardar como un archivo. Avi para la compatibilidad multiplataforma. Ajuste la velocidad de reproducción en 200 milisegundos por cuadro. Los archivos. Avi generados por elementos NIS se pueden comprimir más con otro software de conversión en el tipo de archivo deseado.
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Representative Results
Transporte anterógrado
La aplicación de este protocolo para las infecciones de las culturas SCG disociadas con PRV 348, una cepa recombinante PRV expresando GFP-US9 y proteínas de fusión de membrana gM-mCherry, ha facilitado la visualización del transporte anterógrado de viriones (Figura 3 y complementario Movie 4). La incorporación de estas proteínas de fusión en partículas víricas en los resultados de su detección en el transporte de puntos lagrimales, y las condiciones de formación de imágenes antes mencionadas minimizar el desplazamiento de cada fluoróforo en una partícula en movimiento durante el cambio de filtro. En una ventana de imágenes en tres minutos, numerosos puntos lagrimales transporte son comúnmente observados y grandes tamaños de muestra para análisis de colocalización se generan rápidamente. Hemos cuantificado previamente la colocalización de GFP-US9, el virus alphaherpes axonal orientación proteínas con otras proteínas estructurales que utilizan este enfoque 11. Análisis similares de otros dual recombinant cepas de PRV también se han descrito 11, y el trabajo reciente ha documentado el co-transporte de proteínas PRV con una proteína motora anfitrión marcado con fluorescencia en una nueva prórroga de este protocolo 21. Utilizando el cambio rápido de ruedas de filtros y espejos dicroicos pares multi-pass permite la rápida adquisición secuencial de dos o más canales fluorescentes. Podemos lograr actualmente dos canales de adquisición secuencial a una velocidad de hasta 0,8 fotogramas por segundo. Para un solo canal de video microscopía, que está limitada sólo por el tiempo de exposición de fluorescencia y en tiempo de lectura de la cámara, se puede lograr tasas de adquisición de más de 6 cuadros por segundo.
Spread anterógrada
Para visualizar los eventos propagación anterógrada, áreas de interés se visualizan cada 5 a 10 minutos durante un período de 20 horas, tiempo durante el cual viriones transportarán hacia abajo y la salida de los axones, la infección de las células epiteliales cercanas. Un marco de representante de la imagen de gran tamaño sonuna se presenta en la figura 4A y de la película suplementario 5. Tenga en cuenta la naturaleza espacialmente separada de las células que expresan proteínas fluorescentes, indicativos de la infección primaria de los axones. Las células infectadas pueden ser rastreados hacia atrás durante la película para visualizar las cápsides fluorescentes que iniciaron la infección viral. Estas células individuales se pueden aislar a partir de la trama grande y realiza un seguimiento sin una pérdida significativa de detalle. El marco representativo (Figura 4 B) de la película de consulta 6 representa un tiempo después de viriones han depositado la cápside fluorescente en el citoplasma.
Análisis de Datos
Una gama de diferentes análisis se puede realizar en conjuntos de datos de formación de imágenes de células vivas, incluyendo el rastreo de partículas, estudios de colocalización, y la cuantificación de eventos propagación del virión. A menudo realizamos nuestros análisis directamente en el software de elementos NIS o utilizar un plug-in de extensión disponible para el Imapaquete de software que permite la UGE. nd2 apoyo tipo de archivo. Diferentes hipótesis y configuraciones experimentales requieren métodos analíticos únicos. Nuestro grupo ha descrito los métodos para la evaluación de colocalización de proteínas fluorescentes en estructuras dinámicas 11,21 y time-lapse de cuantificación de eventos propagación de partículas individuales 10,12,22. Las metodologías se describen en este manuscrito y nuestros estudios anteriores son flexibles y se pueden aplicar a diferentes infecciones virales, así como el transporte de las estructuras celulares, por ejemplo, las mitocondrias 23.
Figura 1. Esquema de la microscopía configurado para imágenes de células vivas. A) los tipos de cultivo empleado para el estudio de transporte anterógrado (disociada) y la propagación anterógrada (cámaras), respectivamente. Panel 1 es una imagen de contraste de fase de un Ganglios cervical superior disociado maduro (SCG). Grupo 2 es un esquema del sistema de cultivo compartimentada, en la foto en el panel 3, con las neuronas SCG colocaron en placas en el compartimento izquierdo con proyecciones axonales que se extiende por debajo de las barreras internas en el compartimiento de más a la derecha. B) El microscopio de epifluorescencia invertido y la etapa superior configuración de incubadora utilizado para los experimentos de microscopía de video. Haz clic aquí para ver más grande la figura .
Figura 2. Interfaz de software NIS-Elements. Aparecerá una pantalla de interfaz de usuario estándar en NIS-Elements. Los botones Play y Stop controlan la ventana de la imagen en vivo que muestra la configuración actual del hardware para obtener imágenes, así como lo que se ha reflejado en ese momento. Al otro lado del panel superior son una serie de configuraciones ópticas que implementan preestablecido de hardware SEttings para configurar el microscopio para detectar trans-iluminada o fluorescencia. La configuración de la exposición Control de la cámara y permiten la configuración de la detección de la cámara para optimizar la calidad de imagen y velocidad. Todos los experimentos se coordinan mediante los controles de adquisición ND. Haz clic aquí para ver más grande la figura .
Figura 3. Vivo de imágenes de células de los axones SCG a las 8 horas después de la infección con el PRV 348. PRV 348 neuronas infectadas expresan la GFP-US9 y proteínas de fusión de gM mCherry membrana. Estructuras anterógrada-transportan dentro de los axones distales se visualizan en dos canales fluorescentes, GFP y mCherry. Una estructura anterógrada-transporte (flecha blanca) avanza dentro del axón como se muestra en las imágenes secuenciales tomadas de película suplementario 4. Las dos proteínas fluorescentes son Spatialiarse off-set debido a la adquisición secuencial de canales fluorescentes y el rápido movimiento de las estructuras virales. Haz clic aquí para ver más grande la figura .
La Figura 4. Imágenes Overnight timelapse de eventos propagación anterógrada de axones infectados a grupos de células epiteliales durante una infección de varios colores. Imágenes representativas de una sola posición, la imagen grande de azulejos película de lapso de tiempo de transmisión del virión del PRV 427 axones infectados en células epiteliales receptores. A) Una imagen fusionada de las imágenes fluorescentes transmitida, YFP y RFP en un tiempo después de la infección en las células receptoras están empezando a expresar la YFP-CAAX y proteínas de fusión VP26-mRFP. En el segundo panel, los canales de YFP y RFP se muestran juntos. Tenga en cuenta el gran número de mRFP puncta asociaciónciados con los tractos de axón. Estos son viriones reunidos transportados a larga distancia dentro de los axones (Supplemental Movie 2). La caja blanca representa el área de su interés puesto de manifiesto en la parte B. B) Imagen representativa de las células epiteliales que contienen receptores que infectan asambleas cápside (Véase también películas Suplementario 3). Panel 1 es una fusión de los canales transmitidos y RFP. Panel 2 es el canal RFP solo. Panel 3 es el canal RFP con una representación esquemática del contorno celular (línea blanca continua), núcleo (línea blanca hash) y axones (líneas azules). Haga clic aquí para ver más grande la figura .
Suplementario Movie 1. La configuración del software para una rápida, la adquisición secuencial de viriones axonal. Los pasos relacionados con la determinación de los parámetros de exposición, la configuración de los controles de adquisición de Newcastle, y la adquisición de un marco de rápida adquisición mose presenta vie de viriones fluorescentes transportados axonal. La cultura de las neuronas SCG estaba infectado con PRV 427 ocho horas antes de imágenes. Haz clic aquí para ver la película .
Suplementario Movie 2. La configuración del software para obtener imágenes de la noche de la propagación axón-célula. Se presentan los pasos asociados con la configuración de los controles de adquisición de ND para obtener imágenes de la noche del axón-célula a eventos propagación. Haga clic aquí para ver la película .
Suplementario Movie 3. La conversión de. ND2 archivos en formatos de película. Presentables los pasos asociados con la conversión de los datos en bruto. ND2 archivos en cualquiera. Mov. Avi o para presentación con reproductores de vídeo comunes. Haz click aquíe para ver la película.
Suplementario Movie 4. Imágenes de células vivas de SCG axones a las 8 horas después de la infección con el PRV 348. Haz clic aquí para ver la película .
Suplementario Movie 5. Amplia zona de imagen de la imagen durante la noche del axón-célula propagación. Haga clic aquí para ver la película .
Suplementario Movie 6. Zona ampliada de la imagen timelapse noche del axón-célula propagación. Haga clic aquí para ver la película .
| Colar | Genotipo | Utilidad |
| PRV 341 | GFP-US9 (membrana) / mRFP-VP26 (cápside) Experimentos de transporte 11 virión | |
| PRV 348 | GFP-US9 (membrana) / gM-mCherry (membrana) | Experimentos de transporte 11 virión |
| PRV 427 | mRFP-VP26 (cápside) / YFP-CAAX (la membrana plasmática celular) | Experimentos de propagación anterógrada 10 |
Tabla 1. Cepas útiles PRV recombinantes que expresan proteínas de fusión fluorescentes.
| Nombre | Empresa | Número de catálogo |
| 35 mm con fondo de cristal placa de cultivo | MatTek Corporation; Ashland, MA | P35G-1.5-20-C |
| 35 mm μ-Dish | Ibidi EE.UU. LLC, Verona, WI | 81156 |
| Cuerpo del microscopio | Nikon Instruments Inc. | Nikon Eclipse Ti |
| Motorizada XY microscopio | Científico Antes, Rockland, MA | H117 ProScan Flat Top |
| Ruedas de filtros motorizados | Prior Scientific | HF110 10 rueda de filtros posición |
| Fuente de iluminación fluorescente | Lumen Dinámica, Mississauga, Ontario, Canadá | X-Cite 120Q |
| Establece Multi-banda de filtro de fluorescencia | Chroma Technology Corp., Bellows Falls, VT | 89000 Sedat Quad - ET 89006 ECFP / EYFP / mCherry - ET |
| Cámara EM-CCD | Andor Tecnología de EE.UU., South Windsor, CT | iXon3 897 |
| Chamlide etapa superior del medio ambiente incubadora | Instrumentos de células vivas, Seoul, Corea del Sur | TC-L-10 |
| Calentador de la lente objetiva | Bioptecs, Butler, PA | 150803 Controller150819-12-08 calentador |
| Software de análisis | Nikon Instruments Inc., Melville, NY | Elementos NIS |
Tabla 2. Reactivos y equipos específicos.
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Discussion
El objetivo de imágenes de células vivas es la observación de los procesos biológicos que ocurren sin una alteración significativa en el acto de la observación. Este objetivo se logra mediante la optimización de tres variables: el control del medio ambiente, la velocidad de formación de imágenes, y la iluminación de fluorescencia. Estas variables interdependientes deben ser equilibradas para lograr condiciones de la imagen viables. Los protocolos presentados utilizan condiciones específicas para producir los resultados representativos. Vamos a discutir brevemente los controles ambientales y daños de observación antes de detallar los métodos específicos que se presentan.
Establecer y mantener las condiciones biológicas relevantes en el microscopio es crítica para el éxito de seguimiento de eventos celulares. El logro de las condiciones del objeto depende de un número de variables específicas para el microscopio y la configuración de incubadora. Todos los ajustes de la incubadora deben validarse mediante una medición independiente de la temperatura de una muestra simulada en la incubadora tomadoen múltiples posiciones, incluyendo, el punto de contacto objetivo, el centro de la placa de cultivo, y el borde de la placa de cultivo. Configuración deben ser optimizados para reducir al mínimo las zonas que son más de 1 ° C más caliente que 37 ° C, así como el mantenimiento de una temperatura próxima a 37 ° C en el punto de contacto objetivo. Cada placa de cultivo y configuración objetiva utilizada para las imágenes deben ser probados y validados antes de la experimentación. Idealmente, todas las muestras podrían ser monitorizados para detectar la temperatura durante la formación de imágenes, pero esto demuestra poco práctico para un número de sistemas y se complica cuando se emplean agentes biológicamente peligrosos. La validación de las condiciones de incubación es importante, ya que la incubación de las muestras a demasiado bajo o demasiado alto de una temperatura puede resultar en resultados de artefactos o de degradación celular rápida.
Identificación y minimización de los resultados derivados de los daños observación es importante para el desarrollo del protocolo. Iluminación frecuente puede alterar los procesos biológicos, irreversibly inactivar moléculas fluorescentes, o inducir a un número de vías de la muerte celular. Validación de temperatura es importante para reproducir las condiciones biológicamente similares en la parte superior etapa análoga a las de un incubador de cultivo de tejidos estándar. El control de los efectos de iluminación frecuente es más difícil y requiere a menudo el juicio y las prácticas de error iterativo. Comparando las muestras paralelas se mantienen en incubadoras de cultivo de tejidos de las diferencias morfológicas o alteraciones relevantes biológicamente puede determinar si las condiciones de formación de imágenes de células vivas provoca toxicidad celular significativa. En los experimentos descritos aquí, hemos supervisado la productividad de la infección viral a través de título viral, así como el grado de diseminación viral entre las células.
El logro de una imagen en tiempo real de transporte rápido dentro de los axones requiere la optimización de la velocidad de adquisición de la imagen junto con la intensidad de iluminación de fluorescencia. La velocidad de adquisición de la imagen se determina por la cámaruna configuración de hardware y el microscopio, especialmente cuando recogiendo múltiples canales fluorescentes secuencialmente. Intensidad de iluminación afecta a la calidad de las señales fluorescentes y la tasa de adquisición. Una mayor intensidad de iluminación permite una mejor visualización de las proteínas fluorescentes, en particular para aquellos que incorporan en partículas en pequeñas cantidades. Sin embargo, la muestra se blanqueador más rápido y sufren mayor daño fototóxico. La reducción de iluminación a través de filtros de densidad neutra requiere tiempos de exposición más largos, la reducción de la frecuencia de adquisición de la imagen y, potencialmente, causar una deformación espacial de estructuras fluorescentes debido a su movimiento durante la detección. Encontrar el equilibrio correcto de la intensidad de iluminación con frecuencia de adquisición de la imagen depende en gran medida de la señal de la proteína fluorescente y la tasa de la motilidad de la estructura que está siendo estudiado. Sólo es necesario para adquirir la señal suficiente para distinguir las estructuras fluorescentes por encima del fondo, en lugar deobtener imágenes de alto contraste que requieren tiempos de exposición más largos.
Imágenes timelapse noche utiliza una configuración de hardware similar en tiempo real de imágenes de células vivas, pero se ve afectada de manera significativa por acumulada foto-daño asociado a largo plazo, la iluminación de fluorescencia frecuentes. A diferencia de imágenes en tiempo real, la necesidad de limitar la intensidad de iluminación de fluorescencia es de suma importancia, y todas las otras variables se modifican para tener en cuenta esta restricción. Limitación de la intensidad de la exposición permite para la iluminación más frecuente de múltiples canales fluorescentes sin dañar significativamente las células con imagen. Eventos de propagación axón-célula a anterógrada son temporal y espacialmente dispares, por lo que una gran área de imagen es esencial para capturar ya que muchos de estos eventos poco frecuentes como sea posible.
Un número de publicaciones han proporcionado una visión general y recomendaciones exhaustivas para las prácticas de formación de imágenes de células vivas 24-26. Los protocolos que se detallan en esta represiónent nuestros mejores intentos para reducir al mínimo el impacto de las imágenes de fluorescencia en la replicación viral, el transporte, y la propagación preservando al mismo tiempo las características esenciales de la infección viral. La combinación de estos protocolos con el desarrollo cuidadoso de las proteínas de fusión fluorescentes y culturas neuronales robustas ha respondido a mis preguntas fundamentales de la infección por el virus del herpes y la patogenia.
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Disclosures
No tenemos nada que revelar.
Acknowledgments
LSA y RK son apoyados por los EE.UU. Institutos Nacionales de Salud subvenciones NS033506 R37-16 y R01 NS060699-03. MPT fue apoyada por una beca de investigación postdoctoral Sociedad Americana del Cáncer (PF-10-057-01-MPC). El asesoramiento y el conocimiento del Dr. Matthew Lyman y el Dr. Oren Kobiler fueron fundamentales en el diseño de la configuración del microscopio y los métodos de imágenes de células vivas. También extendemos gracias a Neal Barlow y Brian T. Kain de Nikon instrumentos para su asistencia técnica en la adquisición, instalación y funcionamiento del microscopio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm glass bottom culture dish | MatTek Corporation; Ashland, MA | P35G-1.5-20-C | |
| 35 mm μ-Dish | Ibidi USA LLC, Verona, WI | 81156 | |
| Microscope body | Nikon Instruments Inc. | Nikon Eclipse Ti | |
| Motorized microscope X-Y stage | Prior Scientific; Rockland, MA | H117 ProScan Flat Top | |
| Motorized filter wheels | Prior Scientific | HF110 10 position filter wheel | |
| Fluorescent illumination source | Lumen Dynamics; Mississauga, Ontario Canada | X-Cite 120Q | |
| Multi-band Fluorescence filter sets | Chroma Technology Corp.; Bellows Falls, VT | 89000 Sedat Quad - ET 89006 ECFP/EYFP/mCherry - ET | |
| EM-CCD camera | Andor Technology USA; South Windsor, CT | iXon3 897 | |
| Chamlide stage top environmental incubator | Live Cell Instruments; Seoul, South Korea | TC-L-10 | |
| Objective lens heater | Bioptecs; Butler, PA | 150803 Controller 150819-12-08 Heater | |
| Analysis software | Nikon Instruments Inc.; Melville, NY | NIS Elements |
References
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