Cellule staminali per la programmazione terapeutica angiogenesi Uso biodegradabili polimerico Nanoparticelle

Summary

Descriviamo il metodo di cellule staminali programmazione di iperespressione fattori terapeutici per angiogenesi utilizzando nanoparticelle polimeriche biodegradabili. Processi descritti includono sintesi dei polimeri, trasfezione delle cellule staminali derivate da tessuto adiposo in vitro, e convalida l'efficacia delle cellule staminali programmato per promuovere l'angiogenesi in un modello di ischemia degli arti posteriori murino.

Abstract

Crescita vascolare controllata è fondamentale per la rigenerazione tissutale successo e la guarigione delle ferite, così come per il trattamento di malattie ischemiche come ictus, infarto o arteriopatie periferiche. Consegna diretta di fattori di crescita angiogenici ha il potenziale per stimolare la crescita di nuovi vasi sanguigni, ma è spesso associata a limitazioni come la mancanza di un orientamento e di breve emivita in vivo. La terapia genica offre un approccio alternativo, fornendo geni codificanti fattori angiogenici, ma spesso richiede l'utilizzo virus, ed è limitata da problemi di sicurezza. Qui si descrive una strategia recentemente sviluppato per stimolare la crescita vascolare dalle cellule staminali di programmazione per iperespressione di fattori angiogenici in situ utilizzando nanoparticelle polimeriche biodegradabili. In particolare la nostra strategia utilizzato cellule staminali come vettori sfruttando la loro capacità di migrare verso i tessuti ischemici in vivo. Utilizzando i vettori polimerici ottimizzate, derivate da tessuto adiposoLe cellule staminali sono state modificate per iperespressione di un gene che codifica angiogenico fattore di crescita vascolare endoteliale (VEGF). Abbiamo descritto i processi per la sintesi del polimero, la formazione di nanoparticelle, trasfezione delle cellule staminali in vitro, come pure metodi per convalidare l'efficacia delle cellule staminali-VEGF esprimendo per promuovere l'angiogenesi in un modello di ischemia degli arti posteriori murino.

Introduction

L'obiettivo generale di questa tecnica è quello di promuovere l'angiogenesi terapeutica con cellule staminali non-virale programmati sovraespressione fattori terapeutici presso il sito di ischemia. Le cellule staminali sono state modificate ex vivo prima con nanoparticelle biodegradabili sintetizzate in laboratorio e poi trapiantate in un modello murino di ischemia degli arti posteriori per convalidare il loro potenziale per migliorare l'angiogenesi e recupero del tessuto.

Crescita vascolare controllato è un componente importante di rigenerazione tissutale successo, così come per il trattamento di varie malattie ischemiche come ictus, ischemia e infarto del miocardio. Diverse strategie sono state sviluppate per promuovere la crescita vascolare, inclusa la consegna fattore di crescita e terapia cellulare. ¹ Nonostante l'efficacia osservata nei modelli animali di malattia, questi metodi ancora affrontare limitazioni, quali la necessità di dosi sovrafisiologici per la consegna fattore di crescita, o insufficiente paracrinorilasciare dalle cellule soli. Una strategia potenziale per superare le limitazioni di cui sopra è di combinare terapia con cellule staminali e terapia genica, per cui le cellule staminali sono geneticamente programmati ex vivo prima del trapianto di iperespressione fattori terapeutici desiderabili. Questo approccio è stata dimostrata in vari modelli di malattie, tra cui l'ischemia degli arti posteriori ^2, malattie cardiache ^3, guarigione ossea ⁴ e ⁵ danno neuronale, ecc. Tuttavia, la maggior parte delle tecniche di terapia genica si basano su vettori virali, che sono associati con problemi di sicurezza quali il potenziale immunogenicità e mutagenesi inserzionale. Biomateriali mediate trasferimento genico non virale possono superare questi limiti, ma spesso soffrono di bassa efficienza di trasfezione. Per accelerare la scoperta di nuovi biomateriali per un efficiente trasferimento genico non virale, studi recenti hanno impiegato chimica combinatoria e ad alta produttività approccio di screening. Biblioteche polimero biodegradabile come il poli (es β-amminotri) (PBAE) sono stati sviluppati e schermato, che ha portato alla scoperta di polimeri leader con marcatamente maggiore efficienza di trasfezione rispetto alle tradizionali controparti vettori polimerici. ^6-7

Qui, si descrive la sintesi di PBAE e verifica della loro capacità di trasfezione le cellule staminali derivate da tessuto adiposo (ADSCs) in vitro, seguita da successiva trapianto di ADSCs geneticamente modificati iperesprimenti fattore di crescita vascolare endoteliale (VEGF) in un modello murino di ischemia hindlimb . I risultati sono stati valutati tenendo traccia destino cellulare utilizzando l'imaging bioluminescenza, valutando riperfusione mediante perfusione tissutale laser Doppler Imaging (LDPI), e determinando l'angiogenesi e tessuti di salvataggio da istologia.

Protocol

1. Polymer Synthesis

1. In una cappa aspirante, pesare 3.523 mg di butandiolo diacrylate (C) e trasferire in una fiala di scintillazione in vetro contenente una ancoretta.
2. Preriscaldamento 5-ammino-1-pentanolo (32) a 90 ° C per solubilizzare il sale, poi in una cappa aspirante, pesare 1,533 mg 32 e aggiungere alla fiala di scintillazione contenente C. Questo metodo si tradurrà in un rapporto molare C: 32 = 1:1,2.
3. Porre immediatamente il flaconcino contenente entrambe le soluzioni su un piatto mescolare. Impostare la velocità scalpore a 600 rpm.
4. Trasferire la fiala di scintillazione di un forno a 90 ° C. Impostare la velocità di agitazione a 1.000 rpm per 4 ore. Se l'ancoretta si blocca, ridurre la velocità. Dopo 4 ore, velocità inferiore a 300 rpm e mantenere a 90 ° C per un altro 12-16 ore.
5. Aggiungere 5 g di C32 a 10 ml di tetraidrofurano anidro (THF) in una fiala di scintillazione in vetro contenente una ancoretta. Avvolgere nella pellicola e vortice in alto fino a completo scioglimento.
6. In un scintillazione fiala di vetro Conta separatoining un bar mescolare, aggiungere 10 mm di Tetraethyleneglycoldiamine (122). Aggiungere 40 ml di THF.
7. Posizionare entrambi i flaconi (C32 e 122) su un piatto mescolare per 5 minuti poi si combinano insieme. Copertina in pellicola e lasciare a temperatura ambiente agitazione a 400 rpm per 24 ore. Il prodotto finale è definito C32-122.
8. Pesare 5 x 50 ml provette Falcon per ogni 5 g lotto di C32-122. Nota la massa di ciascun tubo in un notebook.
9. Trasferimento 30 ml di etere etilico anidro per ogni 50 ml tubo Falcon.
10. Trasferimento 10 ml di C32-122 per ogni 50 ml provetta Falcon.
11. Tubi Vortex Falcon energicamente poi centrifugare a 2.500 rpm per 2 min. Nota: Il polimero estratto raccoglierà alla base del tubo.
12. Scartare la soluzione superiore e ripetere i passi 1.9 e 1.11 altre due volte.
13. Posizionare i tubi aperti contenenti l'estratto C32-122 in un essiccatore vuoto e durante la notte. Assicurarsi che tutti i tubi sono protetti dalla luce.
14. Pesare tutte le provette contenenti C32-122 per determinare la massa finale delpolimero estratto.
15. Sciogliere il polimero estratto in DMSO anidro ad una concentrazione di 100 mg / ml.
16. Conservare il polimero sciolto a -20 ° C al riparo dalla luce e dall'umidità.

2. Semina cellulare

1. Pre-coat base di un pallone di coltura tissutale T-150 con 0,1% (peso / volume) gelatina. La gelatina deve rimanere nel pallone per 30-45 min. Il rivestimento gelatina aiuta adesione di ADSCs.
2. Aspirare gelatina dal pallone T-150 pre-rivestite.
3. Aggiungere 4 x 10 ⁶ ADSCs (≤ passaggio 3) al pallone in 20 ml di DMEM contenente 10% FBS, 1% di penicillina / streptomicina e 10 ng / ml bFGF.
4. Porre il pallone T-150 in incubatore a 37 ° C, 5% CO ₂ durante la notte.
5. Iniziare procedura di trasfezione il giorno seguente.

3. Nanoparticelle Preparazione e Transfezione

1. La seguente procedura è per la preparazione di nanoparticelle contenenti 16,1 mg di DNA plasmidico per1,0 x 10 ⁶ cellule in un polimero di plasmide rapporto in peso di 30:1.
2. Diluire DNA plasmidico (1 mg / ml, pVEGF165, Aldevron, ND, USA) ad una concentrazione finale di 120 mg / ml in acetato di sodio (25 mM) in un tubo Falcon da 15 ml.
3. Diluire C32-122 (100 mg / ml) ad una concentrazione finale di 3,6 mg / ml in acetato di sodio (25 mM) in un secondo tubo 15 ml Falcon.
4. Unire il contenuto di ogni provette Falcon in un unico tubo da 15 ml falco e vortex immediatamente in alto per 10 sec.
5. Lasciare la provetta riposare a temperatura ambiente per 10 min per la formazione di nanoparticelle a verificarsi.
6. Durante l'incubazione, sostituire il mezzo nel tessuto pallone di coltura con DMEM 7.8 ml completamente integrato per 1,0 x 10 ⁶ cellule trasfettate.
7. Trasferire la soluzione di nanoparticelle al pallone di coltura di tessuti e ribaltare in avanti e indietro per distribuire uniformemente.
8. Porre il pallone di coltura tissutale in incubatore a 37 ° C, 5% CO ₂ per 4 ore.
9. Dopo 2 ore, sostituire il nanoparticolo contenente multimediale con DMEM.
10. A seguito di una ulteriore incubazione 2 ore a 37 ° C, 5% CO _2, le cellule sono pronte per l'iniezione in vivo.

4. Ischemia degli arti posteriori Procedura

1. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con la cura degli animali e del Comitato Usa Linee guida della Stanford University e protocolli APLAC approvati. Generare il modello murino di ischemia degli arti posteriori viene eseguita come descritto in precedenza. ⁸ prega di fare riferimento al riferimento per le istruzioni dettagliate. Una breve descrizione è fornita di seguito.
2. Posizionare il mouse in anestesia con il 1-3% isoflurano dosaggio per inalazione e velocità di flusso di ossigeno di 1 L / min. Garantire la profondità dell'anestesia dal pizzico punta, la riduzione della frequenza respiratoria, e letargia.
3. Rimuovere i capelli dalla regione addominale e due aree arti posteriori del mouse con crema da barba.
4. Fai incisione al centro mediale della coscia verso la linea mediana e poi tagliare il cuscinetto adiposo sovrastante a exporre l'arteria femorale.
5. Legare l'arteria a due siti: sito distale (vicino al ginocchio) e il sito prossimale (appena distalmente al legamento inguinale).
6. Per creare le legature, separare l'arteria dalla vena e infilare una sutura di seta 5-0 intorno all'arteria. Legare l'arteria con due nodi per fare la legatura.
7. Rimuovere l'arteria tra i due punti di legatura.
8. Lavare l'area chirurgica con PBS e poi suturare l'incisione chiuso.
9. L'anestesia può ora essere rimosso. Tenere il caldo mouse fino al risveglio. Per le cure post-operatorie, 2-4 mg / kg di lidocaina può essere iniettato per via sottocutanea al sito di incisione prima del risveglio. Ulteriore gestione del dolore può includere la consegna sottocutanea di 0,05-0,1 mg / kg Buprenorfina a 12 e 24 ore. Monitorare lo stato di salute dei topi una volta al giorno per sette giorni osservando i cambiamenti nel pattern respiratorio, dolore palese o angoscia, e il colore della pelle.
10. Confermare hindlimb ischemia laser Doppler imaging di perfusione.

5. Iniezioni di cellule

1. Quando le cellule trasfettate e topi sono pronti, lavare le cellule trasfettate con PBS, trypsinize, centrifuga, e poi contare.
2. Risospendere le cellule ad una densità di 10 x 10 ⁶ cellule per ml in PBS.
3. Sospensioni cellulari devono essere separate in provette Eppendorf separate in un volume di 110 microlitri. Questo farà sì che ciascun topo riceve una quantità uguale di cellule.
4. Collocare ogni topo sotto anestesia (2,5% isoflurano, portata 1 L / min di ossigeno).
5. Pulire il sito di iniezione con il cotone imbevuto di alcol.
6. Utilizzando una siringa da tubercolina 27 G, trarre le cellule su e giù nella siringa per garantire una sospensione omogenea è raggiunto. Elaborare 100 ml di volume di sospensione cellulare nella siringa.
7. Iniettare metà della sospensione cellulare nella regione muscolo adduttore e poi iniettare l'altra metà nella regione polpaccio. Dopo l'iniezione, lasciare la siringa in posizione per almeno 15-30 secondi perprevenire perdite di sospensione cellulare.
8. Controlli adeguati per lo studio animale includono: 1) cellule transfettate con un plasmide non codificante (es. plasmide senza attività biologica), 2) le sole cellule, e 3) PBS.
9. Quando i conferimenti sono complete, togliere il mouse da anestesia e tenere in caldo fino a quando il mouse si ri-Awakes.

6. Bioluminescenza

1. Per iniziare bioluminescenza (BLI), anestetizzare i topi come descritto sopra.
2. Pulire il sito di iniezione con il cotone imbevuto di alcol.
3. Utilizzando siringa da insulina, carico di 100 ml di 15 mg / ml D-luciferina (il substrato per la luciferasi di lucciola). Tenere substrato al riparo dalla luce.
4. Per eseguire iniezioni intraperitoneali, tenere i topi dalla pelle della schiena per tirare la pelle tesa anteriore. Inserire l'ago per via intraperitoneale nella regione addominale e iniettare 100 ml di substrato.
5. Posizionare il mouse nella camera di imaging luciferasi IVIS sotto anestesia.
6. Quando l'immagine viene acquisita, segnare la regione di interesse per misurare il segnale luciferasi. In questo caso, contrassegnare ischemico nel sito di cella-iniezione.
7. Continuare a misurare il segnale luciferasi ogni 3-5 minuti fino a quando il segnale raggiunge un picco e comincia a diminuire. Questo è il valore utilizzato per il confronto tra i topi e su diversi punti di tempo.
8. Al termine, togliere i topi dalla camera e l'anestesia. Mantenere topi caldo fino risveglio.

7. Laser Doppler Perfusion Imaging

1. Laser Doppler perfusione viene eseguita come descritto in precedenza. ⁸ La procedura viene brevemente descritto qui.
2. Prima Doppler il mouse deve essere pulito rasato presso le aree sovrastanti entrambe le zampe posteriori e la regione addominale per evitare artefatti dovuti ai capelli.
3. Quando pronti a immagine Doppler, il mouse va anestetizzato come descritto sopra.
4. Riscaldare il mouse a 36 ° C su una piastra calda mentre controllo della temperatura corporea da termometro rettale.
5. Posizionare il mouse su una superficie nera non riflettente e mantenere anestetizzato dal cono di naso. Il mouse deve essere collocato sulla sua superficie dorsale con gli arti esposti in modo uniforme.
6. Posizionare il sensore laser Doppler circa 15 cm sopra il mouse e dirigere il puntatore laser dal sensore verso la regione inguinale del mouse.
7. Quando il mouse e il sensore Doppler sono in posizione, le immagini possono essere scattate utilizzando il software LDPIwin premendo il pulsante Start.
8. Misure di perfusione relativi potrebbero essere prese indicando due zampe posteriori (ischemica e non-ischemica), come la regione di interesse (ROI). Il rapporto di perfusione medio del ischemico alla hindlimb non ischemica indicherà perfusione relativo.

8. Tissue Harvest Procedura

1. Quando pronti a topolino delle risaie tiscitare in giudizio per istologia e / o trasformazione biochimica, il mouse deve essere eutanasia. Qui, il mouse è eutanasia esponendo al 5% isoflurano per 3-5 minuti, poi eutanasia il mouse per dislocazione cervicale.
2. Tagliare la pelle sovrastante circonda l'arti posteriori circonferenzialmente in corrispondenza della zona addominale distale e prossimale al hindlimb. La pelle è tagliata dalla ventrale alle superfici dorsali, tale che la pelle può essere tirato indietro sul arti posteriori al piede.
3. Tirando indietro la pelle, l'arto potrebbe essere amputato utilizzando forbici smussa per tagliare alla giuntura del bacino e del femore.
4. Due principali tessuti sono presi per le analisi: i muscoli adduttori mediale e dei muscoli gastrocnemio.
5. Per istologia, incorporare uno o entrambi i tessuti in temperatura di taglio ottimale (OCT) per criosezionamento.
6. Per l'analisi biochimica, raccogliere uno o entrambi i tessuti in un Eppendorf da 1,5 ml e immergere in un bagno di azoto liquido per almeno 2 min. I campioni possono essereconservato a -80 ° C per una successiva elaborazione.

Representative Results

Su mescolando, il polimero carico positivamente (C32-122) e caricati negativamente plasmide DNA auto-assembla in nanoparticelle. Formazione di nanoparticelle può essere confermata mediante analisi elettroforetica ossia la complessazione tra C32-122 e DNA plasmidico impedirà mobilitazione del DNA durante l'elettroforesi. Il polimero serve come reagente di trasfezione per facilitare un migliore assorbimento del DNA nelle cellule bersaglio e la successiva espressione di proteine ​​che codificano (Figura 2). Le celle possono essere trasfettate con eventuali geni terapeutici o giornalista DNA come la proteina fluorescente verde (GFP) per facilitare il rapido ottimizzazione della progettazione e trasfezione vettore condizioni polimerici ad elevata efficienza mediante cella fluorescenza-attivato (FACS) e microscopia a fluorescenza (Figura 3). Per ADSCs, un rendimento superiore al 20% è ritenuta idonea.

Per facilitare il monitoraggio del destino delle cellule post-trapiantozione, le cellule possono essere stabilmente trasdotte con luciferasi, che consente il monitoraggio in tempo reale di vitalità e di distribuzione di celle in vivo utilizzando non invasiva bioluminescenza (BLI). Immagini BLI ha mostrato segnali di luminescenza ad alta intensità dalla dell'arto posteriore (Figura 4, pannello di sinistra), indicando che le cellule impiantate sono rimaste al sito di iniezione per diversi giorni, e noi non osservano la migrazione delle cellule evidente nei confronti di altri tessuti o organi nel corso di 21 giorni. Segnale cellulare in generale è diminuita straordinario ed è durata fino a 14 giorni (Figura 4, pannello di destra), suggerendo che le cellule trapiantate sono più disponibili per la sovraespressione fattori terapeutici per un massimo di due settimane.

Doppler è un utile strumento che consente il monitoraggio in tempo reale di riperfusione sangue all'arto ischemico. Il pannello di sinistra della figura 5 è una immagine rappresentativa del flusso sanguigno dopo induzione di ischemia. L'area scura indica successful blocco del flusso di sangue dopo l'intervento chirurgico. Il pannello di destra di figura 5 illustra completa riperfusione dell'arto 14 giorni dopo il trattamento con cellule trasfettate.

Le tecniche sopra descritte consentono in tempo reale quantificazione, e dovrebbero essere accompagnate da ulteriori end-point analisi per esaminare attentamente l'efficacia terapeutica. Tessuti muscolari che hanno ricevuto cellule trapiantate possono essere raccolte in diversi momenti di espressione genica e analisi istologiche. RT-PCR può essere usata per quantificare l'espressione genica in dell'arto posteriore per confermare genetica up-regulation in cellule trasfettate diversi giorni post-trapianto. Figura 6 mostra l'espressione di VEGF in dell'arto non trattato, iniettati con PBS o iniettati con VEGF esprimere ADSCs . I risultati confermano VEGF upregulation in cellule trasfettate non virali quattro giorni post-trapianto, fornendo ulteriori prove di sopravvivenza delle cellule trapiantate.

Histolocolorazione gico permette la visualizzazione diretta della morfologia del tessuto e del grado di rigenerazione dei tessuti. L'analisi istologica per la densità dei vasi sanguigni può essere accoppiato con i dati di imaging Doppler per aiutare a valutare l'efficacia della riperfusione sangue (Figura 7). Tissue morfologia colorazione come H & E e colorazioni tricromica di Masson sono utili per valutare il grado di rigenerazione tissutale o necrosi. Tessuto muscolare con successo di recente rigenerata è caratterizzata da cellule muscolari con nuclei in posizione centrale, mentre i tessuti necrotici spesso mostrano fibrosi tissutale sostanziale o aumento del numero di cellule infiammatorie quali macrofagi.

Figura 1. Schematica che illustra la sintesi di poli (β-ammino) estere (PBAE) basato su vettori C32-122. (A) acrilati terminato C32-Ac è formato da una reazione di addizione di Michael tra un monomero con diacrylatgruppi e terminali (C) e un monomero con gruppo terminale amminico primario (32). (B) End-polimeri modificati PBAE possono essere formati con l'aggiunta di ammine monomeri terminati per una maggiore efficienza di trasfezione. (C) Tetraethyleneglycoldiamine (122) è stato scelto come l'ammina monomero terminale. Clicca qui per ingrandire la figura .

Figura 2. Schema di formazione di nanoparticelle polimeriche biodegradabili, e la loro successiva cella up-take processo per l'espressione della proteina.

Figura 3. Cellule staminali derivate da tessuto adiposo umano iperesprimenti proteina fluorescente verde (GFP). Trasfezione sono stati condotti utilizzando nanoparticelle polimeriche formate usando C32-122 e DNA plasmidico GFP. Ba Scalar: 200 micron.

Figura 4. Rappresentante di imaging bioluminescenza (BLI) i dati degli arti topo al giorno 0 (pannello di sinistra) e il giorno 14 (pannello di destra) dopo l'iniezione positive le cellule staminali derivate da tessuto adiposo GFP-luciferasi in arti posteriori mouse.

Figura 5. Immagini Doppler Rappresentante dimostrano l'induzione di ischemia in un lato della arti posteriori murino al giorno 0 (pannello di sinistra), e il successo riperfusione sangue 14 giorni dopo l'iniezione di cellule staminali-VEGF sovraespressione derivate da tessuto adiposo (pannello di destra).

Figura 6. Per confermare la sopravvivenza delle cellule e la sovraespressione di fattori terapeutici codificati in situ, i tessuti possono essere raccolte dal sito di iniezione per il gene espranalizza essione. RT-PCR ha confermato successo up-regulation di VEGF, la proteina terapeutica codificata, nel gruppo trattato (ADSC-VEGF) 4 giorni dopo l'iniezione di cellule, mentre nessuna espressione è stata rilevata nel controllo PBS.

Figura 7. Rappresentante immagine immunoistochimica dimostrare densità capillare mediante colorazione anti-CD31 a 28 giorni dopo l'intervento chirurgico bar Scala:. 100 micron.

Discussion

Qui riportiamo un metodo per programmare le cellule staminali adulte per iperespressione di fattori terapeutici utilizzando non-virali, nanoparticelle biodegradabili. Questa piattaforma è particolarmente utile per il trattamento di malattie in cui le cellule staminali possono naturalmente casa, come ischemia e cancro. ^9-10 Inoltre, la piattaforma di trasferimento genico non virale permette sovraespressione transiente di fattori terapeutici, che è più adatto per la rigenerazione dei tessuti e ferita processi di guarigione. Il processo di trasfezione dipende entrata DNA efficiente nelle cellule, e in generale funziona bene in modo attivo si dividono tipi cellulari, ma non così in cellule che non si dividono. L'efficienza di trasfezione di polimeri PBAE può variare da tipo cellulare a tipo cellulare, e dovrebbe essere ottimizzato singolarmente, e ulteriori modifiche alla struttura chimica può essere esplorato per ottenere la massima efficienza di transfezione in specifiche popolazioni cellulari mirate. ^11-12 cellule trasfettate con il metodo sopra descritto i risultati di solito in espressione transiente del gene e la secrezione di proteine ​​per due settimane, con l'espressione genica picco ottenuto intorno al giorno 2-4. Per gli esperimenti sugli animali, ADSCs con efficienza di trasfezione superiore al 20% sono considerati idonei. Si raccomanda di eseguire l'analisi FACS ogni volta un parametro di processo viene modificato per mantenere la coerenza (ad esempio nuovo lotto di polimeri, plasmidi o cellule).

Rispetto ai reagenti di transfezione disponibili in commercio quali PEI e Lipofectamine 2000 che sono non degradabile, i polimeri PBAE utilizzati nella piattaforma sopra riportato sono biodegradabili e più adatto per la traduzione clinica. Dato che tali vettori polimerici sono idroliticamente degradabili ¹³ e sensibile alla luce, la cautela dovrebbe essere presa per immagazzinare polimeri PBAE correttamente (-20 ° C, al buio, con essiccante) per evitare l'idrolisi indesiderati e degrado. I polimeri risultanti hanno una distribuzione di peso molecolare, e la cromatografia di esclusione dimensionale (SEC) may essere eseguita per purificare ulteriormente PBAEs con una maggiore efficienza di trasfezione. ¹⁴ Si raccomanda inoltre di eseguire la risonanza magnetica nucleare (NMR) ad ogni fase del protocollo di sintesi dei polimeri. L'NMR dovrebbe essere eseguito per confermare la formazione di C32 da singoli componenti e per confermare aggiunta di successo di fine tappatura gruppi cioè 122. Nota: dopo l'aggiunta di gruppi terminali capping, i gruppi acrilato dovrebbero scomparire dallo spettro NMR. La presenza di un eccesso di ammina monomeri terminati nel polimero finale può aumentare la tossicità cellulare, quindi è importante lavare adeguatamente polimero finale in etere dietilico per garantire la rimozione dei monomeri in eccesso. Come accennato in precedenza, SEC può essere utilizzato anche per promuovere la purezza del prodotto finale.

A differenza di molte piattaforme di distribuzione gene virale-based, il sistema di consegna del gene a base di polimero usato qui non si integra nel genoma dell'ospite, evitando così il rischio potenziale per inserzionale mutagenesis e immunogenicità. ^15-16

Nella procedura descritta, le cellule vengono trapiantate senza ordinare direttamente dopo il processo di trasfezione, che contiene una miscela di cellule che overesprimono proteine ​​che codificano e cellule non-trasfettate. Questa procedura permette minima manipolazione ex vivo delle cellule, ed è probabile che sia più clinicamente traducibile dato ridotti tempi, costi e possibilità di contaminazione. Le cellule possono anche essere ulteriormente purificato per selezionare cellule trasfettate solo per aumentare ulteriormente il livello di sovraespressione di fattori terapeutici in situ.

L'efficacia delle cellule staminali programmate per angiogenesi dovrebbe essere esaminato utilizzando una combinazione di test per valutare attentamente i risultati a più livelli comprendenti servizi cellulari, morfologica e fisiologica. Imaging bioluminescenza consente il monitoraggio in tempo reale della sopravvivenza e distribuzione delle cellule trapiantate nel tempo. Analisi dell'espressione genica da Harvtessuti interessate consentono la verifica della sopravvivenza cellulare e genetica up-regulation dei fattori codificati in situ. Colorazione istologica consente la visualizzazione diretta della densità dei vasi sanguigni, infiammazione e rigenerazione tissutale. Va notato che una maggiore densità vaso sanguigno non comporta sempre un successo riperfusione sangue, come i vasi neoformati possono essere immaturo e non funzionali. Pertanto, è importante valutare la funzione fisiologica delle navi appena generato utilizzando laser Doppler imaging di perfusione. Mentre i metodi sopra concentrano sull'utilizzo di cellule staminali derivate da tessuto adiposo per promuovere l'angiogenesi in un modello di ischemia degli arti posteriori, il concetto di cellule di programmazione come veicoli di somministrazione di farmaci è largamente applicabile. La piattaforma può essere facilmente adattato per programmare altri tipi cellulari per sovraesprimono fattori terapeutici che sono rilevanti per il trattamento di altre malattie come il cancro e malattie muscolo-scheletriche.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	11965
Fetal Bovine Serum	Invitrogen	10082
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15070
Basic Fibroblast Growth Factor	Peprotech	100-18B
1,4-Butanediol Diacrylate (90 %)	Sigma Aldrich	411744	Acronym: C
5-amino-1-pentanol (97 %)	Alfa Aesar	2508-29-4	Acronym: 32
Tetraethyleneglycoldiamine >99 %)	Molecular Biosciences	17774	Acronym: 122
Sodium Acetate	G-Biosciences	R010
Phosphate Buffered Saline	Invitrogen	14190-144
Tetrahyofuran Anhydrous (>99.9 %)	Sigma Aldrich	401757
Diethyl Ether Anhydrous (>99 %)	Fisher Scientific	E138-4
DMSO Anhydrous (>99.9 %)	Sigma Aldrich	276855
Gelatin	Sigma Aldrich	G9391
Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200
D-luciferin	GoldBio
Optimal Cutting Temperature (O.C.T)	Tissue-Tek	4583
Rat anti-Mouse CD31	BD Pharmingen	550274
Alexa Fluor 594 anti-rat IgG	Invitrogen	A11007