Summary
Live-Cell-Imaging von alphaherpes Virusinfektionen ermöglicht die Analyse der dynamischen Ereignisse gerichteten Transport und interzelluläre Ausbreitung. Hier präsentieren wir Methoden, die rekombinanten viralen Stämmen, fluoreszierende Fusionsproteine Visualisierung der viralen Baugruppen während der Infektion von primären Neuronen erleichtern nutzen.
Abstract
Advances in lebenden Zellen Fluoreszenzmikroskopie Techniken, sowie die Konstruktion von rekombinanten Virusstämme, die fluoreszierende Fusionsproteine exprimieren haben Echtzeit-Visualisierung von Transport und die Ausbreitung von alphaherpes Virusinfektion von Neuronen aktiviert. Der Nutzen der neuen fluoreszierenden Fusionsproteine Virusmembran, Spelzen und Kapside in Verbindung mit Live Cell Imaging, identifiziert Viruspartikel Baugruppen unterziehen Transport innerhalb Axone. Ähnliche Instrumente wurden erfolgreich für die Analyse von Zell-Zell von Viruspartikeln verbreitet, um die Anzahl und die Vielfalt der Virionen zwischen Zellen übertragen quantifizieren beschäftigt. Wichtig ist, produzieren die Techniken des Live Cell Imaging der anterograde Transport und Ausbreitung eine Fülle von Informationen, einschließlich Partikeltransport Geschwindigkeiten, Verteilungen von Partikeln und zeitliche Analysen von Protein-Lokalisierung. Neben den klassischen viralen genetischen Techniken haben diese Methoden kritische Einblicke bereitgestelltin wichtige mechanistische Fragen. In diesem Artikel beschreiben wir im Detail die bildgebenden Verfahren, die entwickelt, um grundlegende Fragen der alphaherpes Virus Transport und Ausbreitung zu beantworten waren.
Introduction
Infektion des peripheren Nervensystems (PNS) durch alphaherpes Viren wie Herpes-simplex-Virus (HSV) -1, -2 und Pseudorabies-Virus (PRV) umfasst mehrere komplizierte und stark regulierten Schritte gesamten Lebenszyklus des Virus. Transport innerhalb der Neuronen des PNS ist kritisch während der Ereignisse der beiden primären Virusinfektion und anschließende inter-Host Verbreitung. Die molekularen Mechanismen, die beiden Komponenten des viralen Lebenszyklus modulieren; gerichteten Transport von viralen Baugruppen vom Zellkörper in Axonen (anterograde Transport) und die anschließende Übertragung der Virionen auf empfängliche Zellen (anterograde Spread) sind wichtig, um Verständnis Herpesvirus Pathogenese.
Die Transport-und Austritt von Viruspartikeln in Neuronen ist abhängig von der Montage eines reifen infektiösen Virion 1,2. Vorher festgelegten Assays, einschließlich Immunfluoreszenz (IF) und Elektronenmikroskopie (EM), wurden verwendet, um die Teilchen Montagezustand und prot studierenEin Wechselwirkungen mit virion Transport und Ausbreitung 3-6 verbunden. Doch die dynamische Natur der Transport Virionen und experimentelle Artefakte durch chemische Fixierung führte die Interpretation der fixierten Bilder 7,8 verwechselt. In jüngster Zeit haben eine Reihe von viralen fluoreszierenden Fusionsproteine für HSV und PRV, die geringe Auswirkungen auf die Protein-Funktion beschrieben worden. Green Fluorescent Protein (GFP) und Rot fluoreszierende Proteine (mCherry oder mRFP) Fluorophore sind oft gepaart Bildgebung von zwei der drei strukturellen Komponenten eines reifen Virion erlauben: Kapsid, Spelzen, und Glykoprotein 9-11. Live Cell Imaging der anterograde Transport mit Dual-markierten Viren visualisiert die Montage Zustand der viralen Partikel während des Transports. Ähnliche Fluorophor Ausdruck Virusstämme werden verwendet, um Anzahl und die Vielfalt der viralen Genomen nach Ausbreitung 12,13 visualisieren. Die Eigenschaften der fluoreszierenden Proteine (Bewertung in 14,15) stark beeinflussendie Fähigkeit, virale oder zelluläre Baugruppen visualisieren. Die intrinsischen Eigenschaften des fluoreszierenden Proteins, einschließlich Self-Interaktionen und Stabilität, sollten bei der Entwicklung und Erprobung neuer Protein-Fusionen für die Erhaltung der Wildtyp-Funktionalität werden.
In Verbindung mit fluoreszierenden Protein-Fusionen, zwei in vitro-Zellkultur-Systeme gut charakterisiert sind für Live-Cell-Imaging von Herpes-Virus-Infektion eingesetzt: dissoziierten 16 und 17 Kompartimente (Abbildung 1A) Ratte überlegen Halsganglien (SCG) Neuronen. Bei beiden Systemen werden embryonale SCG seziert, dissoziiert einzigen Zellkörper und plattiertem zur in vitro Kultivierung von 18. SCG Neuronen sind Teil des vegetativen Nervensystems und kann leicht kultiviert und differenziert von neuronalen Wachstumsfaktor (NGF) zu einer reifen polarisierten Zustand ex vivo. Dissoziierte SCG Neuronen bilden ein ausgedehntes Netz von Axonen, die f erlaubtoder die Visualisierung von viralen Partikeln, wie sie anterograden transport 6 zu unterziehen. Unterteilte SCG Kulturen bieten fluidischen Trennung der neuronalen Zellkörper (S Abteil) und distalen Axon-Termini (N Abteil) 19. Eine Reihe von detaillierten Protokolle für den Bau und die Nutzung von compartmentalized Neuronen mit original 20 oder mutierend Campenot Kammern 17 wurden bereits veröffentlicht. Fluidic Isolierung ermöglicht selektive Infektion von neuronalen Zellkörper und den Nachweis von Nachkommenvirionen nach dem Transport zu isolierten Axon-Termini. Plating Epithelzellen über den Termini vor der Infektion bietet Rezipientenzellen für Ausbreitung der Virusinfektion.
Es gibt viele wesentliche Elemente wichtig für alle Live Cell Imaging Experimente, aber die meisten für uns relevanten Protokolle sind: automatisierte Bildaufnahme, fluoreszierende Beleuchtung, die Geschwindigkeit der Bildgebung und Umweltkontrolle. Für alle bildgebenden Experimenten verwenden wireine invertierte, automatisierte Epifluoreszenz Beleuchtung Mikroskop (Abbildung 1B). Das Mikroskop ist rund um die Nikon Eclipse-Ti Basis gebaut und beschäftigt eine Reihe von Computer gesteuert motorisierten Systeme möglichst schnell rekonfiguriert das Mikroskop während automatisierte Bildaufnahme. Für Fluoreszenz-Beleuchtung, verwenden wir ein breites Spektrum Quecksilberbogenlampe, die gedämpft werden mit Neutralfilter entlang der Beleuchtungspfad können. Anregung Filter begrenzen das Spektrum der Fluoreszenz-Beleuchtung und wenn es mit Multi-Pass-dichroitischen Spiegel und Fluoreszenzemission Filter visualisieren spezifischen fluoreszierenden Verbindungen gepaart. Die Anregungs-und Emissions-Filter werden in unabhängigen, schnelles Umschalten Filter Räder montiert, um eine schnelle sequentielle Erwerb von verschiedenen fluoreszierenden Kanäle ermöglichen. Die Geschwindigkeit der Bildaufnahme ist ferner mit einer empfindlichen und schnellen EM-CCD-Kamera, nützlich für die Detektion von niedriger Signalstärke und kurze Bild Lesezeiten verbessert. Umweltkontrolle auf der MicroscOPE ist mit einer Bühne oben Wärmeschrank und eine Objektivlinse Heizgerät Proben bei erhöhten Temperaturen zu halten, während ein befeuchtet und CO 2 angereicherten Atmosphäre in den Inkubator geleitet wird erreicht. Das Mikroskop wird in einem abgedunkelten Raum mit Umgebungstemperatur gehalten knapp 25 ° C gehalten und Außenleuchte mit Verdunkelung an allen Fenstern minimiert. Die folgenden Protokolle beschreiben die Verwendung dieses Systems für anterograde Transport und Ausbreitung Assays.
Eine Reihe von Alternativen gibt es für die Variablen des Live Cell Imaging steuern. Die Steuerung der Mikroskopie Einstellungen können manuell oder durch automatisierte Systeme abhängig von proprietärer Software durchgeführt werden. Fluoreszenz Beleuchtung kann mit Halogen-, LED-oder Laser-Quellen erreicht werden. Die Geschwindigkeit der Bildgebung durch die Geschwindigkeit der Filterwechsel und die Zeit, um das Signal mit dem gepaarten Detektionssystem sichtbar verändert. Umwelt-Steuerung kann mit spezialisierten Hardware auf dem Meilen erreicht werdenkroskop Stufe Gehäuse ganz oder teilweise von dem Mikroskop in einem erwärmten und befeuchteten Feld oder durch Erhöhen der Temperatur des Raumes, wo Mikroskopie durchgeführt wird. Jede dieser Alternativen hat Vor-und Nachteile in Bezug auf Kosten und Leistung.
In der anschließenden Protokoll, detail wir den Einsatz von Live Cell Imaging, um eine schnelle anterograde Transport und anterograde Ausbreitung von Viren alphaherpes durch den Einsatz von rekombinanten Virusstämme zu studieren. Echtzeit-Live Cell Imaging visualisiert Kapsid, Spelzen, und / oder Glykoprotein Co-Lokalisation auf dynamische Strukturen unterziehen Transport innerhalb 11 Axone. Übernachtung Zeitraffer Bildgebung compartmentalized neuronalen Kulturen visualisiert axonal virion Austritt und Infektion empfänglicher Zellen 12. Die hier vorgestellten Protokolle sind für den Einsatz mit unseren speziellen Imaging-System optimiert worden, sind aber in groben Zügen in Bezug auf die vier Elemente des Live Cell Imaging präsentiert. In der Diskussion, die wirwird näher einige der Optimierung, die notwendig für eine erfolgreiche Experimente ist.
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Protocol
Abschnitt 1 - Environmental Control Bedingungen für die Live-Zelle Fluoreszenzmikroskopie
- 30 min vor jeder Imaging Experiment anschließen und beginnen Erwärmung des Mikroskops top Inkubator.
- Schalten Sie Mikroskop, Durchlicht und epifluoreszenten Lichtquellen und automatisierte Hardware-Bedienelemente. Öffnen Sie die Mikroskop-Software, NIS Elements, um das Mikroskop anschließen und beginnen Abkühlen der EM-CCD-Kamera.
- Bringen Objektiv wärmer entsprechende Ziel (entweder 60X oder 100X Öl-Immersion). Hinweis: Wählen Sie Objektivlinse auf Experiment Typ. Die 100X Differential-Interferenz-Kontrast (DIC) ist am besten für die Verfolgung von anterograde Transport virion Baugruppen während der Phase 60X Ziel geeignet ist, anterograden Ausbreitung visualisieren. Lower Vergrößerung, haben Nicht-Öl-Immersions-Objektive erfordern eine Linse wärmer als sie nicht machen direktem Kontakt mit der Probe.
- Bringen Bühne top Inkubator auf den motorisierten Stufe mi kop. Sicherstellen, dass die entsprechenden Einsatzes, halten sich die Probe im Ort wird. Befestigen Sie die befeuchtete Luft Linie aus dem Inkubator Kontrolle an den Eingangs-Port auf der Bühne oben Inkubator.
- Schalten Sie Inkubator und Objektiv wärmer Kontrollen und Temperatur einstellen Einstellungen vorher überprüft spezifischen Bedingungen für die objektive und Probe abgebildet (siehe Diskussion).
- Öffnen Sie das Regelventil auf dem 5% CO 2/95% atmosphärischen Tank zu CO 2 ergänzt Luft nach oben bieten Inkubator zu inszenieren. Die Strömungsgeschwindigkeit sollte zwischen 60 und 80 ml Gas pro Minute. Schnellere Preise werden in umfangreichen Probe Austrocknung trotz der Befeuchtungskammer führen.
- In Objektiv Öl Objektiv und sofort legen die Kultur, die in die Stufe oben Inkubator abgebildet werden.
- Erlauben Äquilibrierung der Temperatur in der Kultur für ein Minimum von 10 min. Eine Stunde wird bevorzugt, vor allem für Übernachtung Bildgebung in Abschnitt 3 beschrieben.
- Sechs bis acht Stunden vor der Bildgebung, infizieren 35 mm Deckglas-bottom Schale der reifen, distanzierte SCG Neuronen mit 1 x 10 6 Plaque-bildenden Einheiten des Virus von Interesse (siehe Tabelle 1 zB Viren) mit der Methode in Taylor et beschrieben al. 2012a 11. Wird die Prüfung mehr als ein Virus, off-set Impfungen von 30-60 min bis zum Abbilden von sequentiellen Proben zu ähnlichen Zeiten nach der Infektion zu ermöglichen.
- Legen Gericht in die Stufe oben Inkubator für ein Minimum von 10 Minuten vor der Ausführung jedes Experiment. Während die Temperatur im Gleichgewicht, wird der Brennebene Verschiebung und wird sich negativ auf alle bildgebenden Experimenten.
- Mit Durchlicht und dem Okular des Mikroskops, finden Sie einen neuronalen Zellkörper, die eine deutlich isoliert axonal Erweiterung. Alternativ verwenden Sie die entsprechende Fluoreszenz-Beleuchtung zu einer Zelle, die Detektoren findenTabelle Mengen von fluoreszierenden Proteinen. Es ist wichtig, um die Exposition der Probe Fluoreszenzbeleuchtung begrenzen, in diesem Schritt und die folgenden Schritte durch Licht induzierten Zellschäden und Bleichen von fluoreszierenden Proteinen.
- Dämpfen Fluoreszenzbeleuchtung um die Intensität des Anregungslichts auf dem die Zellen ausgesetzt zu reduzieren. Engage Lichtdämpfungsmittel Neutral Density (ND)-Filter in der Fluoreszenz Beleuchtungslichtweg. Bei Filmen, die länger als 1 min, ein Minimum von ND4 muss verwendet werden, um Foto-Bleichen von fluoreszierenden Proteinen und umfangreiche Foto-Schäden der Axone zu verhindern. Stark fluoreszierende Strukturen können in der Regel visualisiert werden mit einem ND8-Filter im Ort.
- Mit dem Mikroskop-Software (Abbildung 2 und Supplemental Film 1A), schalten Sie das Licht-Pfad zum EM-CCD-Kamera.
- Bestimmen Sie optimale Bildgebung und-bedingungen für jeden Kanal Fluoreszenz.
- Starten Sie eine Live-Bild-Fenster mit dem "Play"-Taste. </ Li>
- Bestimmen Sie die optimalen Belichtungseinstellungen der Kamera für jeden fluoreszierenden Proteins. Nicht mehr als 300 ms pro Kanal als motional Aberrationen schnelllebigen virion Strukturen auftreten. Nutzen Sie die EM Verstärkung der Kamera auf eine Einstellung von 300 (Hersteller empfohlene maximale Verstärkung), um die Exposition zu minimieren und verbessern Erkennung von schwachen Signalen. Korrigieren Belichtungszeiten sollte einen Bild mit niedriger Intensität Hintergrund und hohe spezifische Signale.
- Nach dem Einstellen Expositionen und der Suche nach einem gut definierten Bereich des Axon, muss die Software konfiguriert ist, um automatisierte Bildaufnahme durchzuführen. Stoppen Sie den Live-Aufnahmen Fenster Probe zu verhindern Bleichen.
- In der NIS Elements-Software, wählen Sie die 6D - Definieren / Ausführen Experiment Anwendung aus der "Applications" Dropdown-Menü.
- In der ND Erwerb Fenster klicken Sie auf die Registerkarte Zeit, die die Frequenz der Bildaufnahme bestimmen. Legen Sie die Interval auf "Keine Verzögerung" und die Dauer bis 5 min. The Software wird dann erwerben Bildrahmen bei der höchsten Frequenz möglich Dauer von 5 min.
- Wählen Sie den "Lambda"-Reiter, die Auswahl der voreingestellten Hardware-Konfigurationen für mehrere fluoreszierende Bildaufnahme verwendet werden können. Klicken Sie auf das erste Feld und in der nachfolgenden Dropdown-Menü, um eine geeignete Hardware-Konfiguration wählen. Wiederholen Sie dies für alle fluoreszierenden Proteinen, die abgebildet werden.
- Sicherstellen, dass die Tabs für "XY Positionen", "Z-Serie" und "Großes Bild" sind abgewählt.
- Über den Registerkarten wählen Sie das Kästchen mit der Aufschrift "Save to File", um automatisch Bilder speichern auf der Festplatte während der Aufnahme. Konfigurieren Sie den Speicherort und den Dateinamen des Experiments Ausgabedatei. Als sequentielle Experimente durchgeführt werden, wird die Software eine sequentielle Zahl am Ende des bezeichneten Dateinamen hinzuzufügen.
- Sobald alle Registerkarten ausgewählt wurden. Initiieren Sie das Experiment, indem Sie auf den "Run-Now"-Button.
- Optimieren Sie die Bildaufnahmerate durch Belichtungseinstellungen und image Größe. Mit einem kleinen Bereich der bedruckbaren Bereich wird oft beschleunigen Rahmen Abtastraten. Definieren Sie die Region of Interest mit dem ROI-Tool in NIS-Elements, Auswählen eines Bereichs zwischen 25% und 50% des gesamten Bildbereich. Alternativ werden kürzere Belichtungszeiten erhöhen Rahmen Erfassungsraten, verringert aber die Qualität des Signals (siehe Diskussion).
Abschnitt 3 - Overnight Zeitraffer-Imaging von Anterograde Spread-Events
- Vier Stunden vor der Bildgebung, infizieren compartmentalized neuronalen Kultur auf einer 35 mm μ-Dish konstruiert. Impfen neuronalen Zellkörper mit 1 x 10 6 Plaque-bildenden Einheiten des Virus von Interesse (siehe Tabelle 1 zB Viren) mit der Methode in Taylor et al. 2012b 12.
- Sanft legen Kulturschale in die Stufe oben Inkubator. Sicherstellen, dass die Position des Objektivs auf die Seite der Schale festgelegt ist. Langsam bringen das Ziel in den Mittelpunkt, ensurING das Ziel nicht Push-up in die Probe. Sobald der Fokus Feld identifiziert worden ist, bewegen sich langsam das Ziel in der Mitte der Schale, in der Nähe der inneren Barriere Demarkierung der Innenseite der Axon Fach. Während der Bewegung sicherzustellen, die Fokustiefe gehalten wird und vermeiden treibt in der Probe. Durchbiegung der Kunststoffoberfläche durch das Objektiv beschädigt die Axone und Kunststoff.
- In etwa 2 ml warmem (~ 37 ° C) Phosphat-gepufferter Salzlösung in die Kulturschale außerhalb des Teflon-Ring. Diese umgibt den neuronalen Kultur mit einem Ring von PBS zu Probe Dehydratisierung zu minimieren und Wärmedämmung.
- Erlauben Temperatur für mindestens 1 Stunde vor dem Einleiten ins Gleichgewicht automatisierte Bildaufnahme (3.8). Steps 3.5 durch 3.7 können während dieser Zeit konfiguriert werden.
- Beschränken Sie die Intensität der Beleuchtung auf der niedrigst möglichen Ebene durch Einbeziehung aller Neutralfilter. Dies ermöglicht häufige Bildaufnahme over lange Zeiträume ohne übermäßige Foto-Schäden. Reduzierung Beleuchtung wird in Low-Signal führen, erfordern längere Belichtungszeiten (siehe Diskussion).
- Verwenden historischen Belichtungseinstellungen oder vor dem Versuchsaufbau erzeugen eine parallel Gericht aus infizierten Epithelzellen exprimieren die Ziel-fluoreszierende Proteine zu Belichtungseinstellungen zu etablieren, wie in Abschnitt 2.5 beschrieben.
- Nach dem Einstellen Forderungen für die notwendigen Kanäle, ist es Zeit, um die Software für die automatisierte Bildaufnahme konfigurieren. Stoppen Sie den Live-Aufnahmen Fenster Probe begrenzen Bleichen.
- In Elements Software (Abbildung 2 und ergänzende Film 2), wählen Sie die 6D - Definieren / Ausführen Experiment Anwendung aus der "Applications" Dropdown-Menü, um das ND Acquisition Fenster.
- In ND Acquisition-Fenster auf die Registerkarte Uhrzeit. Legen Sie die Interval auf "5 min". Stellen Sie die Dauer auf 20 Stunden. Die Schlaufen Feld wird automatisch für die Anzahl der Wiederholungen der progra berechnet werdenm führt.
- Wählen Sie den "Lambda"-Registerkarte. Klicken Sie auf das erste Feld und in der nachfolgenden Dropdown-Menü wählen Sie die entsprechende Lambda-Konfiguration für Phase Kontrast. Wiederholen für nachfolgende Positionen eine entsprechende Konfigurationen für jedes fluoreszierende Protein abzubildenden.
- Wählen Sie das "Große Bild"-Registerkarte, die die Parameter von mehreren Bildern zu einem einzigen größeren Sichtfeld kombiniert werden bestimmt. Eine ziemlich große Gebiet besteht aus 5 x 2 Bildern mit einem 7% Nähte überlappen. Dies wird für die maximale Anzahl der Zellen pro Lage, ohne Auswirkungen auf die Häufigkeit der Bildaufnahme abgebildet werden können. Auch deaktivieren Sie das Kontrollkästchen für "Close Active Shutter während Bühne Bewegung". Diese Option steigert die Geschwindigkeit der Übernahme durch Rollläden schließt nicht zwischen den Bildern.
- Wählen Sie den "XY Position"-Registerkarte, um mehrere Positionen, die nacheinander in parallel werden im Laufe der Nacht Film wird abgebildet identifizieren. Wählen Sie Positionen, die das Zentrum po definierenint für jeden großen Bildbereich. Wählen Sie 6-8 Bild Positionen in der Probe. Ein gutes Bild, werden kleine Gruppen von Zellen in enger Apposition zu klar definierten Axone haben. Zellen sollten nicht auf der jeweils anderen und Axon Bündelung gestapelt werden sollte minimiert werden. Der Brennpunkt ist der Kern der Zelle. Positionieren des Ziels, so dass eine definierte Kernhülle für die Mehrheit der Zellen gesehen wird.
- Sicherstellen, dass der "Z-Serie" Registerkarte abgewählt wird.
- Konfigurieren Sie die Auto-Save-Funktion, wie oben beschrieben in Abschnitt 2.6.5.
- Testen Sie die Belichtung und die Position Einstellungen durch Klicken auf "1 Mal loop". Bewerten Sie die resultierenden Bilder für Durchlicht-Beleuchtung, Fokus und Rahmung. Wenn der Fokus verschoben hat, setzen Sie den Fokus für jede Position unter der Registerkarte XY. Warten Sie 10 min und wiederholen Sie diesen Schritt, bis Fokus ist stabil.
- Nachdem alle Einstellungen überprüft und getestet wurde, starten Sie die automatische Experiment, indem Sie auf den "Run Now"-Button.
Abschnitt 4 - Bildverarbeitung und Export
Data Export
- Datensätze während der Live-Cell-Imaging des Verkehrs oder Verbreitung Veranstaltungen erhalten sollten aus der NIS Elements-Software in gängige Dateitypen werden für die spätere Verwendung in Präsentationen und Publikationen (Supplemental Movie 3) exportiert. So exportieren Filme öffnen Sie das entsprechende Rohmaterial. Nd2 Datei in NIS Elements und wählen Sie die "Split-Anteil" im Hinblick auf die gewünschten Kanäle fluoreszierenden visualisieren. Wiedergabe der Datei mit einer geeigneten Geschwindigkeit; 5 Bildern pro Sekunde ist ein guter Ausgangspunkt für die Visualisierung der schnellen Transport.
- Fügen Sie einen Zeitstempel, eine Echtzeituhr während der Filmwiedergabe zu vertreten. Auf das Bild mit der rechten Maustaste und wählen Sie, ND-Informationen hinzufügen. Ein digitaler Zähler wird in der oberen linken Ecke angezeigt.
- Bearbeiten Sie den Zeitstempel, um Informationen anzuzeigen. Rechts auf der Theke auf und wählen Sie Bearbeiten ND-Informationen. In der anschließenden Pop-up-Fenster, den Text bearbeiten, um die Phantasie widerspiegelnng Parameter, die wichtig sind. Bearbeiten Schriftart, Farbe und Größe für Klarheit.
- Zum Menü "Bearbeiten" und finden Sie "Create view Momentaufnahme" oder drücken Sie die "x"-Taste. Dieser Befehl öffnet die "Ansicht Snapshot"-Fenster. Wählen Sie "Zu allen Frames anwenden", um eine 8-Bit-, RGB-, Export-ready-Datei mit den fluoreszierenden Kanäle aus dem gesamten Film zu erzeugen.
- Speichern als. AVI-Datei für Cross-Plattform-Kompatibilität. Stellen Sie die Wiedergabe bei 200 ms pro Frame. Die. AVI-Dateien durch NIS Elements erzeugt wird, kann dann weiter mit anderen Konvertierungs-Software werden in den gewünschten Dateityp komprimiert.
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Representative Results
Anterograde Transport
Anwendung dieses Protokolls, um Infektionen von dissoziierten SCG Kulturen mit PRV 348 hat ein rekombinantes PRV-Stamm, die GFP-US9 und GM-mCherry Membranfusionsproteine, die Visualisierung der anterograde Transport von Virionen (Abbildung 3 und Supplemental Movie 4) erleichtert. Incorporation dieser Fusionsproteine in virale Partikel zu deren Erkennung auf den Transport puncta und den genannten bildgebenden Bedingungen minimieren die jedes Fluorophor auf einem sich bewegenden Teilchen während Filterbeschaltung ausgeglichen. In einem Drei-Minuten-Bildgebung Fenster sind zahlreiche Transport puncta häufig beobachtet und große Stichprobenumfang für Kolokalisationsanalysen schnell generiert. Wir haben bereits die Kolokalisation von GFP-US9 quantifiziert, die alphaherpes Virus axonal Targeting-Protein, mit anderen strukturellen Proteinen mit diesem Ansatz 11. Ähnliche Analysen anderer Dual recombinant PRV Stämme wurden auch 11, und die jüngsten Arbeiten hat die Co-Transport von PRV Proteine mit einem fluoreszierend markierten Host-Motor-Protein in einer weiteren Verlängerung des Protokolls 21 dokumentiert. Verwendung schnelles Umschalten Filter Räder und gepaart Multi-Pass-dichroitische Spiegel ermöglicht eine schnelle sequentielle Erwerb von zwei oder mehr fluoreszierende Kanäle. Wir erzielen derzeit zweikanaligen sequentielle Aufnahme bei Geschwindigkeiten von bis zu 0,8 Bildern pro Sekunde. Für Einzel-Kanal-Video-Mikroskopie, die nur durch die Fluoreszenz Belichtungszeit und-Lese-Zeit der Kamera begrenzt ist, können wir erreichen, Erwerb Raten von mehr als 6 Bildern pro Sekunde.
Anterograde Verbreitung
Um anterograden Ausbreitung Ereignisse sichtbar zu machen, werden die Bereiche von Interesse visualisiert alle 5 bis 10 Minuten für eine 20 Stunden-Zeitraum, während dieser Zeit wird unten Virionen transportieren und Austritt von Axonen, die Infektion der Nähe Epithelzellen. Ein repräsentativer Rahmen aus dem Großbild sinda ist in 4A und Supplemental Film 5 dargestellt. Notieren Sie sich die räumlich getrennten Art der fluoreszierenden Protein exprimierenden Zellen, deuten auf eine primäre Infektion von Axonen. Infizierte Zellen können nach hinten während des Films auf die fluoreszierenden Kapside, die die virale Infektion ausgelöst visualisieren verfolgt werden. Diese einzelnen Zellen können aus dem großen Rahmen isoliert und verfolgt werden, ohne einen signifikanten Verlust an Details. Der Vertreter Rahmen (4B) aus der ergänzenden Film 6 zeigt eine Zeit nach Virionen haben die fluoreszierenden Kapsid in das Zytoplasma hinterlegt.
Data Analysis
Eine Reihe von verschiedenen Analysen auf Live-Cell-Imaging Datensätze einschließlich particle tracking, Kolokalisationsstudien und Quantifizierung von Virion Ausbreitung Veranstaltungen durchgeführt werden. Wir führen oft unsere Analysen direkt in der NIS Elements Software oder die Verwendung eines Plug-In-Erweiterung für die ImaGej Softwarepaket ermöglicht. nd2 Dateityp Unterstützung. Verschiedene Hypothesen und Versuchsaufbauten erfordern einzigartige analytische Methoden. Unsere Gruppe hat Methoden zur Beurteilung der Kolokalisation von fluoreszierenden Proteinen auf dynamische Strukturen 11,21 und Zeitraffer-Quantifizierung der einzelnen Partikel verteilt Veranstaltungen 10,12,22 beschrieben. Die Methoden beschreiben in diesem Manuskript und unsere früheren Studien sind flexibel und können auf verschiedene virale Infektionen sowie den Transport von zellulären Strukturen, wie zB Mitochondrien 23 angewendet werden.
Abbildung 1. Schematische Darstellung der Mikroskopie einzurichten für Live Cell Imaging. A), Kultur-Typen für Studien der anterograde Transport (dissoziiert) und anterograde Ausbreitung (Kammern), die jeweils eingesetzt werden. Panel 1 ist eine Phase Kontrast Bild von einer reifen, distanzierte-Superior Halsganglien (SCG). Panel 2 ist eine schematische Darstellung des compartmentalized Kultur-System, in Panel 3 abgebildet, mit SCG Neuronen in das linke Fach mit axonalen Projektionen, die sich unter der internen Barrieren in der rechten Kammer. B) Das invertierte Epifluoreszenzmikroskop und Bühne top Inkubator Konfiguration verwendet überzogen für Video-Mikroskopie Experimente. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
Abbildung 2. NIS-Elements-Software-Schnittstelle. Ein Screenshot von einer Standard-Benutzeroberfläche in NIS-Elements wird angezeigt. Die Play und Stop-Tasten steuern die Live-Bild-Fenster Darstellung der aktuellen Hardware-Konfigurationen für die Bildgebung als auch, was wird derzeit abgebildet. Auf der Oberseite sind eine Reihe von voreingestellten Konfigurationen Optical Hardware se umzusetzenttings das Mikroskop für trans-beleuchtete oder Fluoreszenz-Detektion konfigurieren. Die Kamera-Steuerung und Belichtungseinstellungen ermöglichen die Konfiguration von Kamera-Erkennung, um die Bildqualität und Geschwindigkeit zu optimieren. Alle Versuche werden koordiniert mit ND Acquisition Kontrollen. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
Abbildung 3. Live Cell Imaging von SCG Axone bei 8 Stunden nach der Infektion mit PRV 348. PRV 348 infizierten Neuronen exprimieren den GFP-US9 und GM-mCherry Membranfusionsproteine. Anterograde transportierenden Strukturen innerhalb distalen Axone visualisiert in zwei fluoreszierende Kanäle, GFP und mCherry. Eine anterograde transportierende Struktur (weißer Pfeil) schreitet im Axon wie in den aufeinander folgenden Bildern aus der ergänzenden Movie 4 genommen dargestellt. Die beiden fluoreszierenden Proteinen sind spativerbünden aufgrund der Aufnahme von fluoreszierenden Kanäle und die schnelle Bewegung von viralen Strukturen versetzt. Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
Abbildung 4. Übernachtung Zeitraffer Bildgebung anterograden Verbreitung Ereignisse von infizierten Axone epithelialen Zellhaufen in einem Multi-Color-Infektion. Repräsentative Bilder von einer einzigen Position, Großbild gefliesten Zeitraffer-Film von Virion Übertragung von PRV 427 infizierten Axone in Empfänger Epithelzellen. A) Eine fusionierte Bild der übertragenen, YFP und RFP fluoreszierende Bilder zu einem Zeitpunkt nach der Infektion, wo Rezipientenzellen beginnen, die YFP-CAAX und VP26-mRFP Fusionsproteine exprimieren. In der zweiten Platte sind die YFP und RFP Kanäle zusammen gezeigt. Notieren Sie sich die große Anzahl von mRFP puncta Associated mit den Axon Traktate. Dies sind montiert Virionen unterziehen Fernverkehr innerhalb Axone (Supplemental Movie 2). Der weiße Kasten stellt den Bereich von Interesse in Teil B B markiert) repräsentatives Bild des Empfängers Epithelzellen enthält infizieren Kapsid Baugruppen (Siehe auch Supplemental Movie 3). Panel 1 ist eine Zusammenführung der gesendeten und RFP-Kanälen. Panel 2 ist die RFP-Kanal allein. Panel 3 ist das RFP-Kanal mit einer schematischen Darstellung des Zellkontur (durchgezogene weiße Linie), Kern (Hash-weiße Linie) und Axone (blaue Linien). Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
Supplemental Film 1. Software-Einstellungen für eine schnelle, fortlaufende Übernahme von Axonen Virionen. Die Schritte bei der Bestimmung Belichtungseinstellungen, Konfiguration ND Erwerb Kontrollen und den Erwerb einer schnellen Frame Erwerb mo verbundenvie von fluoreszierenden Virionen unterziehen axonalen Transport wird vorgestellt. Die SCG Neuron Kultur wurde mit PRV 427 8 Stunden vor der Bildgebung. Infiziert Klicken Sie hier, um Film anzusehen .
Supplemental Movie 2. Software-Einstellungen für Nacht Bildgebung von Axon-zu-Zell-Ausbreitung. Die Schritte bei der Konfiguration ND Erwerb Kontrollen für Übernacht-Bildgebung von Axon-zu-Zell-Ausbreitung Ereignissen zugeordnet werden vorgestellt. Klicken Sie hier, um Film anzusehen .
Supplemental Movie 3. Umbau. Nd2 Dateien in vorzeigbar Film-Formate. Die Schritte mit der Umwandlung der Rohdaten verbunden. Nd2 Dateien entweder in. Avi oder. Mov für die Präsentation mit gemeinsamen Video-Player. Klicken siee zum Film zu sehen.
Supplemental Movie 4. Live Cell Imaging von SCG Axone bei 8 Stunden nach der Infektion mit PRV 348. Klicken Sie hier, um Film anzusehen .
Supplemental Film 5. Große Bildfläche Nacht Bildgebung von Axon-zu-Zell-Ausbreitung. Klicken Sie hier, um Film anzusehen .
Supplemental Film 6. Großen Bereich der Nacht Zeitraffer Bildgebung von Axon-zu-Zell-Ausbreitung. Klicken Sie hier, um Film anzusehen .
| Stamm | Genotyp | Dienstprogramm |
| PRV 341 | GFP-US9 (Membran) / mRFP-VP26 (Kapsid) Virion Transportexperimente 11 | |
| PRV 348 | GFP-US9 (Membran) / GM-mCherry (Membran) | Virion Transportexperimente 11 |
| PRV 427 | mRFP-VP26 (Kapsid) / YFP-CAAX (zelluläre Plasmamembran) | Anterograde Ausbreitung Experimente 10 |
Tabelle 1. Nützliche rekombinante PRV Stämme, fluoreszierende Fusionsproteine.
| Name | Gesellschaft | Katalog-Nummer |
| 35 mm Glasboden Kulturschale | MatTek Corporation; Ashland, MA | P35G-1.5-20-C |
| 35 mm μ-Dish | Ibidi USA LLC, Verona, WI | 81156 |
| Mikroskop Körper | Nikon Instruments Inc. | Nikon Eclipse-Ti |
| Motorisierte Mikroskop Kreuztisch | Prior Scientific, Rockland, MA | H117 ProScan Flat Top |
| Motorisierte Filterrädern | Prior Scientific | HF110 10 Positionen Filterrad |
| Fluoreszierende Lichtquelle | Lumen Dynamics; Mississauga, Ontario, Kanada | 120Q X-Cite |
| Multi-Band-Fluoreszenz-Filter-Sets | Chroma Technology Corp; Bellows Falls, VT | 89000 Sedat Quad - ET 89006 ECFP / EYFP / mCherry - ET |
| EM-CCD-Kamera | Andor Technology USA, South Windsor, CT | iXon3 897 |
| Chamlide Bühne top Umwelt Inkubator | Live Cell Instruments; Seoul, Südkorea | TC-L-10 |
| Objektiv Heizung | Bioptecs; Butler, PA | 150803-Controller150819-12-08 Heater |
| Analyse-Software | Nikon Instruments Inc.; Melville, NY | NIS Elements |
Tabelle 2. Reagenzien und Ausrüstung.
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Discussion
Das Ziel des Live Cell Imaging beobachtet biologische Prozesse, wie sie ohne signifikante Veränderung durch den Akt der Beobachtung auftreten. Umwelt-Kontrolle, die Geschwindigkeit der Bildgebung und Fluoreszenz-Beleuchtung: Dieses Ziel wird durch die Optimierung der drei Variablen erreicht. Diese inter-abhängigen Variablen müssen ausgeglichen werden, um tragfähige Abbildungsbedingungen erreichen. Die Protokolle vorgestellt nutzen spezifischen Bedingungen, die repräsentative Ergebnisse zu produzieren. Wir werden kurz auf den Umweltschutz und Beobachtungsstudien vor Schäden detailliert die spezifischen Methoden vorgestellt.
Einrichtung und Betrieb relevanten biologischen Bedingungen am Mikroskop ist für die erfolgreiche Überwachung von zellulären Ereignissen. Das Erreichen Sollzustand ist abhängig von einer Reihe von Variablen für das Mikroskop und Inkubator Konfiguration. Alle Inkubator Einstellungen sollten validiert mit Hilfe eines unabhängigen Temperaturmessung eines Mock Probe im Brutschrank genommen werdenan mehreren Positionen einschließlich; dem Punkt der objektiven Kontakt, der Mitte der Kulturschale, und dem Rand der Kulturschale. Einstellungen sollten optimiert werden, um Bereiche, die mehr als 1 sind zu minimieren ° C wärmer als 37 ° C sowie die Aufrechterhaltung einer Temperatur nahe 37 ° C an der Stelle der objektiven Kontakt. Jeder Kulturschale und objektive Konfiguration für die Bildgebung verwendet werden, müssen getestet und validiert werden vor dem Experiment. Im Idealfall würden alle Proben für die Temperatur während der Bildgebung überwacht werden, doch erweist sich dies unpraktisch für eine Reihe von Systemen und kompliziert, wenn biologisch gefährlichen Mittel eingesetzt werden. Validierung von Inkubationsbedingungen ist wichtig, da Inkubation Proben bei einer zu niedrigen oder zu hohen Temperatur kann in artifactual Ergebnisse oder schnelle zelluläre Abbau führen.
Identifizierung und Minimierung Ergebnisse aus Beobachtungsstudien Schaden ist für die Entwicklung von Protokollen wichtig. Häufige Beleuchtung ändern können biologische Prozesse, irreversibly inaktivieren fluoreszierende Moleküle oder induzieren eine Reihe von Zelltod Wege. Validieren Temperatur ist wichtig, biologisch ähnlichen Bedingungen auf der Stufe oben analog zu denen eines Standard-Gewebekultur-Inkubator reproduzieren. Controlling für die Auswirkungen der häufigen Beleuchtung ist schwieriger und erfordert oft iterative trial and error Praktiken. Vergleicht man parallel Proben in Gewebekulturen Inkubatoren für morphologische Unterschiede oder biologisch relevanten Veränderungen gehalten werden kann, ob Live-Cell-Imaging-Bedingungen führt zu einer signifikanten zelluläre Toxizität. In den hier beschriebenen Experimenten haben wir die Produktivität der Virusinfektion durch Virustiter sowie Ausmaß der Ausbreitung des Virus zwischen Zellen überwacht.
Erreichen Echtzeit-Bildgebung des schnellen Transport innerhalb Axone erfordert die Optimierung der Bildaufnahme Geschwindigkeit neben der Intensität der Fluoreszenz Beleuchtung. Die Geschwindigkeit der Bildaufnahme wird durch die Kamer bestimmta-Einstellungen und das Mikroskop Hardware, insbesondere bei der Erhebung mehrere fluoreszierende Kanäle sequentiell. Beleuchtungsstärke beeinflusst die Qualität der fluoreszierenden Signale und die Geschwindigkeit des Erwerbs. Länger Beleuchtungsstärke eine einfachere Visualisierung von fluoreszierenden Proteinen, insbesondere für diejenigen, die zu Teilchen in geringen Mengen enthalten. Allerdings wird die Probe bleichen schneller aus und erhöhte phototoxische Schaden erleiden. Reduzierung Beleuchtung durch Neutraldichtefilter erfordert längere Belichtungszeiten, wodurch die Frequenz der Bildaufnahme und möglicherweise zu räumlichen Verformung der fluoreszierenden Strukturen aufgrund ihrer Bewegung während der Erfassung. Finden die richtige Balance von Beleuchtungsintensität mit Bildaufnahme Frequenz hängt stark von dem fluoreszierenden Protein und dem Signal von Motilität der Struktur untersucht. Es ist nur notwendig, um genügend Signal an die fluoreszierenden Strukturen über dem Hintergrund unterscheiden erwerben, anstatterzeugen kontrastreiche Bilder, die längere Belichtungszeiten erfordern.
Übernachtung Zeitraffer Bildgebung nutzt eine ähnliche Hardwarekonfiguration wie Echtzeit-Live-Cell-Imaging sondern wird maßgeblich durch angesammelte Foto-Schäden mit langfristigen, häufige Fluoreszenzbeleuchtung verbunden beeinflusst. Im Gegensatz zu Echtzeit-Bildgebung, ist die Notwendigkeit, Fluoreszenz Beleuchtungsstärke begrenzen entscheidend, und alle anderen Variablen werden zur Berücksichtigung dieser Einschränkung geändert. Die Begrenzung der Intensität der Exposition ermöglicht häufigere Beleuchtung von mehreren fluoreszierenden Kanäle ohne wesentliche Beschädigung der abgebildeten Zellen. Anterograde Axon-zu-Zell-Ausbreitung Ereignisse sind zeitlich und räumlich disparate, so Bildgebung ein großer Bereich ist wichtig, da viele dieser seltenen Ereignissen wie möglich zu erfassen.
Eine Reihe von Veröffentlichungen haben gründliche Übersichten und Empfehlungen für Live Cell Imaging Praktiken 24-26 vorgesehen. Die Protokolle detailliert hier représent unser Bestes versucht, um die Auswirkungen der Fluoreszenz-Bildgebung auf die virale Replikation, Transport und Ausbreitung zu minimieren und gleichzeitig die Erhaltung der wesentlichen Merkmale von viralen Infektionen. Kombiniert man diese Protokolle mit der sorgfältigen Entwicklung von fluoreszierenden Fusionsproteine und robust neuronalen Kulturen hat meine grundlegenden Fragen der Herpesvirus-Infektion und Pathogenese beantwortet.
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Disclosures
Wir haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
LWE und RK werden von der US National Institutes of Health Zuschüsse R37 NS033506-16 und R01-03 NS060699 unterstützt. MPT wurde von einem American Cancer Society Postdoctoral Research Fellowship (PF-10-057-01-MPC) unterstützt. Die Beratung und das Wissen von Dr. Matthew Lyman und Dr. Oren Kobiler waren maßgeblich an der Gestaltung des Mikroskops Konfiguration und Live Cell Imaging Verfahren. Wir verlängern auch dank Neal Barlow und Brian T. Kain von Nikon Instruments für ihre technische Unterstützung bei der Anschaffung, Installation und Performance des Mikroskops.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm glass bottom culture dish | MatTek Corporation; Ashland, MA | P35G-1.5-20-C | |
| 35 mm μ-Dish | Ibidi USA LLC, Verona, WI | 81156 | |
| Microscope body | Nikon Instruments Inc. | Nikon Eclipse Ti | |
| Motorized microscope X-Y stage | Prior Scientific; Rockland, MA | H117 ProScan Flat Top | |
| Motorized filter wheels | Prior Scientific | HF110 10 position filter wheel | |
| Fluorescent illumination source | Lumen Dynamics; Mississauga, Ontario Canada | X-Cite 120Q | |
| Multi-band Fluorescence filter sets | Chroma Technology Corp.; Bellows Falls, VT | 89000 Sedat Quad - ET 89006 ECFP/EYFP/mCherry - ET | |
| EM-CCD camera | Andor Technology USA; South Windsor, CT | iXon3 897 | |
| Chamlide stage top environmental incubator | Live Cell Instruments; Seoul, South Korea | TC-L-10 | |
| Objective lens heater | Bioptecs; Butler, PA | 150803 Controller 150819-12-08 Heater | |
| Analysis software | Nikon Instruments Inc.; Melville, NY | NIS Elements |
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