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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Alphaherpes वायरस अग्रगामी परिवहन और बिखरा का लाइव सेल इमेजिंग

Published: August 16, 2013 doi: 10.3791/50723
Automatic Translation
1,2, 2, 2
1Department of Immunology and Infectious Diseases, Montana State University, 2Department of Molecular Biology, Princeton University

Summary

Alphaherpes वायरस के संक्रमण का लाइव सेल इमेजिंग निर्देशित परिवहन और कहनेवाला प्रसार के गतिशील घटनाओं के विश्लेषण के लिए सक्षम बनाता है. यहाँ, हम प्राथमिक न्यूरॉन्स के संक्रमण के दौरान वायरल विधानसभाओं के दृश्य की सुविधा के लिए फ्लोरोसेंट संलयन प्रोटीन व्यक्त पुनः संयोजक वायरल उपभेदों कि उपयोग के तरीके मौजूद है.

Abstract

जीवित कोशिका प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी तकनीक है, साथ ही फ्लोरोसेंट संलयन प्रोटीन व्यक्त कि पुनः संयोजक वायरल उपभेदों के निर्माण के क्षेत्र में अग्रिम परिवहन और न्यूरॉन्स के alphaherpes वायरस के संक्रमण के प्रसार का वास्तविक समय दृश्य सक्षम है. जीना सेल इमेजिंग के साथ संयोजन के रूप में वायरल झिल्ली, आवरण, और capsids को उपन्यास फ्लोरोसेंट संलयन प्रोटीन की उपयोगिता, axons के भीतर परिवहन के दौर से गुजर वायरल कण विधानसभाओं की पहचान की. इसी तरह के उपकरणों को सफलतापूर्वक कोशिकाओं के बीच संचरित virions की संख्या और विविधता यों तो वायरल कणों के प्रसार सेल सेल के विश्लेषण के लिए नियोजित किया गया है. महत्वपूर्ण बात है, अग्रगामी परिवहन और प्रसार का जीना सेल इमेजिंग तकनीक कण परिवहन वेग, कणों का वितरण, और प्रोटीन स्थानीयकरण के अस्थायी विश्लेषण सहित जानकारी का खजाना उपज. शास्त्रीय वायरल आनुवंशिक तकनीक के साथ, इन तरीकों महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान की हैमहत्वपूर्ण यंत्रवत सवालों में. इस लेख में हम विस्तार से alphaherpes वायरस परिवहन और प्रसार के बुनियादी सवालों के जवाब देने के लिए विकसित किया गया है कि इमेजिंग विधियों का वर्णन.

Introduction

Alphaherpes ऐसी दाद सिंप्लेक्स वायरस जैसे वायरस (एचएसवी) -1, -2, और pseudorabies वायरस से परिधीय तंत्रिका तंत्र (पीएन) के संक्रमण (इनका उपयोग) वायरल जीवन चक्र के दौरान कई जटिल और उच्च विनियमित कदम शामिल है. पीएन के न्यूरॉन्स के भीतर परिवहन प्राथमिक वायरल संक्रमण और बाद अंतर - मेजबान प्रसार दोनों की घटनाओं के दौरान महत्वपूर्ण है. वायरल जीवन चक्र के दो घटकों मिलाना कि आणविक तंत्र; दूर एक्सोन (अग्रगामी परिवहन) और अतिसंवेदनशील कोशिकाओं (अग्रगामी प्रसार) को virions की बाद के प्रसारण के भीतर सेल शरीर से वायरल विधानसभाओं के निर्देशन परिवहन समझ दाद रोगजनन के लिए महत्वपूर्ण हैं.

न्यूरॉन्स में वायरल कणों के परिवहन और निकास एक परिपक्व संक्रामक विरिअन 1,2 के विधानसभा पर निर्भर है. Immunofluorescence (यदि) और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) सहित पहले से तय assays है, कण विधानसभा राज्य और prot अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गयाईआईऍन बातचीत विरिअन परिवहन और प्रसार को 3-6 के साथ जुड़े. हालांकि रासायनिक निर्धारण द्वारा शुरू की परिवहन virions और प्रयोगात्मक कलाकृतियों की गतिशील प्रकृति तय छवियों 7,8 की व्याख्या चकित. हाल ही में, वायरल फ्लोरोसेंट संलयन प्रोटीन की एक संख्या प्रोटीन समारोह पर नगण्य प्रभाव डालता है कि एचएसवी और इनका उपयोग के लिए वर्णित किया गया है. कैप्सिड, आवरण, और ग्लाइकोप्रोटीन 9-11: हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) और लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (mCherry या mRFP) fluorophores अक्सर एक परिपक्व virion के तीन संरचनात्मक घटकों में से दो की इमेजिंग की अनुमति के लिए रखा जाता है. दोहरे लेबल वायरस का उपयोग अग्रगामी परिवहन के सेल इमेजिंग जीते परिवहन के दौरान वायरल कणों की विधानसभा राज्य visualizes. वायरल उपभेदों व्यक्त इसी तरह फ्लोरोफोरे संख्या और प्रसार 12,13 निम्नलिखित वायरल जीनोम की विविधता कल्पना करने के लिए उपयोग किया जाता है. फ्लोरोसेंट प्रोटीन के गुणों (14,15 में समीक्षा) बहुत प्रभाववायरल या सेलुलर विधानसभाओं कल्पना करने की क्षमता. जंगली प्रकार कार्यक्षमता के संरक्षण के लिए उपन्यास प्रोटीन fusions के डिजाइन और परीक्षण जब स्वयं बातचीत और स्थिरता सहित फ्लोरोसेंट प्रोटीन की आंतरिक गुण, विचार किया जाना चाहिए.

फ्लोरोसेंट प्रोटीन fusions, दो विट्रो सेल संस्कृति प्रणालियों में अच्छी तरह से विशेषता के साथ संयोजन के रूप में दाद वायरस के संक्रमण का जीना सेल इमेजिंग के लिए नियोजित कर रहे हैं: अलग 16 और 17 (चित्रा 1 ए) चूहा बेहतर ग्रीवा ganglia (एससीजी) न्यूरॉन्स बंटे. दोनों प्रणालियों में, भ्रूण एससीजी के एकल कोशिका निकायों के लिए अलग, विच्छेदित कर रहे हैं, और इन विट्रो संवर्धन 18 में के लिए चढ़ाया. एससीजी न्यूरॉन्स स्वायत्त तंत्रिका प्रणाली का हिस्सा हैं और आसानी से एक परिपक्व ध्रुवीकृत राज्य पूर्व vivo में सुसंस्कृत और neuronal वृद्धि कारक (NGF) के द्वारा भेदभाव किया जा सकता है. अलग एससीजी न्यूरॉन्स च की अनुमति देता है कि axons के एक नेटवर्क के विस्तार के लिए फार्मया वे अग्रगामी परिवहन 6 से गुजरना रूप में वायरल कणों के दृश्य. Compartmentalized एससीजी संस्कृतियों neuronal सेल शरीर (एस डिब्बे) और बाहर का अक्षतंतु टर्मिनी (एन डिब्बे) का 19 fluidic अलगाव प्रदान करते हैं. मूल 20 या संशोधित Campenot कक्षों 17 का उपयोग करने के लिए compartmentalized न्यूरॉन्स के निर्माण और उपयोग के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल की एक संख्या पहले से प्रकाशित किया गया है. Fluidic अलगाव neuronal सेल निकायों और अलग अक्षतंतु टर्मिनी को परिवहन के बाद संतान virions की पता लगाने के चुनिंदा संक्रमण के लिए अनुमति देता है. संक्रमण से पहले टर्मिनी अधिक उपकला कोशिकाओं चढ़ाना वायरल संक्रमण के प्रसार के लिए प्राप्तकर्ता कोशिकाओं प्रदान करता है.

वहाँ सभी जीना सेल इमेजिंग प्रयोग के लिए महत्वपूर्ण कई आवश्यक तत्व हैं, लेकिन हमारे प्रोटोकॉल के लिए सबसे अधिक प्रासंगिक हैं: स्वचालित छवि अधिग्रहण, फ्लोरोसेंट रोशनी, इमेजिंग की गति, और पर्यावरण नियंत्रण. सभी इमेजिंग प्रयोगों के लिए, हम का उपयोगएक औंधा, स्वचालित, epifluorescence रोशनी खुर्दबीन (चित्रा 1 बी). माइक्रोस्कोप निकॉन ग्रहण तिवारी बेस के चारों ओर बनाया गया है और तेजी से पुन: कॉन्फ़िगर स्वचालित छवि अधिग्रहण के दौरान माइक्रोस्कोप को कंप्यूटर नियंत्रित मोटर प्रणालियों की एक संख्या में कार्यरत है. प्रतिदीप्ति रोशनी के लिए, हम रोशनी मार्ग के किनारे तटस्थ घनत्व फिल्टर के साथ तनु हो सकता है कि एक व्यापक स्पेक्ट्रम पारा आर्क दीपक का उपयोग करें. उत्तेजना फिल्टर फ्लोरोसेंट रोशनी के स्पेक्ट्रम की सीमा और बहु ​​- पास dichroic दर्पण और प्रतिदीप्ति उत्सर्जन फिल्टर विशिष्ट फ्लोरोसेंट यौगिकों कल्पना के साथ रखा जाता है. उत्तेजना और उत्सर्जन फिल्टर विभिन्न फ्लोरोसेंट चैनलों की तेजी अनुक्रमिक अधिग्रहण सक्षम करने के लिए स्वतंत्र है, तेजी से स्विचन फिल्टर पहियों में बढ़ रहे हैं. छवि अधिग्रहण की गति आगे कम तीव्रता का संकेत है और छोटी छवि बार पढ़ने का पता लगाने के लिए उपयोगी एक संवेदनशील और तेजी ईएम सीसीडी कैमरा, के साथ बढ़ाया है. Microsc पर पर्यावरण नियंत्रणope के इनक्यूबेटर गर्म एक मंच के ऊपर और एक humidified और सीओ 2 समृद्ध वातावरण इनक्यूबेटर में पारित हो जाता है, जबकि ऊंचा तापमान पर नमूनों को बनाए रखने के लिए एक उद्देश्य लेंस हीटर के साथ हासिल की है. माइक्रोस्कोप करीब 25 से बनाए रखा परिवेश के तापमान के साथ एक अंधेरे कमरे में रखा जाता है डिग्री सेल्सियस और सभी खिड़कियों पर अंधकार पर्दे के साथ कम से कम बाहर प्रकाश. निम्नलिखित प्रोटोकॉल अग्रगामी परिवहन और प्रसार assays के लिए इस प्रणाली के उपयोग का वर्णन.

विकल्प की एक संख्या जीना सेल इमेजिंग के चर के लिए नियंत्रित करने के लिए मौजूद हैं. माइक्रोस्कोपी सेटिंग्स का नियंत्रण स्वयं या मालिकाना सॉफ्टवेयर पर निर्भर स्वचालित प्रणाली के माध्यम से किया जा सकता है. प्रतिदीप्ति रोशनी हलोजन, एलईडी या लेजर स्रोतों से प्राप्त किया जा सकता है. इमेजिंग की गति फिल्टर स्विचिंग की गति और बनती पहचान प्रणाली के साथ संकेत कल्पना करने के लिए समय से संशोधित किया गया है. पर्यावरण नियंत्रण मील पर विशेष हार्डवेयर के साथ प्राप्त किया जा सकता हैcroscope चरण, सभी या एक गर्म और humidified बॉक्स में माइक्रोस्कोप का हिस्सा है, या माइक्रोस्कोपी प्रदर्शन किया जाएगा, जहां कमरे के तापमान को ऊपर उठाने के द्वारा के बाड़े. इन विकल्पों में से प्रत्येक की लागत और प्रदर्शन करने के लिए संबंधित फायदे और नुकसान है.

बाद में प्रोटोकॉल में, हम विस्तार से पुनः संयोजक वायरल उपभेदों के उपयोग के माध्यम से तेजी से अग्रगामी परिवहन और alphaherpes वायरस के अग्रगामी प्रसार का अध्ययन करने के लिए जीना सेल इमेजिंग का उपयोग. वास्तविक समय रहते सेल इमेजिंग कैप्सिड, आवरण, और / या axons 11 भीतर परिवहन के दौर से गुजर गतिशील ढांचे पर ग्लाइकोप्रोटीन सह स्थानीयकरण visualizes. Compartmentalized neuronal संस्कृतियों के रातों रात timelapse इमेजिंग अतिसंवेदनशील कोशिकाओं 12 की axonal विरिअन निकास और संक्रमण visualizes. यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल हमारे विशेष इमेजिंग प्रणाली के साथ प्रयोग के लिए अनुकूलित किया गया है, लेकिन जीना सेल इमेजिंग के चार तत्वों के सापेक्ष व्यापक संदर्भ में प्रस्तुत कर रहे हैं. चर्चा में हमआगे विस्तार के सफल प्रयोग के लिए आवश्यक है कि अनुकूलन के कुछ होगा.

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Protocol

धारा 1 - लाइव सेल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए पर्यावरण नियंत्रण स्थितियां

  1. किसी भी इमेजिंग प्रयोग करने से पहले 30 मिनट कनेक्ट और खुर्दबीन मंच शीर्ष इनक्यूबेटर वार्मिंग शुरू करते हैं.
    1. माइक्रोस्कोप, संचारित और epifluorescent प्रकाश स्रोतों, और स्वचालित हार्डवेयर नियंत्रण पर मुड़ें. माइक्रोस्कोप से कनेक्ट और ईएम सीसीडी कैमरा ठंडा शुरू करने के लिए माइक्रोस्कोप नियंत्रण सॉफ्टवेयर, एनआईएस तत्वों, खोलें.
    2. . लेंस उपयुक्त उद्देश्य है (या तो 60X या 100X तेल विसर्जन) को गरम नोट संलग्न: प्रयोग प्रकार के आधार पर उद्देश्य लेंस का चयन करें. 60X चरण उद्देश्य अग्रगामी प्रसार कल्पना करने के लिए अनुकूल है, जबकि 100X अंतर हस्तक्षेप विपरीत (डीआईसी) अग्रगामी परिवहन विरिअन विधानसभाओं की ट्रैकिंग के लिए सबसे अच्छा है. वे नमूने के साथ सीधा संपर्क बनाने के लिए नहीं है के रूप में कम वृद्धि, गैर तेल विसर्जन उद्देश्यों एक लेंस गर्म की आवश्यकता नहीं है.
    3. मील का motorized मंच पर मंच शीर्ष इनक्यूबेटर अटैच croscope. नमूना जगह में है का आयोजन करेगा कि उचित डालने सुनिश्चित करें. इनक्यूबेटर नियंत्रण से चरण शीर्ष इनक्यूबेटर पर इनपुट बंदरगाह के लिए humidified हवा लाइन अटैच करें.
    4. इनक्यूबेटर और लेंस गर्म नियंत्रण पर बारी और (चर्चा देखने के लिए) imaged किया जा रहा उद्देश्य और नमूना के लिए विशिष्ट पहले से सत्यापित शर्तों के तापमान सेटिंग्स समायोजित.
    5. 5% सीओ 2 / शीर्ष इनक्यूबेटर चरण के लिए सीओ 2 पूरक हवा प्रदान करने के लिए 95% वायुमंडलीय टैंक पर नियंत्रण वाल्व खुला. प्रवाह की दर प्रति मिनट गैस के बीच 60 और 80 मिलीग्राम होना चाहिए. तेज़ दरों humidifying चैम्बर के बावजूद व्यापक नमूना निर्जलीकरण का परिणाम देगा.
  2. उद्देश्य लेंस के लिए लेंस तेल जोड़ें और तुरंत चरण शीर्ष इनक्यूबेटर में imaged किया जाएगा कि संस्कृति जगह है.
  3. 10 मिनट की एक न्यूनतम के लिए संस्कृति में तापमान का संतुलन की अनुमति दें. एक घंटे की विशेष रूप से धारा 3 में वर्णित रातोंरात इमेजिंग के लिए, पसंद है.
ve_title "> धारा 2 - अग्रगामी virion परिवहन घटनाक्रम प्रोटोकॉल की वास्तविक समय इमेजिंग

  1. छह से आठ घंटे इमेजिंग के लिए पहले, टेलर एट में वर्णित विधि का उपयोग हित के वायरस की 1 एक्स 10 6 पट्टिका बनाने इकाइयों के साथ परिपक्व, अलग एससीजी न्यूरॉन्स की एक 35 मिमी coverslip नीचे पकवान (उदाहरण के वायरस के लिए 1 टेबल देखें) को संक्रमित अल. 2012a 11. 30-60 मिनट के द्वारा एक से अधिक वायरस, बंद सेट inoculations के परीक्षण के समान समय के बाद संक्रमण में अनुक्रमिक नमूनों की इमेजिंग के लिए अनुमति देने के लिए हैं.
  2. किसी भी प्रयोग को चलाने से पहले 10 मिनट की एक न्यूनतम के लिए मंच शीर्ष इनक्यूबेटर में पकवान डालें. तापमान equilibrates वहीं फोकल हवाई जहाज़ जा रहा है और नकारात्मक किसी भी इमेजिंग प्रयोगों को प्रभावित करेगा.
  3. प्रेषित प्रकाश और माइक्रोस्कोप के ऐपिस का उपयोग करना, एक स्पष्ट रूप से अलग axonal विस्तार है कि एक neuronal सेल शरीर पाते हैं. वैकल्पिक रूप से, detec व्यक्त एक सेल लगाने के लिए उपयुक्त प्रतिदीप्ति रोशनी का उपयोगफ्लोरोसेंट प्रोटीन की मेज मात्रा. इसकी वजह यह प्रकाश प्रेरित सेलुलर क्षति की और फ्लोरोसेंट प्रोटीन का विरंजन, इस कदम और बाद के चरणों में, फ्लोरोसेंट रोशनी के लिए नमूने के जोखिम को सीमित करने के लिए महत्वपूर्ण है.
  4. जो कोशिकाओं को उजागर कर रहे हैं के लिए उत्तेजना प्रकाश की तीव्रता को कम करने के लिए प्रतिदीप्ति रोशनी attenuate. तटस्थ घनत्व (एनडी) प्रतिदीप्ति रोशनी प्रकाश पथ में फिल्टर attenuating प्रकाश व्यस्त हैं. अब 1 मिनट, ND4 की एक न्यूनतम से स्थायी फिल्मों फ्लोरोसेंट प्रोटीन की तस्वीर विरंजन और axons की तस्वीर क्षति व्यापक रोकने के लिए किया जाना चाहिए. अत्यधिक फ्लोरोसेंट संरचनाओं आम तौर पर जगह में एक ND8 फिल्टर के साथ देखे जा सकते हैं.
  5. माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर (चित्रा 2 और पूरक मूवी 1 ए) का उपयोग करना, ईएम सीसीडी कैमरे के लिए प्रकाश पथ स्विच.
  6. प्रत्येक फ्लोरोसेंट चैनल के लिए इष्टतम इमेजिंग समय और परिस्थितियों का निर्धारण करते हैं.
    1. "खेल" बटन का उपयोग कर एक जीवित छवि खिड़की आरंभ. </ ली>
    2. प्रत्येक फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए इष्टतम कैमरा प्रदर्शन सेटिंग्स का निर्धारण करते हैं. तेजी से बढ़ विरिअन संरचनाओं की गति का aberrations के रूप में चैनल के अनुसार 300 मिसे से अधिक मत घटित होगा. (निर्माता अधिकतम लाभ का सुझाव दिया है), समय जोखिम को कम करने और मंद संकेतों का पता लगाने में वृद्धि करने के लिए 300 का एक स्थापित करने के लिए कैमरे की EM लाभ का उपयोग. सही जोखिम बार कम पृष्ठभूमि तीव्रता और उच्च विशिष्ट संकेतों के साथ एक छवि का निर्माण करना चाहिए.
  7. जोखिम की स्थापना और अक्षतंतु की एक अच्छी तरह से परिभाषित क्षेत्र खोजने के बाद, सॉफ्टवेयर स्वचालित छवि अधिग्रहण प्रदर्शन करने के लिए कॉन्फ़िगर किया जाना चाहिए. विरंजन नमूना रोकने के लिए रहते इमेजिंग खिड़की बंद करो.
    1. एनआईएस तत्वों सॉफ्टवेयर में, 6D चयन - परिभाषित / डाउन मेनू "अनुप्रयोग" ड्रॉप से प्रयोग अनुप्रयोग चलाएँ.
    2. एनडी अधिग्रहण खिड़की में, छवि अधिग्रहण की आवृत्ति को निर्धारित करेगा जो समय टैब पर क्लिक करें. "कोई देरी" और अवधि 5 मिनट के लिए अंतराल निर्धारित करें. गुई सॉफ्टवेयर तो 5 मिनट की अवधि के लिए संभव सबसे अधिक आवृत्ति पर छवि तख्ते प्राप्त होगा.
    3. कई फ्लोरोसेंट छवि अधिग्रहण के लिए इस्तेमाल पूर्व निर्धारित हार्डवेयर विन्यास के चयन की अनुमति देता है "लैम्ब्डा" टैब का चयन करें. पहले बॉक्स पर क्लिक करें और मेनू नीचे बाद में ड्रॉप में एक उपयुक्त हार्डवेयर विन्यास का चयन करने के लिए. Imaged किया जा करने के लिए सभी फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए दोहराएँ.
    4. "XY पोजिशन", "जेड श्रृंखला" और "बड़ी तस्वीर" के लिए टैब डे चयनित हैं सुनिश्चित करें.
    5. टैब के ऊपर, चिह्नित बॉक्स स्वचालित रूप से अधिग्रहण के दौरान हार्ड डिस्क के लिए छवियों को बचाने के लिए "फाइल में सेव" का चयन करें. प्रयोग आउटपुट फाइल के स्थान और फ़ाइल नाम विन्यस्त करें. अनुक्रमिक प्रयोगों का प्रदर्शन कर रहे हैं, सॉफ्टवेयर नामित फ़ाइल नाम के अंत में एक अनुक्रमिक संख्या बढ़ जाएगा.
    6. एक बार जब सभी टैब का चयन किया गया है. "भागो अब" बटन पर क्लिक करके प्रयोग आरंभ करें.
    7. प्रदर्शन सेटिंग्स के माध्यम से छवि अधिग्रहण दर अनुकूलन और imagई आकार. छवि करने योग्य क्षेत्र के एक छोटे से क्षेत्र का उपयोग अक्सर फ्रेम अधिग्रहण की दर को गति देगा. 25% और कुल छवि क्षेत्र के 50% के बीच में एक क्षेत्र का चयन, एनआईएस तत्वों में रॉय उपकरण का उपयोग ब्याज के क्षेत्र को परिभाषित करें. वैकल्पिक रूप से, कम जोखिम बार फ्रेम अधिग्रहण की दरों में वृद्धि, लेकिन (चर्चा देखने के लिए) संकेत की गुणवत्ता कम हो जाती होगी.

धारा 3 - अग्रगामी बिखरा घटनाक्रम के ओवरनाइट समय चूक इमेजिंग

  1. इमेजिंग के लिए पहले चार घंटे, एक 35 मिमी μ-डिश पर निर्माण एक compartmentalized neuronal संस्कृति को संक्रमित. टेलर एट अल में वर्णित विधि का उपयोग (उदाहरण के वायरस के लिए 1 टेबल देखें) ब्याज के वायरस की 1 एक्स 10 6 पट्टिका बनाने इकाइयों के साथ neuronal सेल निकायों टीका लगाना. 2012b 12.
  2. धीरे चरण शीर्ष इनक्यूबेटर में संस्कृति पकवान जगह है. उद्देश्य की स्थिति पकवान की ओर करने के लिए सेट है, यह सुनिश्चित करें. धीरे धीरे ध्यान, ensur में उद्देश्य लानाउद्देश्य आईएनजी नमूना में धक्का नहीं है. फोकस क्षेत्र की पहचान की गई है, धीरे धीरे अक्षतंतु डिब्बे के आंतरिक पक्ष demarking आंतरिक बाधा के पास, डिश के केंद्र में उद्देश्य चाल. आंदोलन के दौरान फोकस गहराई को बनाए रखा है सुनिश्चित करने और नमूना में धक्का से बचें. उद्देश्य से प्लास्टिक की सतह के नीचे को झुकाव axons और प्लास्टिक नुकसान होगा.
  3. के गर्म (~ 37 डिग्री सेल्सियस) फॉस्फेट Teflon के रिंग के बाहर संस्कृति डिश के लिए खारा buffered. लगभग 2 मिलीलीटर जोड़ें यह नमूना निर्जलीकरण को कम करने और थर्मल इन्सुलेशन प्रदान करने के लिए पीबीएस की एक अंगूठी के साथ neuronal संस्कृति के चारों ओर.
  4. तापमान स्वचालित छवि अधिग्रहण (3.8) की शुरुआत करने से पहले 1 घंटे की एक न्यूनतम के लिए संतुलित करने की अनुमति दें. 3.7 के माध्यम से कदम 3.5 इस समय के दौरान विन्यस्त किया जा सकता है.
  5. सभी तटस्थ घनत्व फिल्टर उलझाने हुए कम से कम संभव स्तर तक रोशनी की तीव्रता को सीमित करें. यह लगातार छवि अधिग्रहण ove अनुमति देगातस्वीर क्षति अत्यधिक बिना आर लंबे समय अवधि. रोशनी को कम करना अब जोखिम (चर्चा देखने के लिए) की आवश्यकता होती है, कम संकेत में परिणाम होगा.
  6. ऐतिहासिक प्रदर्शन सेटिंग्स या सेट अप धारा 2.5 में वर्णित के रूप में लक्ष्य फ्लोरोसेंट प्रोटीन प्रदर्शन सेटिंग्स स्थापित करने के लिए व्यक्त संक्रमित उपकला कोशिकाओं का एक समानांतर पकवान उत्पन्न प्रयोगात्मक करने से पहले का उपयोग करें.
  7. आवश्यक चैनलों के लिए जोखिम निर्धारित करने के बाद, यह स्वचालित छवि अधिग्रहण के लिए सॉफ्टवेयर विन्यस्त करने के लिए समय है. विरंजन नमूना सीमित करने के लिए रहते इमेजिंग खिड़की बंद करो.
    1. तत्वों सॉफ्टवेयर (चित्रा 2 और पूरक फिल्म 2) में, 6D चयन - एन डी अधिग्रहण खिड़की को लाने के लिए नीचे "अनुप्रयोग" ड्रॉप मेनू से प्रयोग आवेदन परिभाषित / चलाएँ.
    2. एनडी अधिग्रहण विंडो में, समय टैब पर क्लिक करें. "5 मिनट" करने के अंतराल निर्धारित करें. 20 घंटे के लिए अवधि निर्धारित करें. छोरों क्षेत्र स्वचालित रूप से कार्यक्रम के repetitions की संख्या के लिए गणना की जाएगीमीटर प्रदर्शन करेंगे.
    3. "लैम्ब्डा" टैब का चयन करें. पहले बॉक्स पर क्लिक करें और मेनू नीचे बाद में ड्रॉप में चरण विपरीत के लिए उपयुक्त लैम्ब्डा विन्यास का चयन करें. Imaged किया जा प्रत्येक फ्लोरोसेंट प्रोटीन के लिए उपयुक्त विन्यास का चयन, बाद के पदों के लिए दोहराएँ.
    4. देखने का एक भी बड़े क्षेत्र में जोड़ा जा करने के लिए कई छवियों के मानकों को निर्धारित करता है जो "बड़ी छवि" टैब का चयन करें. एक अच्छा आकार के क्षेत्र में एक 7% सिलाई ओवरलैप का उपयोग कर 5 एक्स 2 छवियों के होते हैं. इस छवि के अधिग्रहण की आवृत्ति को प्रभावित किए बिना imaged किया जा स्थिति प्रति कोशिकाओं की अधिकतम संख्या के लिए अनुमति देगा. इसके अलावा, "स्टेज आंदोलन के दौरान बंद सक्रिय शटर" के लिए चेकबॉक्स अचयनित. यह विकल्प छवियों के बीच के दरवाज़े बंद नहीं द्वारा अधिग्रहण की गति को बढ़ाती है.
    5. , "XY पोजिशन" टैब का चयन क्रमिक रूप से रात में फिल्म के दौरान समानांतर में imaged किया जाएगा कि कई स्थानों की पहचान करने के लिए. केंद्र पो परिभाषित है कि पदों का चयन करेंहर बड़ी छवि क्षेत्र के लिए int. नमूने में 6-8 छवि पदों का चयन करें. एक अच्छी छवि क्षेत्र स्पष्ट रूप से परिभाषित एक्सोन के करीब समानाधिकरण में कोशिकाओं के छोटे समूहों के लिए होगा. कोशिकाओं को कम से कम किया जाना चाहिए, एक दूसरे को और अक्षतंतु bundling के ऊपर ढेर नहीं किया जाना चाहिए. ध्यान देने की बात यह सेल के नाभिक है. एक स्पष्ट रूप से परिभाषित परमाणु लिफाफा कोशिकाओं के बहुमत के लिए देखा जाता है कि इस तरह के उद्देश्य स्थिति.
    6. "जेड श्रृंखला" टैब deselected है सुनिश्चित करें.
    7. ऊपर धारा 2.6.5 में वर्णित के रूप में ऑटो बचाने सुविधा विन्यस्त करें.
    8. "1 समय पाश" पर क्लिक करके जोखिम और स्थिति सेटिंग्स का परीक्षण करें. प्रेषित प्रकाश रोशनी, ध्यान, और तैयार करने के लिए जिसके परिणामस्वरूप छवियों का मूल्यांकन. ध्यान स्थानांतरित कर दिया गया है, XY टैब के तहत प्रत्येक स्थिति के लिए ध्यान केंद्रित रीसेट. 10 मिनट रुको और ध्यान स्थिर है जब तक इस चरण को दोहराएँ.
    9. सभी सेटिंग्स को सत्यापित किया है और परीक्षण किया गया है, "अब भागो" बटन पर क्लिक करके स्वचालित प्रयोग आरंभ करें.

    धारा 4 - छवि प्रसंस्करण और निर्यात

    डेटा निर्यात

    1. परिवहन या प्रसार घटनाओं का जीना सेल इमेजिंग के दौरान प्राप्त डेटासेट प्रस्तुतियों और प्रकाशन (पूरक मूवी 3) में बाद में उपयोग करने के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किया फ़ाइल प्रकारों में एनआईएस तत्वों सॉफ्टवेयर से निर्यात किया जाना चाहिए. एनआईएस तत्वों में फिल्मों उपयुक्त कच्चे. Nd2 फ़ाइल खोलने के निर्यात और वांछित फ्लोरोसेंट चैनलों कल्पना करने के लिए "विभाजन घटक" दृश्य का चयन करने के लिए. प्लेबैक एक उपयुक्त गति से फाइल, प्रति सेकंड 5 फ्रेम तेजी से परिवहन के दृश्य के लिए एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु है.
    2. फिल्म प्लेबैक के दौरान एक वास्तविक समय घड़ी का प्रतिनिधित्व करने के लिए एक टाइमस्टैम्प शामिल करें. छवि पर राइट क्लिक करें और चुनें, एन डी-जानकारी जोड़ें. एक डिजिटल काउंटर ऊपरी बाएँ कोने में दिखाई देगा.
      1. जानकारी प्रदर्शित करने के लिए समय टिकट संपादित करें. सही काउंटर पर क्लिक करें और संपादित एन डी जानकारी का चयन करें. बाद पॉप अप विंडो में, imagi प्रतिबिंबित करने के लिए पाठ संपादितमहत्वपूर्ण है कि एनजी मापदंडों. स्पष्टता के लिए संपादित करें फ़ॉन्ट, रंग और आकार.
    3. "संपादन" मेनू पर जाएँ और "दृश्य स्नैपशॉट बनाएँ" या "एक्स" कुंजी दबाते हैं. इस आदेश को "देखने स्नैपशॉट" विंडो खुलती है. का चयन एक 8 बिट, आरजीबी, पूरी फिल्म से फ्लोरोसेंट चैनलों युक्त निर्यात के लिए तैयार फाइल उत्पन्न करने के लिए "सभी फ्रेम पर लागू होते हैं".
    4. पार मंच संगतता के लिए एक. AVI फ़ाइल के रूप में सहेजें. फ्रेम प्रति 200 मिसे में पार्श्व दर निर्धारित करें. एनआईएस तत्वों द्वारा उत्पन्न की. AVI फ़ाइलें तो आगे वांछित फ़ाइल प्रकार में अन्य रूपांतरण सॉफ्टवेयर के साथ संकुचित किया जा सकता है.

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Representative Results

अग्रगामी परिवहन

इनका उपयोग 348 के साथ अलग एससीजी संस्कृतियों के संक्रमण के लिए इस प्रोटोकॉल के अनुप्रयोग, GFP-Us9 और ग्राम mCherry झिल्ली संलयन प्रोटीन व्यक्त एक पुनः संयोजक इनका तनाव, virions की अग्रगामी परिवहन (चित्रा 3 और पूरक मूवी 4) के दृश्य में मदद की है. Puncta ले जाने पर उनकी पहचान में वायरल कणों परिणाम, और aforementioned इमेजिंग परिस्थितियों में इन संलयन प्रोटीन का समावेश फिल्टर स्विचिंग के दौरान एक चलती कण पर प्रत्येक फ्लोरोफोरे की भरपाई कम से कम. एक तीन मिनट की इमेजिंग खिड़की में, कई परिवहन puncta सामान्यतः मनाया जाता है और colocalization विश्लेषण के लिए बड़ा नमूना आकार तेजी से उत्पन्न कर रहे हैं. हम पहले से GFP-Us9 की colocalization मात्रा निर्धारित है, alphaherpes वायरस axonal इस दृष्टिकोण 11 का उपयोग अन्य संरचनात्मक प्रोटीन के साथ, प्रोटीन को लक्षित. अन्य दोहरी recombinan के समान विश्लेषणटी इनका उपयोग उपभेदों भी 11 में वर्णित किया गया है, और हाल ही में काम इस प्रोटोकॉल 21 का एक और विस्तार में एक fluorescently टैग मेजबान मोटर प्रोटीन के साथ इनका उपयोग प्रोटीन की सह परिवहन दस्तावेज है. तेजी से स्विचन फिल्टर पहियों और बनती बहु - पास dichroic दर्पण का उपयोग दो या अधिक फ्लोरोसेंट चैनलों की तेजी अनुक्रमिक अधिग्रहण की अनुमति देता है. हम वर्तमान में प्रति सेकंड 0.8 फ्रेम करने के लिए ऊपर की गति पर दो चैनल अनुक्रमिक अधिग्रहण को प्राप्त कर सकते हैं. केवल कैमरे के प्रतिदीप्ति जोखिम समय और पढ़ने के लिए समय से सीमित है जो एक चैनल वीडियो माइक्रोस्कोपी के लिए, हम प्रति सेकंड 6 फ्रेम से बड़ा अधिग्रहण की दर हासिल कर सकते हैं.

अग्रगामी बिखरा

अग्रगामी प्रसार घटनाओं कल्पना, हित के क्षेत्रों को समय virions नीचे परिवहन और axons से निकास, पास उपकला कोशिकाओं को संक्रमित जाएगा जिसके दौरान एक 20 घंटे की अवधि के लिए हर 5 से 10 मिनट, कल्पना कर रहे हैं. बड़ी छवि से एक प्रतिनिधि फ्रेम हैंएक चित्रा -4 ए और पूरक मूवी 5 में प्रस्तुत किया है. एक्सोन से प्राथमिक संक्रमण का संकेत फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त कोशिकाओं के spatially अलग प्रकृति नोट. संक्रमित कोशिकाओं वायरल संक्रमण शुरू की कि फ्लोरोसेंट capsids कल्पना करने के लिए फिल्म के दौरान पीछे की ओर लगाया जा सकता है. ये व्यक्ति की कोशिकाओं बड़े फ्रेम से अलग और विस्तार का एक महत्वपूर्ण नुकसान के बिना लगाया जा सकता है. पूरक मूवी 6 से प्रतिनिधि फ्रेम (चित्रा 4 बी) virions cytoplasm में फ्लोरोसेंट कैप्सिड जमा करने के बाद एक समय दर्शाया गया है.

डेटा विश्लेषण

अलग विश्लेषण की एक श्रेणी कण ट्रैकिंग, colocalization अध्ययन, और विरिअन प्रसार घटनाओं की मात्रा का ठहराव सहित रहते सेल इमेजिंग डेटासेट पर प्रदर्शन किया जा सकता है. हम अक्सर सीधे एनआईएस तत्वों सॉफ्टवेयर में हमारे विश्लेषण प्रदर्शन या एक प्लग - इन का उपयोग उपलब्ध एक्सटेंशन भारतीय सैन्य अकादमी के लिएकि geJ सॉफ्टवेयर पैकेज के लिए सक्षम बनाता है. nd2 फ़ाइल प्रकार का समर्थन है. अलग परिकल्पना और प्रयोगात्मक setups अद्वितीय विश्लेषणात्मक तरीकों की जरूरत. हमारे समूह गतिशील संरचनाओं 11,21 और व्यक्तिगत कण फैल घटनाओं 10,12,22 के समय चूक मात्रा का ठहराव पर फ्लोरोसेंट प्रोटीन की colocalization का आकलन करने के लिए विधियों का वर्णन किया गया है. तरीके में इस पांडुलिपि में वर्णन है और हमारे पिछले अध्ययनों लचीला कर रहे हैं और विभिन्न वायरल संक्रमण के साथ ही सेलुलर संरचनाओं के परिवहन, जैसे माइटोकांड्रिया 23 को लागू किया जा सकता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. माइक्रोस्कोपी के योजनाबद्ध जीना सेल इमेजिंग के लिए निर्धारित किया है. ए) संस्कृति प्रकार अग्रगामी परिवहन (अलग) और अग्रगामी प्रसार (संभाग) क्रमशः की पढ़ाई के लिए कार्यरत हैं. पैनल 1 एक परिपक्व, अलग सुपीरियर सरवाइकल ganglia (एससीजी) का एक चरण विपरीत छवि है. पैनल 2 तक सही डिब्बे. बी) उल्टे epifluorescent खुर्दबीन और इस्तेमाल चरण शीर्ष इनक्यूबेटर विन्यास में आंतरिक बाधाओं के नीचे विस्तार axonal अनुमानों के साथ छोड़ दिया डिब्बे में चढ़ाया एससीजी न्यूरॉन्स के साथ, पैनल 3 में कल्पना के लिए compartmentalized संस्कृति प्रणाली का एक योजनाबद्ध है, वीडियो माइक्रोस्कोपी प्रयोगों के लिए. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2
चित्रा 2. एनआईएस तत्वों सॉफ्टवेयर इंटरफ़ेस. एनआईएस तत्वों में एक मानक यूजर इंटरफेस के स्क्रीनशॉट को प्रदर्शित किया जाता है. प्ले और स्टॉप बटन रहते छवि खिड़की के रूप में अच्छी तरह से वर्तमान में imaged किया जा रहा है के रूप में इमेजिंग के लिए मौजूदा हार्डवेयर विन्यास चित्रण नियंत्रित करते हैं. शीर्ष पैनल भर पूर्व निर्धारित हार्डवेयर से लागू है कि ऑप्टिकल विन्यास की एक श्रृंखला रहे हैंट्रांस प्रबुद्ध या प्रतिदीप्ति का पता लगाने के लिए माइक्रोस्कोप विन्यस्त करने के लिए ttings. कैमरा नियंत्रण और प्रदर्शन सेटिंग्स कैमरे का पता लगाने के विन्यास छवि गुणवत्ता और गति का अनुकूलन करने के लिए अनुमति देते हैं. सभी प्रयोगों एनडी अधिग्रहण नियंत्रण का उपयोग समन्वय कर रहे हैं. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 3
चित्रा 3. इनका उपयोग 348 से 8 घंटे के बाद संक्रमण में एससीजी axons की सेल इमेजिंग जीते. इनका उपयोग 348 संक्रमित न्यूरॉन्स GFP-Us9 और ग्राम mCherry झिल्ली संलयन प्रोटीन व्यक्त करते हैं. बाहर का axons के भीतर अग्रगामी-परिवहन ढांचे के दो फ्लोरोसेंट चैनलों, GFP और mCherry में कल्पना कर रहे हैं. पूरक मूवी 4 से लिया अनुक्रमिक छवियों में दर्शाया के रूप में एक अग्रगामी, परिवहन संरचना (सफेद तीर) अक्षतंतु भीतर प्रगति. दो फ्लोरोसेंट प्रोटीन spati हैंसहयोगी फ्लोरोसेंट चैनलों और वायरल संरचनाओं का तेजी से आंदोलन की अनुक्रमिक अधिग्रहण की वजह से बंद सेट. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 4
4 चित्रा. एक बहु - रंग संक्रमण के दौरान उपकला सेल समूहों को संक्रमित एक्सोन से अग्रगामी प्रसार घटनाओं की रातों रात timelapse इमेजिंग. एक ही स्थान, प्राप्तकर्ता उपकला कोशिकाओं में इनका उपयोग 427 संक्रमित एक्सोन से विरिअन संचरण की बड़ी छवि टाइलों फिल्म समय चूक से प्रतिनिधि छवियाँ. ए) प्राप्तकर्ता कोशिकाओं YFP-CAAX और VP26-mRFP संलयन प्रोटीन व्यक्त करने लगे हैं जहां एक समय के बाद संक्रमण पर प्रेषित, YFP और आरएफपी फ्लोरोसेंट छवियों का एक विलय छवि. दूसरे पैनल में, YFP और आरएफपी चैनलों को एक साथ दिखाया गया है. MRFP puncta संघों के बड़ी संख्या में नोटअक्षतंतु इलाकों के साथ ciated. इन axons के भीतर लंबी दूरी की परिवहन (पूरक मूवी 2) के दौर से गुजर इकट्ठे virions हैं. सफेद बॉक्स) को संक्रमित capsid विधानसभाओं युक्त प्राप्तकर्ता उपकला कोशिकाओं के प्रतिनिधि छवि (पूरक मूवी भी 3 देखें) भाग बी बी में प्रकाश डाला हित के क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है. पैनल 1 प्रेषित और आरएफपी चैनलों की एक मर्ज है. पैनल 2 अकेले आरएफपी चैनल है. पैनल 3 एक योजनाबद्ध सेल रूपरेखा (ठोस सफेद लाइन) का प्रतिनिधित्व, नाभिक (hashed सफेद लाइन), और axons (ब्लू लाइन) के साथ आरएफपी चैनल है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

पूरक मूवी 1. Axonal virions की तेजी, अनुक्रमिक अधिग्रहण के लिए सॉफ्टवेयर सेटिंग्स., प्रदर्शन सेटिंग्स का निर्धारण एनडी अधिग्रहण नियंत्रण को विन्यस्त, और एक तेजी से फ्रेम अधिग्रहण मो प्राप्त करने के साथ जुड़े कदमaxonal परिवहन के दौर से गुजर फ्लोरोसेंट virions की होड़ में प्रस्तुत किया है. एससीजी न्यूरॉन संस्कृति आठ घंटे इमेजिंग के लिए पहले इनका उपयोग 427 से संक्रमित किया गया था. फिल्म देखने के लिए यहां क्लिक करें .

पूरक मूवी 2. सॉफ्टवेयर अक्षतंतु के लिए सेल प्रसार के रातोंरात इमेजिंग के लिए सेटिंग्स. अक्षतंतु के लिए सेल प्रसार घटनाओं की रात भर इमेजिंग के लिए एन डी अधिग्रहण नियंत्रण को विन्यस्त के साथ जुड़े कदमों प्रस्तुत कर रहे हैं. फिल्म देखने के लिए यहां क्लिक करें .

पूरक मूवी 3. के रूपांतरण. सामने फिल्म स्वरूपों में nd2 फ़ाइलें. कच्चे डेटा परिवर्तित करने के साथ जुड़े कदमों. आम वीडियो खिलाड़ियों का उपयोग प्रस्तुति के लिए nd2 फ़ाइलें. AVI या. Mov फ़ाइल स्वरूपों में या तो. उसे क्लिक करेंफिल्म देखने के लिए ई.

पूरक मूवी 4. इनका उपयोग 348 से 8 घंटे के बाद संक्रमण पर एक्सोन एससीजी के सेल इमेजिंग जीते. फिल्म देखने के लिए यहां क्लिक करें .

पूरक मूवी 5. के अक्षतंतु के लिए सेल प्रसार. रातोंरात इमेजिंग के बड़े छवि क्षेत्र फिल्म देखने के लिए यहां क्लिक करें .

पूरक मूवी 6. के अक्षतंतु के लिए सेल प्रसार. रातोंरात timelapse इमेजिंग के बढ़े हुए क्षेत्र फिल्म देखने के लिए यहां क्लिक करें .

तनाव आनुवंशिक रूप उपयोगिता
इनका उपयोग 341 GFP-Us9 (झिल्ली) / mRFP-Vp26 (capsid) Virion परिवहन प्रयोगों 11
इनका उपयोग 348 GFP-Us9 (झिल्ली) / ग्राम mCherry (झिल्ली) Virion परिवहन प्रयोगों 11
इनका उपयोग 427 mRFP-VP26 (capsid) / YFP-CAAX (सेलुलर प्लाज्मा झिल्ली) अग्रगामी प्रसार प्रयोगों 10

तालिका 1. फ्लोरोसेंट संलयन प्रोटीन व्यक्त उपयोगी पुनः संयोजक इनका उपयोग उपभेदों.

नाम कंपनी सूची संख्या
35 मिमी गिलास नीचे संस्कृति पकवान MatTek निगम, Ashland, एमए P35G-1.5-20-सी
35 मिमी μ-डिश Ibidi LLC संयुक्त राज्य अमरीका, वेरोना, WI 81156
माइक्रोस्कोप शरीर Nikon उपकरण इंक नीkon ग्रहण तिवारी
Motorized माइक्रोस्कोप XY मंच पहले वैज्ञानिक, रॉकलैंड, एमए H117 ProScan फ्लैट टॉप
Motorized फिल्टर पहियों पहले वैज्ञानिक HF110 10 स्थिति फिल्टर पहिया
फ्लोरोसेंट रोशनी के स्रोत लुमेन गतिशीलता, मिसिसॉगा, ओंटारियो कनाडा 120Q एक्स उद्धृत
मल्टी बैंड प्रतिदीप्ति फिल्टर सेट Chroma प्रौद्योगिकी कार्पोरेशन, धौंकनी फॉल्स, वीटी 89000 Sedat ट्रैक्टर - एट 89006 ECFP / EYFP / mCherry - एट
ईएम सीसीडी कैमरा Andor प्रौद्योगिकी संयुक्त राज्य अमेरिका, दक्षिण विंडसर, सीटी iXon3 897
Chamlide चरण शीर्ष पर्यावरण इनक्यूबेटर सेल उपकरण रहते हैं, सियोल, दक्षिण कोरिया टीसी एल -10
ऑब्जेक्टिव लेंस हीटर Bioptecs, बटलर, फिलीस्तीनी अथॉरिटी 150803 नियंत्रक150819-12-08 हीटर
विश्लेषण सॉफ्टवेयर Nikon उपकरण इंक, मेलविल, एनवाई एनआईएस तत्वों

तालिका 2. विशिष्ट अभिकर्मकों और उपकरण.

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Discussion

वे अवलोकन के अधिनियम द्वारा महत्वपूर्ण परिवर्तन के बिना हो ही जीना सेल इमेजिंग के लक्ष्य जैविक प्रक्रियाओं को देख रहा है. पर्यावरण नियंत्रण, इमेजिंग की गति, और प्रतिदीप्ति रोशनी: इस लक्ष्य को तीन चर अनुकूलन द्वारा हासिल की है. इन परस्पर निर्भर चर व्यवहार्य इमेजिंग की स्थिति प्राप्त करने के लिए संतुलित किया जाना चाहिए. प्रस्तुत प्रोटोकॉल प्रतिनिधि परिणामों के उत्पादन के लिए विशेष परिस्थितियों का उपयोग. हम संक्षेप में प्रस्तुत विशिष्ट विधियों का विवरण से पहले पर्यावरण नियंत्रण और अवलोकन नुकसान पर चर्चा करेंगे.

माइक्रोस्कोप पर प्रासंगिक जैविक शर्तों की स्थापना करने और बनाए रखने सेलुलर घटनाओं के सफल निगरानी के लिए महत्वपूर्ण है. लक्ष्य की स्थिति हासिल करने माइक्रोस्कोप और इनक्यूबेटर विन्यास के लिए विशिष्ट चर के एक नंबर पर निर्भर है. सभी इनक्यूबेटर सेटिंग्स लिया इनक्यूबेटर में एक नकली नमूना के एक स्वतंत्र तापमान माप का उपयोग कर मान्य किया जाना चाहिएउद्देश्य संपर्क के बिंदु, संस्कृति पकवान के बीच, और संस्कृति पकवान की बढ़त; सहित कई पदों पर. सेटिंग्स 1 से अधिक क्षेत्रों है कि कम से कम करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए 37 डिग्री सेल्सियस से गरम डिग्री सेल्सियस के साथ ही करीब 37 डिग्री सेल्सियस उद्देश्य संपर्क के बिंदु पर एक तापमान बनाए रखने. इमेजिंग के लिए इस्तेमाल प्रत्येक संस्कृति पकवान और उद्देश्य के विन्यास का परीक्षण किया है और प्रयोग करने से पहले मान्य होना चाहिए. आदर्श रूप में, सभी के नमूने इमेजिंग के दौरान तापमान के लिए निगरानी की, लेकिन इस सिस्टम के एक नंबर के लिए अव्यावहारिक साबित होता है और जैविक खतरनाक एजेंट कार्यरत हैं जब जटिल है किया जाएगा. ऊष्मायन शर्तों के मान्यकरण artifactual परिणाम या तेजी से सेलुलर गिरावट में परिणाम कर सकते हैं भी कम या एक तापमान के बहुत कम नमूने incubating के रूप में महत्वपूर्ण है.

पहचान करना और पर्यवेक्षणीय नुकसान से उत्पन्न होने वाले परिणामों को कम प्रोटोकॉल के विकास के लिए महत्वपूर्ण है. लगातार रोशनी जैविक प्रक्रियाओं, IRR बदल सकते हैंeversibly फ्लोरोसेंट अणु निष्क्रिय, या सेलुलर मौत रास्ते में से एक नंबर प्रेरित. तापमान मान्य कर एक मानक टिशू कल्चर इनक्यूबेटर के उन अनुरूप करने के लिए मंच के शीर्ष पर जैविक रूप से इसी तरह की स्थिति को पुन: पेश करने के लिए महत्वपूर्ण है. लगातार रोशनी के प्रभाव को नियंत्रित करने के लिए और अधिक कठिन और अक्सर परीक्षण और त्रुटि प्रथाओं चलने की आवश्यकता है. रूपात्मक मतभेद या जैविक प्रासंगिक परिवर्तन के लिए ऊतक संस्कृति इन्क्यूबेटर में रखा समानांतर नमूनों की तुलना कर सकते हैं निर्धारित महत्वपूर्ण सेलुलर विषाक्तता में जीना सेल इमेजिंग शर्तों परिणाम है. यहाँ वर्णित प्रयोगों में, हम कोशिकाओं के बीच वायरल प्रसार के वायरल अनुमापांक के साथ ही सीमा के माध्यम से वायरल संक्रमण की उत्पादकता पर नजर रखी है.

एक्सोन के भीतर तेजी से परिवहन की वास्तविक समय इमेजिंग हासिल प्रतिदीप्ति रोशनी की तीव्रता के साथ छवि अधिग्रहण की गति का अनुकूलन की आवश्यकता है. छवि अधिग्रहण की गति camer के द्वारा निर्धारित किया जाता हैक्रमिक रूप से कई फ्लोरोसेंट चैनलों का संग्रह है, खासकर जब एक सेटिंग और माइक्रोस्कोप हार्डवेयर,. रोशनी की तीव्रता फ्लोरोसेंट संकेतों की गुणवत्ता और अधिग्रहण की दर को प्रभावित करता है. ग्रेटर रोशनी तीव्रता विशेष रूप से कम मात्रा में कणों में शामिल है कि उन लोगों के लिए फ्लोरोसेंट प्रोटीन का आसान दृश्य, की अनुमति देता है. हालांकि, नमूना बढ़ाया phototoxic क्षति से ब्लीच तेजी से और भुगतना होगा. तटस्थ घनत्व फिल्टर के माध्यम से रोशनी को कम छवि अधिग्रहण की आवृत्ति को कम करने और संभावित रूप से पता लगाने के दौरान उनके आंदोलन के कारण फ्लोरोसेंट संरचनाओं के स्थानिक विकृति के कारण, अब जोखिम समय की आवश्यकता है. छवि अधिग्रहण आवृत्ति के साथ रोशनी की तीव्रता का सही संतुलन ढूँढना फ्लोरोसेंट प्रोटीन संकेत और अध्ययन किया जा रहा संरचना की गतिशीलता की दर पर बहुत निर्भर करता है. यह पृष्ठभूमि से ऊपर फ्लोरोसेंट संरचनाओं भेद करने के लिए पर्याप्त संकेत प्राप्त है, बजाय केवल आवश्यक हैअब जोखिम समय की आवश्यकता है कि उच्च विपरीत छवियों का उत्पादन.

रातों रात timelapse इमेजिंग वास्तविक समय रहते सेल इमेजिंग के रूप में एक समान हार्डवेयर विन्यास का इस्तेमाल करता है, लेकिन काफी लंबे समय तक, लगातार प्रतिदीप्ति रोशनी के साथ जुड़े संचित तस्वीर क्षति से प्रभावित है. वास्तविक समय इमेजिंग के विपरीत, प्रतिदीप्ति रोशनी की तीव्रता को सीमित करने की आवश्यकता सर्वोपरि है, और अन्य सभी चर इस प्रतिबंध के लिए खाते में संशोधित कर रहे हैं. जोखिम की तीव्रता को सीमित करना काफी छवि कोशिकाओं को नुकसान पहुँचाए बिना कई फ्लोरोसेंट चैनलों की अधिक लगातार रोशनी के लिए अनुमति देता है. अग्रगामी अक्षतंतु के लिए सेल प्रसार घटनाओं अस्थायी और स्थानिक असमान हैं, इमेजिंग एक बड़े क्षेत्र संभव के रूप में इन निराला घटनाओं के रूप में कई कब्जा करने के लिए आवश्यक है.

प्रकाशनों की संख्या जीना सेल इमेजिंग प्रथाओं 24-26 के लिए पूरी तरह से सारांश और सिफारिशें प्रदान की है. यहाँ विस्तृत प्रोटोकॉल represईएनटी वायरल संक्रमण के आवश्यक सुविधाओं के संरक्षण, जबकि वायरल प्रतिकृति, परिवहन, और प्रसार पर प्रतिदीप्ति इमेजिंग के प्रभाव को कम करने के लिए अपनी तरफ से पूरी कोशिश करता है. फ्लोरोसेंट संलयन प्रोटीन और मजबूत neuronal संस्कृतियों के सावधान विकास के साथ इन प्रोटोकॉल का मेल दाद संक्रमण और रोगजनन की मेरी मौलिक सवालों का जवाब दिया है.

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Disclosures

हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

वामपंथी उग्रवाद और आर.के. स्वास्थ्य अनुदान R37 NS033506-16 और R01 NS060699-03 के अमेरिकी राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा समर्थित हैं. एमपीटी एक अमेरिकन कैंसर सोसायटी Postdoctoral रिसर्च फैलोशिप (पीएफ-10-057-01-एमपीसी) द्वारा समर्थित किया गया था. डा. मैथ्यू लीमन और डॉ. ओरेन Kobiler की सलाह और ज्ञान खुर्दबीन विन्यास और जीना सेल इमेजिंग तरीकों को डिजाइन करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई थी. हम भी माइक्रोस्कोप का अधिग्रहण, स्थापना और प्रदर्शन में उनकी तकनीकी सहायता के लिए नील बारलो और Nikon उपकरण के ब्रायन टी. भैया को धन्यवाद देती हूं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm glass bottom culture dish MatTek Corporation; Ashland, MA P35G-1.5-20-C
35 mm μ-Dish Ibidi USA LLC, Verona, WI 81156
Microscope body Nikon Instruments Inc. Nikon Eclipse Ti
Motorized microscope X-Y stage Prior Scientific; Rockland, MA H117 ProScan Flat Top
Motorized filter wheels Prior Scientific HF110 10 position filter wheel
Fluorescent illumination source Lumen Dynamics; Mississauga, Ontario Canada X-Cite 120Q
Multi-band Fluorescence filter sets Chroma Technology Corp.; Bellows Falls, VT 89000 Sedat Quad - ET 89006 ECFP/EYFP/mCherry - ET
EM-CCD camera Andor Technology USA; South Windsor, CT iXon3 897
Chamlide stage top environmental incubator Live Cell Instruments; Seoul, South Korea TC-L-10
Objective lens heater Bioptecs; Butler, PA 150803 Controller 150819-12-08 Heater
Analysis software Nikon Instruments Inc.; Melville, NY NIS Elements

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References

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