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Bioengineering

Biodegradable polymeric नैनोकणों प्रयोग चिकित्सीय angiogenesis के लिए प्रोग्रामिंग स्टेम सेल

Published: September 27, 2013 doi: 10.3791/50736
Automatic Translation
*1, *1,2, 1,2
1Department of Orthopaedic Surgery, Stanford University, 2Department of Bioengineering, Stanford University
* These authors contributed equally

Summary

हम biodegradable polymeric नैनोकणों का उपयोग angiogenesis के लिए चिकित्सकीय कारकों overexpress के लिए प्रोग्रामिंग स्टेम कोशिकाओं की विधि का वर्णन. वर्णित प्रक्रियाओं विट्रो में वसा व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं transfecting, और एक murine hindlimb ischemia के मॉडल में angiogenesis को बढ़ावा देने के लिए प्रोग्राम स्टेम कोशिकाओं की प्रभावकारिता मान्य बहुलक संश्लेषण में शामिल हैं.

Abstract

नियंत्रित संवहनी वृद्धि सफल ऊतक उत्थान और घाव भरने, साथ ही इस तरह के स्ट्रोक, दिल का दौरा या परिधीय धमनी रोगों के रूप में इस्कीमिक रोगों के इलाज के लिए के लिए महत्वपूर्ण है. वाहिकाजनक वृद्धि कारकों की सीधी डिलीवरी नए रक्त वाहिका विकास को प्रोत्साहित करने की क्षमता है, लेकिन अक्सर इस तरह के लक्ष्य निर्धारण और इन विवो में कम आधा जीवन की कमी के रूप में सीमाओं के साथ जुड़ा हुआ है. जीन थेरेपी वाहिकाजनक कारकों जीन एन्कोडिंग देने से एक वैकल्पिक दृष्टिकोण प्रदान करता है, लेकिन अक्सर वायरस का उपयोग की आवश्यकता है, और सुरक्षा चिंताओं द्वारा सीमित है. यहाँ हम biodegradable polymeric नैनोकणों उपयोग बगल में वाहिकाजनक कारकों overexpress के लिए प्रोग्रामिंग स्टेम सेल से संवहनी विकास उत्तेजक के लिए एक हाल ही में विकसित की रणनीति का वर्णन. विशेष रूप से हमारी रणनीति विवो में इस्कीमिक ऊतकों की ओर विस्थापित करने की क्षमता का लाभ लेने के द्वारा वितरण वाहनों के रूप में स्टेम कोशिकाओं का उपयोग किया. अनुकूलित polymeric वैक्टर, वसा व्युत्पन्न का प्रयोगस्टेम सेल संवहनी endothelial वृद्धि कारक (VEGF) एन्कोडिंग एक वाहिकाजनक जीन overexpress करने के लिए संशोधित किया गया है. हम बहुलक संश्लेषण, nanoparticle गठन, इन विट्रो में स्टेम कोशिकाओं transfecting, साथ ही एक murine hindlimb ischemia के मॉडल में angiogenesis को बढ़ावा देने के लिए VEGF व्यक्त स्टेम कोशिकाओं की प्रभावकारिता मान्य करने के लिए तरीके के लिए प्रक्रियाओं का वर्णन किया.

Introduction

इस तकनीक के समग्र लक्ष्य ischemia के स्थल पर चिकित्सकीय कारकों overexpressing गैर virally क्रमादेशित स्टेम कोशिकाओं का उपयोग चिकित्सीय angiogenesis को बढ़ावा देना है. स्टेम कोशिकाओं को प्रयोगशाला में संश्लेषित biodegradable नैनोकणों का उपयोग पूर्व vivo पहले संशोधित, और फिर angiogenesis और ऊतक उबार बढ़ाने के लिए अपनी क्षमता को मान्य करने के लिए hindlimb ischemia के एक murine मॉडल में प्रत्यारोपित किया गया.

नियंत्रित संवहनी विकास एक महत्वपूर्ण सफल ऊतक उत्थान के घटक है, साथ ही इस तरह के स्ट्रोक, अंग ischemia, और रोधगलन के रूप में विभिन्न इस्कीमिक रोगों के इलाज के लिए है. कई रणनीतियों वृद्धि कारक वितरण और सेल आधारित चिकित्सा सहित संवहनी विकास को बढ़ावा देने के लिए विकसित किया गया है. 1 पशु रोग मॉडल में मनाया प्रभावकारिता के बावजूद, इन तरीकों अभी भी अपर्याप्त ऐसी वृद्धि कारक प्रसव के लिए supraphysiological खुराक के लिए आवश्यकता के रूप में सीमाओं का सामना, या पैराक्राइनअकेले कोशिकाओं द्वारा जारी. ऊपर सीमाओं को पार करने के लिए एक संभावित रणनीति स्टेम सेल थेरेपी और स्टेम कोशिकाओं आनुवंशिक रूप से वांछनीय चिकित्सकीय कारकों overexpress को पूर्व vivo पहले प्रत्यारोपण के लिए प्रोग्राम कर रहे हैं जिससे जीन थेरेपी, गठबंधन है. यह दृष्टिकोण आदि hindlimb ischemia 2, हृदय रोग 3, हड्डी चिकित्सा 4 और तंत्रिका चोट 5, सहित विभिन्न रोग मॉडल में प्रदर्शित किया गया है. हालांकि, ज्यादातर जीन थेरेपी तकनीक ऐसी संभावित प्रतिरक्षाजनकता और insertional mutagenesis के रूप में सुरक्षा चिंताओं के साथ जुड़े रहे हैं जो वायरल वैक्टर, पर भरोसा करते हैं. गैर वायरल जीन वितरण मध्यस्थता बायोमैटिरियल्स इन सीमाओं को पार, लेकिन अक्सर कम अभिकर्मक दक्षता से पीड़ित हो सकता है. कुशल गैर वायरल जीन डिलीवरी के लिए उपन्यास biomaterials की खोज में तेजी लाने के लिए, हाल ही के अध्ययन मिश्रित रसायन और उच्च throughput स्क्रीनिंग दृष्टिकोण कार्यरत है. पाली (β-अमीनो तों के रूप में biodegradable बहुलक पुस्तकालयोंमंत्रियों) (PBAE) पारंपरिक polymeric वेक्टर समकक्षों की तुलना में स्पष्ट रूप से बढ़ाया अभिकर्मक दक्षता के साथ अग्रणी पॉलिमर की खोज हुई है, जो विकसित और जांच की गई है. 6-7

इस के साथ साथ, हम hindlimb ischemia के एक murine मॉडल में संवहनी endothelial वृद्धि कारक (VEGF) overexpressing आनुवंशिक रूप से संशोधित ADSCs के बाद प्रत्यारोपण के द्वारा पीछा किया, PBAE के संश्लेषण और इन विट्रो में वसा व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं (ADSCs) transfect करने की क्षमता के सत्यापन का वर्णन . परिणाम, bioluminescence इमेजिंग का उपयोग सेल भाग्य पर नज़र रखने के लेजर डॉपलर छिड़काव इमेजिंग (LDPI) का उपयोग ऊतक reperfusion का आकलन करने, और ऊतक विज्ञान द्वारा angiogenesis और ऊतक निस्तारण का निर्धारण द्वारा मूल्यांकन किया गया.

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Protocol

1. बहुलक संश्लेषण

  1. एक धूआं हुड में, butanediol diacrylate (सी) के 3,523 मिलीग्राम बाहर तौलना और हलचल पट्टी युक्त एक गिलास जगमगाहट शीशी को हस्तांतरण.
  2. पूर्व गर्मी 5 अमीनो-1-pentanol (32) नमक solubilize से 90 डिग्री सेल्सियस के लिए, तो एक दाढ़ अनुपात में परिणाम होगा एक धूआं हुड में, 1,533 मिलीग्राम 32 बाहर तौलना और इस विधि सी. युक्त जगमगाहट शीशी को जोड़ने सी की 32 = 1:1.2.
  3. इसके तत्काल बाद एक हलचल थाली पर दोनों के समाधान युक्त शीशी जगह है. 600 rpm पर हलचल गति सेट करें.
  4. 90 डिग्री सेल्सियस पर सेट एक ओवन को जगमगाहट शीशी स्थानांतरण 4 घंटा के लिए 1000 rpm पर सेट करें सरगर्मी गति. हलचल बार अटक जाता है, गति कम है. 4 घंटा बाद, कम 300 RPM को गति और एक और 12-16 घंटे के लिए 90 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें.
  5. एक हलचल पट्टी युक्त एक गिलास जगमगाहट शीशी में निर्जल tetrahydrofuran (THF) का 10 मिलीलीटर C32 के 5 ग्राम जोड़ें. पूरी तरह से भंग कर दिया जब तक उच्च पर पन्नी और भंवर में लपेटें.
  6. एक अलग कांच जगमगाहट शीशी conta मेंएक हलचल बार ining, Tetraethyleneglycoldiamine के 10 मिमी (122) जोड़ें. THF की 40 मिलीलीटर जोड़ें.
  7. 5 मिनट तो एक साथ गठबंधन के लिए हलचल प्लेट पर दोनों शीशियों (C32 और 122) रखें. पन्नी में कवर और 24 घंटे के लिए 400 rpm पर सरगर्मी कमरे के तापमान पर छोड़ दें. अंतिम उत्पाद C32-122 करार दिया है.
  8. C32-122 के प्रत्येक 5 ग्राम बैच के लिए 5 एक्स 50 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूबों वजन. एक नोटबुक में प्रत्येक ट्यूब की बड़े पैमाने पर ध्यान दें.
  9. प्रत्येक 50 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब पर स्थानांतरण निर्जल Diethyl ईथर के 30 मिलीलीटर.
  10. स्थानांतरण प्रत्येक 50 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब C32-122 के 10 एमएल.
  11. भंवर फाल्कन ट्यूबों सख्ती फिर 2 मिनट के लिए 2500 rpm पर अपकेंद्रित्र. नोट: निकाले बहुलक ट्यूब के आधार पर एकत्रित करेगा.
  12. ऊपरी समाधान त्यागें और कदम 1.9 और 1.11 दो बार दोहराएँ.
  13. रात भर desiccator और निर्वात में निकाले C32-122 युक्त खुला ट्यूबों रखें. सुनिश्चित करें सभी ट्यूबों प्रकाश से रक्षा कर रहे हैं.
  14. मास के फाइनल निर्धारित करने के लिए C32-122 युक्त सभी ट्यूबों वजननिकाले बहुलक.
  15. 100 मिलीग्राम / एमएल के एक एकाग्रता में निर्जल DMSO में निकाले बहुलक भंग.
  16. प्रकाश और नमी से संरक्षित -20 डिग्री सेल्सियस पर भंग बहुलक स्टोर.

2. सेल बोने

  1. पूर्व कोट 0.1% (भार / खंड) जिलेटिन के साथ एक टी 150 टिशू कल्चर कुप्पी का आधार. जिलेटिन 30-45 मिनट के लिए फ्लास्क में रहना चाहिए. जिलेटिन कोटिंग ADSCs के आसंजन में मदद करता है.
  2. पूर्व लेपित टी 150 कुप्पी से महाप्राण जिलेटिन.
  3. 10% FBS, 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन और 10 एनजी / एमएल bFGF युक्त DMEM के 20 मिलीलीटर में कुप्पी 4 x 10 6 ADSCs (≤ बीतने 3) जोड़ें.
  4. 37 डिग्री सेल्सियस रातोंरात 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में टी 150 कुप्पी रखें.
  5. अगले दिन अभिकर्मक प्रक्रिया शुरू करो.

3. Nanoparticle तैयारी और अभिकर्मक

  1. निम्नलिखित प्रक्रिया के अनुसार 16.1 माइक्रोग्राम प्लाज्मिड डीएनए युक्त नैनोकणों की तैयारी के लिए है30:1 के अनुपात वजन प्लाज्मिड के लिए एक बहुलक पर 1.0 x 10 6 कोशिकाओं.
  2. प्लाज्मिड डीएनए (1 मिलीग्राम / एमएल, pVEGF165, Aldevron, एन डी, संयुक्त राज्य अमरीका) एक 15 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब में सोडियम एसीटेट (25 मिमी) में 120 माइक्रोग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए पतला.
  3. एक दूसरे 15 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब में सोडियम एसीटेट (25 मिमी) में 3.6 मिलीग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए C32-122 (100 मिलीग्राम / एमएल) पतला.
  4. तुरंत 10 सेकंड के लिए उच्च पर एक 15 मिलीलीटर फाल्कन ट्यूब और भंवर में प्रत्येक फाल्कन ट्यूबों की सामग्री का मिश्रण.
  5. ट्यूब के लिए होते हैं nanoparticle गठन के लिए 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बैठते हैं.
  6. Incubating जबकि, ट्रांसफ़ेक्ट 1.0 x 10 6 कोशिकाओं प्रति 7.8 मिलीलीटर पूरी तरह से पूरक DMEM के साथ टिशू कल्चर फ्लास्क में मध्यम जगह.
  7. टिशू कल्चर कुप्पी nanoparticle समाधान स्थानांतरण और आगे झुकाव और पीछे की ओर समान रूप से फैला है.
  8. 37 डिग्री सेल्सियस, 4 घंटे के लिए 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में टिशू कल्चर कुप्पी रखें.
  9. 2 घंटे के बाद, nanopar की जगहDMEM के साथ मीडिया वाले ticle.
  10. 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर एक और 2 घंटे ऊष्मायन के बाद, कोशिकाओं में विवो इंजेक्शन के लिए तैयार हैं.

4. Hindlimb Ischemia प्रक्रिया

  1. सभी प्रयोगों स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय के पशु की देखभाल और उपयोग समिति के दिशा निर्देशों और अनुमोदित APLAC प्रोटोकॉल के अनुसार में प्रदर्शन किया गया. Hindlimb ischemia के murine मॉडल सृजन रूप में पहले वर्णित किया जाता है. 8 में विस्तृत निर्देश के लिए संदर्भ देखें. एक संक्षिप्त विवरण नीचे प्रदान की जाती है.
  2. साँस लेना और / मिनट 1 एल की ऑक्सीजन का प्रवाह दर से 1-3% खुराक isoflurane के साथ संज्ञाहरण के तहत माउस रखें. पैर के अंगूठे चुटकी, सांस की दर में कमी, और सुस्ती से संवेदनाहारी गहराई सुनिश्चित करें.
  3. शेविंग क्रीम के साथ माउस के पेट क्षेत्र और दोनों hindlimb क्षेत्रों से बालों को हटाने.
  4. Midline ओर औसत दर्जे का जांघ के केंद्र में चीरा और फिर पूर्व overlying वसा पैड के माध्यम से कटऊरु धमनी मुद्रा.
  5. बाहर का स्थल (घुटने के पास) और समीपस्थ साइट (वंक्षण बंधन को सिर्फ बाहर): दो स्थलों पर धमनी ligate.
  6. Ligations बनाने के लिए, नस से धमनी अलग और धमनी के आसपास 5-0 रेशम सीवन धागे. बंधाव बनाने के लिए दो गांठ के साथ धमनी बंद टाई.
  7. दो बंधाव अंक के बीच धमनी निकालें.
  8. पीबीएस के साथ शल्य चिकित्सा के क्षेत्र धो लें और फिर सीवन चीरा बंद हुआ.
  9. संज्ञाहरण अब हटाया जा सकता है. फिर से जगाना जब तक माउस को गर्म रखें. पोस्ट ऑपरेटिव देखभाल के लिए, 2-4 मिग्रा / किग्रा Lidocaine चीरा स्थल पर subcutaneously पुनः जागरण करने से पहले इंजेक्शन जा सकता है. आगे दर्द प्रबंधन 12 और 24 घंटे में 0.05-0.1 मिलीग्राम / किलो buprenorphine के चमड़े के नीचे प्रसव शामिल हो सकते हैं. सांस लेने पैटर्न, प्रकट दर्द या संकट, और त्वचा के रंग में परिवर्तन देख कर सात दिनों के लिए एक बार एक दिन में चूहों के स्वास्थ्य की स्थिति की निगरानी.
  10. लेजर डॉपलर छिड़काव इमेजिंग द्वारा hindlimb ischemia की पुष्टि करें.

5. सेल इंजेक्शन

  1. ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं और चूहों तैयार हैं,, Trypsinize, पीबीएस के साथ अपकेंद्रित्र ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं धो लें और फिर गिनती.
  2. पीबीएस में मिलीलीटर प्रति 10 x 10 6 कोशिकाओं के घनत्व पर कोशिकाओं Resuspend.
  3. सेल निलंबन 110 μl की एक मात्रा में अलग Eppendorf ट्यूबों में विभाजित किया जाना चाहिए. यह प्रत्येक माउस कोशिकाओं के बराबर राशि प्राप्त करता है यह सुनिश्चित करेगा.
  4. (2.5 isoflurane%, 1 एल / मिनट ऑक्सीजन का प्रवाह दर) संज्ञाहरण के तहत प्रत्येक माउस रखें.
  5. शराब पोंछे के साथ इंजेक्शन साइट साफ.
  6. एक 27 जी टुबरकुलीन सिरिंज का उपयोग, एक सजातीय निलंबन हासिल की है सुनिश्चित करने के लिए सिरिंज में ऊपर और नीचे कोशिकाओं आकर्षित. सिरिंज में सेल निलंबन मात्रा के 100 μl ड्रा.
  7. अभिवर्तक मांसपेशियों क्षेत्र में आधा सेल निलंबन इंजेक्षन और फिर पिंडली की मांसपेशी क्षेत्र में अन्य आधा इंजेक्षन. इंजेक्शन लगाने पर, कम से कम 15-30 सेकंड के लिए जगह में सिरिंज छोड़सेल निलंबन के रिसाव को रोकने के.
  8. पशु अध्ययन के लिए उचित नियंत्रण शामिल हैं: एक गैर कोडन प्लाज्मिड (कोई जैविक गतिविधि के साथ जैसे प्लाज्मिड) के साथ ट्रांसफ़ेक्ट 1) कोशिकाओं, अकेले 2) कोशिकाओं, और 3) पीबीएस.
  9. इंजेक्शन पूरा कर रहे हैं, संज्ञाहरण से माउस को हटाने और माउस फिर से जागता है जब तक गर्म रहते हैं.

6. Bioluminescence इमेजिंग

  1. Bioluminescence इमेजिंग (BLI) शुरू करने के लिए, जैसा कि ऊपर वर्णित चूहों anesthetize.
  2. शराब पोंछे के साथ इंजेक्शन साइट साफ.
  3. उपयोग इंसुलिन सिरिंज, 15 मिलीग्राम / एमएल डी luciferin (जुगनू luciferase के लिए सब्सट्रेट) का भार 100 μl. प्रकाश से दूर सब्सट्रेट रखें.
  4. Intraperitoneal इंजेक्शन प्रदर्शन करने के लिए, उनके पूर्वकाल त्वचा तना हुआ खींचने के लिए उनकी पीठ की त्वचा द्वारा चूहों पकड़. Intraperitoneally पेट क्षेत्र में सुई डालने और सब्सट्रेट के 100 μl इंजेक्षन.
  5. संज्ञाहरण के तहत IVIS luciferase इमेजिंग कक्ष में माउस रखें.
  6. छवि का अधिग्रहण किया जाता है, luciferase संकेत को मापने के लिए ब्याज के क्षेत्र निशान. इस मामले में, सेल इंजेक्शन स्थल पर इस्कीमिक अंग निशान.
  7. संकेत एक चरम पर पहुंचता है और गिरावट शुरू होता है जब तक luciferase संकेत हर 3-5 मिनट के लिए उपाय करने के लिए आगे बढ़ें. यह चूहों के पार और कई बार अंक से अधिक की तुलना के लिए उपयोग मूल्य है.
  8. जब पूरा, चैम्बर और संज्ञाहरण से चूहों को हटा दें. फिर से जगाना जब तक गर्म चूहों रखें.

7. लेजर डॉपलर छिड़काव इमेजिंग

  1. लेजर डॉपलर छिड़काव इमेजिंग रूप में पहले वर्णित किया जाता है. 8 प्रक्रिया संक्षेप में यहाँ वर्णित है.
  2. पिछले माउस के कारण बालों के लिए विरूपण साक्ष्य को रोकने के लिए hindlimbs और पेट क्षेत्र दोनों overlying क्षेत्रों में सफाई मुंडा होना चाहिए इमेजिंग डॉपलर के लिए.
  3. डॉपलर छवि के लिए तैयार करते हैं, समझौता ज्ञापनजैसा कि ऊपर वर्णित एसई anesthetized होना चाहिए.
  4. गुदा थर्मामीटर से शरीर के तापमान की निगरानी करते हुए एक हॉट प्लेट पर 36 डिग्री सेल्सियस के लिए माउस गर्म.
  5. एक गैर चिंतनशील काली सतह पर माउस रखें और नाक शंकु द्वारा anesthetized रखना. माउस अपने अंगों को समान रूप से अवगत कराया साथ अपनी पृष्ठीय सतह पर रखा जाना चाहिए.
  6. मोटे तौर पर 15 सेमी माउस ऊपर और माउस की कमर क्षेत्र की ओर संवेदक से लेजर सूचक निर्देशन लेजर डॉपलर सेंसर स्थिति.
  7. माउस और डॉपलर संवेदक की स्थिति में हैं, छवियों प्रारंभ बटन दबाकर LDPIwin सॉफ्टवेयर के उपयोग में लिया जा सकता है.
  8. सापेक्ष छिड़काव माप हितों (आरओआई) के क्षेत्र के रूप में (इस्कीमिक और गैर इस्कीमिक) दोनों hindlimbs संकेत द्वारा लिया जा सकता है. गैर इस्कीमिक hindlimb को इस्कीमिक का मतलब छिड़काव के अनुपात के सापेक्ष छिड़काव का संकेत होगा.

8. ऊतक फसल प्रक्रिया

  1. फसल माउस आज़ादी के लिए तैयार करते हैंऊतक विज्ञान और / या जैव रासायनिक प्रसंस्करण के लिए मुकदमा, माउस euthanized किया जाना चाहिए. इधर, माउस ग्रीवा अव्यवस्था से माउस euthanizing तो, 3-5 मिनट के लिए 5% isoflurane को उजागर द्वारा euthanized है.
  2. Hindlimb को बाहर का पेट क्षेत्र और समीपस्थ पर circumferentially hindlimb आसपास overlying त्वचा में कटौती. त्वचा त्वचा पैर को hindlimb से अधिक वापस खींच लिया जा सकता है, जैसे कि पृष्ठीय सतहों के उदर से कट जाता है.
  3. त्वचा वापस खींच करने पर, अंग श्रोणि और फीमर संयुक्त पर कटौती करने के लिए कुंद विच्छेदन कैंची का उपयोग करके काट किया जा सकता है.
  4. दो मुख्य ऊतकों के विश्लेषण के लिए लिया जाता है: औसत दर्जे का अभिवर्तक मांसपेशियों और gastrocnemius मांसपेशियों.
  5. ऊतक विज्ञान के लिए, cryosectioning के लिए इष्टतम काटने तापमान (अक्टूबर) में से कोई एक या दोनों ऊतकों एम्बेड.
  6. जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए, एक 1.5 मिलीलीटर Eppendorf में एक या दोनों के ऊतकों को इकट्ठा करने और कम से कम 2 मिनट के लिए तरल नाइट्रोजन के एक स्नान में डूब. नमूने हो सकते हैंभविष्य के प्रसंस्करण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत.

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Representative Results

एक साथ मिश्रण पर, नैनोकणों में सकारात्मक आरोप लगाया बहुलक (C32-122) और नकारात्मक आरोप लगाया डीएनए प्लाज्मिड स्वयं assembles. C32-122 और प्लास्मिड डीएनए के बीच complexation वैद्युतकणसंचलन दौरान डीएनए की लामबंदी कर पाएगा यानी nanoparticle गठन वैद्युतकणसंचलन विश्लेषण के माध्यम से इसकी पुष्टि की जा सकती है. बहुलक लक्ष्य कोशिकाओं में डीएनए का बढ़ाया तेज और एन्कोडिंग प्रोटीन के बाद अभिव्यक्ति (चित्रा 2) की सुविधा के लिए एक अभिकर्मक अभिकर्मक के रूप में कार्य करता है. कोशिकाओं प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (चित्रा 3) का उपयोग उच्च दक्षता के साथ polymeric वेक्टर डिजाइन और अभिकर्मक शर्तों के तेजी से अनुकूलन की सुविधा के लिए इस तरह की हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) के रूप में किसी भी चिकित्सकीय जीन या रिपोर्टर डीएनए के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया जा सकता है. ADSCs के लिए, 20% से ऊपर एक दक्षता उपयुक्त समझा जाता है.

सेल भाग्य के बाद transplanta की ट्रैकिंग की सुविधा के लिएtion, कोशिकाओं stably गैर इनवेसिव bioluminescence इमेजिंग (BLI) का उपयोग vivo में सेल व्यवहार्यता और वितरण की वास्तविक समय की निगरानी की अनुमति देता है जो luciferase, साथ transduced किया जा सकता है. BLI इमेजिंग प्रत्यारोपित कोशिकाओं कई दिनों में इंजेक्शन स्थल पर बने रहे, और हम 21 के पाठ्यक्रम पर अन्य ऊतकों या अंगों की ओर ध्यान देने योग्य सेल प्रवास का पालन नहीं करते यह दर्शाता है कि पिछले अंग (चित्रा 4, बाएं पैनल) से उच्च तीव्रता luminescence संकेत से पता चला दिन. सामान्य रूप में सेल संकेत अतिरिक्त समय कम है और सबसे प्रतिरोपित कोशिकाओं को 2 सप्ताह के लिए चिकित्सकीय कारकों overexpressing के लिए उपलब्ध हैं, सुझाव है कि 14 दिनों के लिए (चित्रा 4, सही पैनल) तक चली.

डॉपलर इमेजिंग इस्कीमिक अंग को रक्त reperfusion के वास्तविक समय की निगरानी में सक्षम बनाता है कि एक उपयोगी उपकरण है. चित्रा 5 के बाएं पैनल ischemia के शामिल होने के बाद रक्त प्रवाह के एक प्रतिनिधि छवि है. अंधेरे क्षेत्र उत्तराधिकारी को इंगित करता हैसर्जरी के बाद रक्त के प्रवाह के sful अवरुद्ध. चित्रा 5 का सही पैनल 14 दिनों ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं से इलाज के बाद अंग की पूरी reperfusion दिखाता है.

ऊपर वर्णित तकनीकों वास्तविक समय मात्रा का ठहराव की अनुमति, और अतिरिक्त अंत बिंदु को अच्छी तरह से चिकित्सीय प्रभावकारिता की जांच करने के लिए विश्लेषण के साथ मिलकर किया जाना चाहिए. प्रतिरोपित कोशिकाओं मिली है कि मांसपेशियों के ऊतकों जीन अभिव्यक्ति और ऊतकीय विश्लेषण के लिए अलग अलग समय बिंदुओं पर काटा जा सकता है. RT-पीसीआर ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं में आनुवंशिक विनियमन पुष्टि करने के लिए पिछले अंग में जीन अभिव्यक्ति यों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कई दिनों के बाद प्रत्यारोपण. चित्रा 6 पीबीएस के साथ इंजेक्शन या VEGF ADSCs व्यक्त इंजेक्शन के साथ संयुक्त राष्ट्र के इलाज अंग में VEGF अभिव्यक्ति, से पता चलता है . परिणाम आगे प्रत्यारोपित सेल अस्तित्व का प्रमाण उपलब्ध कराने, गैर वायरल कोशिकाओं चार दिनों के बाद प्रत्यारोपण में VEGF upregulation की पुष्टि करें.

Histological धुंधला ऊतक आकारिकी और ऊतक उत्थान की डिग्री के प्रत्यक्ष दृश्य की अनुमति देता है. रक्त वाहिका घनत्व के लिए ऊतकीय विश्लेषण रक्त reperfusion की प्रभावकारिता (चित्रा 7) का मूल्यांकन करने में मदद करने के लिए डॉपलर इमेजिंग डेटा के साथ मिलकर किया जा सकता है. ऐसे एच ई और मैसन का Trichrome stainings रूप में ऊतक आकारिकी धुंधला ऊतक उत्थान या परिगलन की डिग्री के मूल्यांकन के लिए उपयोगी होते हैं. परिगलित ऊतकों अक्सर पर्याप्त ऊतक फाइब्रोसिस या ऐसे मैक्रोफेज के रूप में सूजन कोशिकाओं की संख्या में वृद्धि को दर्शाती हैं सफलतापूर्वक नव पुनर्जीवित मांसपेशियों के ऊतकों, केन्द्र स्थित नाभिक के साथ मांसपेशियों की कोशिकाओं की विशेषता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. योजनाबद्ध पाली के संश्लेषण (β-अमीनो) एस्टर (PBAE) आधारित वेक्टर C32-122 illustrating. (ए) Acrylated C32 एसी diacrylat साथ एक monomer के बीच एक माइकल अलावा प्रतिक्रिया द्वारा बनाई गई थी समाप्तई अंत समूह (सी) और प्राथमिक amine अंत समूह (32) के साथ एक monomer. (बी) के अंत संशोधित PBAE पॉलिमर बढ़ाया अभिकर्मक दक्षता के लिए amine समाप्त monomers जोड़कर बनाई जा सकती है. (सी) Tetraethyleneglycoldiamine (122) टर्मिनल amine मोनोमर के रूप में चुना गया था. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2
चित्रा 2. Biodegradable polymeric नैनोकणों के गठन के योजनाबद्ध, और उनके बाद सेल प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए प्रक्रिया को ले.

चित्रा 3
चित्रा 3. हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) overexpressing मानव वसा व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं. अभिकर्मक C32-122 और GFP डीएनए प्लाज्मिड का उपयोग का गठन polymeric नैनोकणों उपयोग किया गया था. स्केल बाR: 200 माइक्रोन.

चित्रा 4
चित्रा 4. प्रतिनिधि bioluminescence इमेजिंग (BLI) 0 दिन (पैनल बाएं) और माउस hindlimb में GFP-luciferase सकारात्मक वसा व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं को इंजेक्शन लगाने के बाद 14 दिन (सही पैनल) में माउस अंगों के डेटा.

चित्रा 5
चित्रा 5. 0 दिन (बाएं पैनल) में murine hindlimb के एक तरफ में ischemia के शामिल होने का प्रदर्शन प्रतिनिधि डॉपलर छवियों, और सफल रक्त reperfusion 14 दिनों VEGF-overexpressing वसा व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं (सही पैनल) के इंजेक्शन के बाद.

चित्रा 6
चित्रा 6. सेल अस्तित्व और बगल में इनकोडिंग चिकित्सकीय कारकों की overexpression की पुष्टि, ऊतकों जीन expr के लिए इंजेक्शन साइट से काटा जा सकता हैession विश्लेषण करती है. कोई अभिव्यक्ति पीबीएस नियंत्रण में खोजा गया था जबकि RT-पीसीआर, इलाज समूह 4 दिनों सेल इंजेक्शन के बाद (ADSC-VEGF) में VEGF के सफल ऊपर विनियमन, इनकोडिंग चिकित्सीय प्रोटीन, पुष्टि की.

चित्रा 7
चित्रा 7. . 100 माइक्रोन: स्केल बार शल्य प्रक्रिया के बाद 28 दिनों में विरोधी CD31 धुंधला द्वारा केशिका घनत्व का प्रदर्शन प्रतिनिधि immunohistochemical छवि.

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Discussion

यहाँ हम गैर वायरल, biodegradable नैनोकणों उपयोग चिकित्सकीय कारकों overexpress करने के लिए वयस्क स्टेम सेल प्रोग्राम करने के लिए एक विधि की रिपोर्ट. यह मंच ऐसे ischemia और कैंसर के रूप में, जहां स्टेम सेल कर सकते हैं स्वाभाविक रूप से घर की बीमारियों के इलाज के लिए विशेष रूप से उपयोगी है. इसके अलावा, गैर वायरल जीन वितरण मंच सबसे ऊतक उत्थान और घाव के लिए उपयुक्त है जो चिकित्सीय कारकों की क्षणिक overexpression के लिए अनुमति देता है 9-10 उपचार प्रक्रिया. अभिकर्मक प्रक्रिया कोशिकाओं में कुशल डीएनए प्रवेश पर निर्भर करता है, और सामान्य रूप में गैर विभाजित कोशिकाओं में के रूप में अच्छी तरह से नहीं सक्रिय रूप से विभाजित प्रकार की कोशिकाओं में अच्छी तरह से काम करता है, लेकिन. PBAE पॉलिमर के अभिकर्मक दक्षता सेल का प्रकार सेल प्रकार से भिन्न हो सकते हैं, और व्यक्तिगत रूप से अनुकूलित किया जाना चाहिए, और आगे रासायनिक संरचना संशोधनों विशिष्ट लक्षित सेल आबादी में इष्टतम अभिकर्मक दक्षता हासिल करने के लिए पता लगाया जा सकता है. ऊपर वर्णित विधि के साथ ट्रांसफ़ेक्ट 11-12 प्रकोष्ठों आम तौर पर मैं परिणामसुबह 2-4 के आसपास हासिल शिखर जीन अभिव्यक्ति के साथ दो सप्ताह के लिए क्षणिक जीन अभिव्यक्ति और प्रोटीन स्राव, एन. पशु प्रयोगों के लिए, 20% से ऊपर अभिकर्मक दक्षता के साथ ADSCs उपयुक्त माना जाता है. यह FACS विश्लेषण एक प्रक्रिया पैरामीटर क्रम स्थिरता (पॉलिमर, plasmids या कोशिकाओं के जैसे नए बैच) को बनाए रखने में परिवर्तित हो जाता है हर बार प्रदर्शन करने के लिए सिफारिश की है.

गैर degradable हैं जो इस तरह के पी और 2000 Lipofectamine के रूप में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अभिकर्मक अभिकर्मकों, की तुलना में, ऊपर की सूचना दी मंच में इस्तेमाल PBAE पॉलिमर biodegradable और नैदानिक ​​अनुवाद के लिए अधिक उपयुक्त हैं. ऐसे polymeric वैक्टर hydrolytically 13 degradable और प्रकाश के प्रति संवेदनशील हैं, यह देखते हुए सावधानी ठीक से PBAE पॉलिमर स्टोर करने के लिए (-20 डिग्री सेल्सियस, अंधेरे में, Desiccant साथ) अवांछित hydrolysis और गिरावट को रोकने के लिए लिया जाना चाहिए. जिसके परिणामस्वरूप पॉलिमर आणविक वजन की एक वितरण किया है, और आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी (एसईसी) एमप्र आगे यह भी बहुलक संश्लेषण प्रोटोकॉल में हर कदम पर परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) प्रदर्शन करने के लिए सिफारिश की है वृद्धि हुई अभिकर्मक दक्षता. 14 के साथ PBAEs को शुद्ध करने के लिए प्रदर्शन किया. एनएमआर अपनी व्यक्तिगत घटकों से C32 के गठन की पुष्टि करने और फिर समूहों के 122 यानी कैपिंग अंत की सफल अलावा पुष्टि करने के लिए किया जाना चाहिए. नोट: अंत कैपिंग समूहों के अलावा के बाद, acrylate समूहों एनएमआर स्पेक्ट्रम से गायब हो जाना चाहिए. अंतिम बहुलक में अतिरिक्त amine समाप्त monomers की उपस्थिति इसलिए यह पर्याप्त रूप से अतिरिक्त monomers के हटाने सुनिश्चित करने के लिए Diethyl ईथर में अंतिम बहुलक धोने के लिए महत्वपूर्ण है, बढ़ सेल विषाक्तता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. जैसा कि ऊपर कहा, एसईसी भी पवित्रता अंतिम उत्पाद को आगे किया जा सकता है.

कई वायरल आधारित जीन वितरण प्लेटफार्मों के विपरीत, यहां इस्तेमाल बहुलक आधारित जीन वितरण प्रणाली जिससे insertional मीटर के लिए संभावित जोखिम से बचने, मेजबान जीनोम में एकीकृत नहीं हैutagenesis और प्रतिरक्षाजनकता. 15-16

वर्णित प्रक्रिया में, कोशिकाओं एन्कोडिंग प्रोटीन और संयुक्त राष्ट्र ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं overexpressing कोशिकाओं का मिश्रण होता है जो अभिकर्मक प्रक्रिया के बाद सीधे छँटाई के बिना प्रतिरोपित कर रहे हैं. यह प्रक्रिया कोशिकाओं का कम से कम पूर्व vivo हेरफेर की अनुमति देता है, और अधिक चिकित्सकीय अनुवाद करने के लिए कम समय, लागत और प्रदूषण के मौके दिए जाने की संभावना है. कोशिकाओं को भी केवल आगे बगल में चिकित्सकीय कारकों की overexpression के स्तर को बढ़ाने के लिए कोशिकाओं का चयन करने के लिए आगे शुद्ध किया जा सकता है.

angiogenesis के लिए प्रोग्राम स्टेम कोशिकाओं की प्रभावकारिता को अच्छी तरह से, सेलुलर रूपात्मक और शारीरिक सहित कई स्तरों पर परिणामों गधे को assays के संयोजन का उपयोग कर जांच की जानी चाहिए. Bioluminescence इमेजिंग समय के साथ अस्तित्व और प्रतिरोपित कोशिकाओं के वितरण की वास्तविक समय की निगरानी में सक्षम बनाता है. जीन अभिव्यक्ति हार्व से विश्लेषण करती हैदिलचस्पी ऊतकों सेल अस्तित्व का सत्यापन और बगल में इनकोडिंग कारकों की आनुवंशिक विनियमन अनुमति देते हैं. ऊतकीय धुंधला रक्त वाहिका घनत्व, सूजन और ऊतक उत्थान के प्रत्यक्ष दृश्य सक्षम बनाता है. यह नवगठित जहाजों अपरिपक्व और गैर कार्यात्मक हो सकता है के रूप में वृद्धि हुई रक्त वाहिका घनत्व हमेशा सफल रक्त reperfusion के लिए नेतृत्व नहीं करता है कि ध्यान दिया जाना चाहिए. इसलिए यह लेजर डॉपलर छिड़काव इमेजिंग का उपयोग कर नव सृजित वाहिकाओं के शारीरिक समारोह का आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण है. एक hindlimb ischemia के मॉडल में angiogenesis को बढ़ावा देने के लिए वसा व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं का उपयोग पर ध्यान केंद्रित उपर्युक्त विधियों, दवा वितरण वाहनों के रूप में प्रोग्रामिंग कोशिकाओं की अवधारणा को मोटे तौर पर लागू है. मंच आसानी से इस तरह के कैंसर और musculoskeletal रोगों के रूप में अन्य रोगों के इलाज के लिए प्रासंगिक हैं कि चिकित्सीय कारकों overexpressing के लिए अन्य प्रकार की कोशिकाओं के कार्यक्रम के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgments

लेखकों के वित्त पोषण के लिए अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन के राष्ट्रीय वैज्ञानिक विकास अनुदान (10SDG2600001), स्टैनफोर्ड जैव एक्स अंतःविषय पहल कार्यक्रम, और स्टैनफोर्ड मेडिकल स्कॉलर्स रिसर्च प्रोग्राम को स्वीकार करना होगा.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Invitrogen 11965
Fetal Bovine Serum Invitrogen 10082
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15070
Basic Fibroblast Growth Factor Peprotech 100-18B
1,4-Butanediol Diacrylate (90 %) Sigma Aldrich 411744 Acronym: C
5-amino-1-pentanol (97 %) Alfa Aesar 2508-29-4 Acronym: 32
Tetraethyleneglycoldiamine >99 %) Molecular Biosciences 17774 Acronym: 122
Sodium Acetate G-Biosciences R010
Phosphate Buffered Saline Invitrogen 14190-144
Tetrahyofuran Anhydrous (>99.9 %) Sigma Aldrich 401757
Diethyl Ether Anhydrous (>99 %) Fisher Scientific E138-4
DMSO Anhydrous (>99.9 %) Sigma Aldrich 276855
Gelatin Sigma Aldrich G9391
Trypsin-EDTA Invitrogen 25200
D-luciferin GoldBio
Optimal Cutting Temperature (O.C.T) Tissue-Tek 4583
Rat anti-Mouse CD31 BD Pharmingen 550274
Alexa Fluor 594 anti-rat IgG Invitrogen A11007

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References

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रिक्त मान अंक 79 सेल पशु मॉडल जैव अभियांत्रिकी (सामान्य) स्टेम angiogenesis biodegradable गैर वायरल जीन थेरेपी
Biodegradable polymeric नैनोकणों प्रयोग चिकित्सीय angiogenesis के लिए प्रोग्रामिंग स्टेम सेल
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Keeney, M., Deveza, L., Yang, F.… More

Keeney, M., Deveza, L., Yang, F. Programming Stem Cells for Therapeutic Angiogenesis Using Biodegradable Polymeric Nanoparticles. J. Vis. Exp. (79), e50736, doi:10.3791/50736 (2013).

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