Programmerings stamceller i terapeutiska Angiogenes använda biologiskt nedbrytbara polymera nanopartiklar

Summary

Vi beskriver metoden för programmering stamceller för att överuttrycker terapeutiska faktorer för angiogenes använda biologiskt nedbrytbara polymera nanopartiklar. Processer beskrivs inkluderar polymersyntes, transfektera adipos-härledda stamceller in vitro, och att validera effektiviteten av programmerade stamceller för att befrämja angiogenes i en murin bakbensischemi-modell.

Abstract

Kontrollerad vaskulär tillväxt är avgörande för framgångsrik vävnadsregenerering och sårläkning, samt för behandling av ischemiska sjukdomar som stroke, hjärtinfarkt eller perifer artärsjukdomar. Direkt leverans av angiogena tillväxtfaktorer har potential att stimulera nya blodkärl tillväxt, men är ofta förknippat med begränsningar som brist på målinriktning och kort halveringstid in vivo. Genterapi erbjuder ett alternativt tillvägagångssätt genom att leverera gener som kodar för angiogena faktorer, men ofta kräver användning av virus, och begränsas av säkerhetsskäl. Här beskriver vi en nyligen utvecklad strategi för att stimulera kärltillväxt genom programmering stamceller för att överuttrycker angiogena faktorer på plats med hjälp av biologiskt nedbrytbara polymera nanopartiklar. Specifikt vår strategi utnyttjade stamceller som leveransfordon genom att utnyttja sin förmåga att migrera mot ischemiska vävnader in vivo. Använda optimerade polymer vektorer, fett-härleddastamceller var modifierade för att överuttrycka en angiogen gen som kodar för vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF). Vi beskrev processerna för polymersyntes, nanoparticle formation, transfektera stamceller in vitro, såväl som metoder för att validera effektiviteten av VEGF-uttryckande stamceller för att befrämja angiogenes i en murin bakbensischemi-modell.

Introduction

Det övergripande målet med denna teknik är att främja terapeutisk angiogenes med hjälp av icke-viralt programmerade stamceller överuttrycker terapeutiska faktorer på platsen för ischemi. Stamceller ändrades ex vivo först använda biologiskt nedbrytbara nanopartiklar syntetiseras i labbet, och sedan transplanteras i en musmodell av bakdelen ischemi att validera sin potential för att förbättra angiogenes och vävnads bärgning.

Kontrollerad kärltillväxt är en viktig del av framgångsrik vävnadsregenerering, samt för behandling av olika ischemiska sjukdomar som stroke, ischemi och hjärtinfarkt. Flera strategier har utvecklats för att främja kärltillväxt, inklusive tillväxtfaktor leverans och cellbaserad terapi. ¹ Trots effekt observerats i modeller av djursjukdomar, dessa metoder fortfarande inför begränsningar såsom behovet av suprafysiologiska doser för tillväxtfaktor leverans, eller otillräcklig parakrinsläpp med enbart celler. En potentiell strategi för att övervinna ovanstående begränsningar är att kombinera stamcellterapi och genterapi, varigenom stamceller är genetiskt programmerade ex vivo före transplantation för att överuttrycka önskvärda terapeutiska faktorer. Denna metod har visats i olika sjukdomsmodeller inklusive bakdelen ischemi ^2, hjärtsjukdomar ^3, benläkning ⁴ och nervskada ^5, osv. Men de flesta genterapiteknik är beroende av virala vektorer, som är förknippade med säkerhetsproblem såsom potentiell immunogenicitet och insertionsmutationer. Biomaterial förmedlade icke-viral gen leverans kan övervinna dessa begränsningar, men ofta lider av låg transfektion effektivitet. För att påskynda upptäckten av nya biomaterial för effektiv icke-viral gen leverans, har nya studier anställda kombinatorisk kemi och high-throughput screening. Bionedbrytbara bibliotek polymer såsom poly-(β-amino esgor) (PBAE) har utvecklats och avskärmade, vilket ledde till upptäckten av ledande polymerer med markant förbättrad effektivitet transfektion jämfört med de konventionella polymera vektor motsvarigheter. ^6-7

Häri beskriver vi syntesen av PBAE och kontroll av deras förmåga att transfektera adipos-härledda stamceller (ADSCs) in vitro, följt av efterföljande transplantation av genetiskt modifierade ADSCs uttrycker vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF) i en murin modell av bakbensischemi . Resultaten utvärderades genom att spåra cell öde med hjälp av mareld avbildning, bedöma vävnads reperfusion med hjälp av laser Doppler perfusion imaging (LDPI), och bestämma angiogenes och vävnads bärgning av histologi.

Protocol

1. Polymer Synthesis

1. I ett dragskåp, väg upp 3523 mg butandioldiakrylat (Ci) och överför till en glasskintillationsflaska innehållande en omröringsstav.
2. Förvärm 5-amino-1-pentanol (32) till 90 ° C för att solubilisera det salt, sedan i ett dragskåp, väg upp 1533 mg 32 och lägga till i scintillationsflaska innehållande C. Denna metod resulterar i ett molförhållande C: 32 = 1:1,2.
3. Placera omedelbart flaskan med båda lösningarna på en uppståndelse tallrik. Ställ uppståndelse hastighet vid 600 rpm.
4. Överför scintillationsflaska till en ugn inställd på 90 ° C. Ställ omröringshastigheten till 1000 rpm under 4 timmar. Om omrörare fastnar, sänk hastigheten. Efter 4 timmar, lägre hastigheten till 300 varv per minut och hålls kvar vid 90 ° C under ytterligare 12 till 16 timmar.
5. Tillsätt 5 g C32 till 10 ml vattenfri tetrahydrofuran (THF) i en glasskintillationsflaska innehållande en omröringsstav. Wrap i folie och skaka på hög tills helt upplöst.
6. I en separat glasscintillationsbehållare containing en omrörare, tillsätt 10 mM Tetraethyleneglycoldiamine (122). Tillsätt 40 ml THF.
7. Placera båda flaskorna (C32 och 122) på en uppståndelse tallrik för 5 minuter sedan kombinera ihop. Täck med folie och låt stå vid rumstemperatur under omröring vid 400 rpm under 24 timmar. Slutprodukten kallas C32-122.
8. Väg upp 5 x 50 ml Falcon-rör för varje 5 g sats av C32-122. Observera massan av varje rör i en anteckningsbok.
9. Överför 30 ml vattenfri dietyleter till vardera 50 ml Falcon-rör.
10. Överför 10 ml av C32-122 till var och en 50 ml Falcon rör.
11. Vortex Falcon-rör centrifugera kraftigt sedan vid 2500 rpm under 2 min. Anmärkning: Den extraherade polymeren kommer att samla in vid basen av röret.
12. Kassera den övre lösningen och upprepa steg 1,9 och 1,11 två gånger till.
13. Placera de öppna rör som innehåller den extraherade C32-122 i exsickator och vakuum över natten. Säkerställ att alla rör är skyddade från ljus.
14. Väg alla rör som innehåller C32-122 för att bestämma den slutliga massan avextraherade polymer.
15. Lös upp den extraherade polymeren i vattenfri DMSO vid en koncentration av 100 mg / ml.
16. Förvara den lösta polymeren vid -20 ° C i skydd mot ljus och fukt.

2. Cell Seeding

1. Förbeläggning basen på en T-150 vävnadsodlingskolv med 0,1% (vikt / volym) gelatin. Gelatinet ska vara kvar i kolven för 30-45 min. Gelatinet beläggning bidrar vidhäftning av ADSCs.
2. Aspirera gelatin från pre-belagd T-150-kolv.
3. Lägg till 4 x 10 ⁶ ADSCs (≤ passage 3) till kolven i 20 ml DMEM innehållande 10% FBS, 1% penicillin / streptomycin och 10 ng / ml bFGF.
4. Placera T-150-kolv i inkubatorn vid 37 ° C, 5% _CO2 över natten.
5. Börja transfektionsförfarandet följande dag.

3. Nanopartiklar Förberedelse och transfektion

1. Följande procedur gäller för beredning av nanopartiklar som innehåller 16,1 mikrogram plasmid-DNA per1,0 x 10 ⁶ celler vid en polymer till plasmid viktförhållande av 30:1.
2. Späd ut plasmid-DNA (1 mg / ml, pVEGF165, Aldevron, ND, USA) till en slutlig koncentration av 120 ng / ml i natriumacetat (25 mM) i en 15 ml Falcon-rör.
3. Späd C32-122 (100 mg / ml) till en slutlig koncentration av 3,6 mg / ml i natriumacetat (25 mM) i en andra 15 ml Falcon-rör.
4. Kombinera innehållet i varje Falcon-rör till en enda 15 ml Falcon-rör och virvla omedelbart på hög i 10 sek.
5. Låt röret stå i rumstemperatur under 10 min för nanopartikelbildning att inträffa.
6. Medan inkubation, byt medium i vävnadskultur kolv med 7.8 ml fullt kompletterat DMEM per 1,0 x 10 ⁶ celler transfekterade.
7. Överför nanoparticle lösning på vävnadsodlingskolv och luta framåt och bakåt för att fördela det jämnt.
8. Placera vävnadsodlingskolv i inkubatorn vid 37 ° C, 5% _CO2 under 4 timmar.
9. Efter 2 timmar, byt nanokel innehållande media med DMEM.
10. Efter ytterligare 2 h inkubation vid 37 ° C, 5% _CO2, cellerna är redo för in vivo injektion.

4. Bakbens Ischemi ordningen

1. Alla experiment har utförts i enlighet med Stanford University Animal Care och användning kommittén riktlinjer och godkända APLAC protokoll. Generera musmodell av bakdelen ischemi utförs som tidigare beskrivits. ⁸ Se referensen för detaljerade instruktioner. En kort beskrivning ges nedan.
2. Placera musen under anestesi med 1-3% doserings isofluran vid inandning och syreflödeshastighet av 1 l / min. Se till narkosdjup genom tå nypa, minskad andningsfrekvens, och letargi.
3. Ta bort hår från bukhålan och båda bakbenen områden av musen med raklödder.
4. Gör snitt i mitten av mediala låret mot mittlinjen och skär sedan genom överliggande fett pad till expose lårbensartären.
5. Ligera artären vid två platser: distalt ställe (nära till knä) och proximal plats (precis distalt inguinal ligament).
6. För att skapa ligeringarna, separera artär från venen och trä en 5-0 silke sutur runt artär. Fästa artären med två knutar för att göra ligation.
7. Ta artären mellan de två ligation punkterna.
8. Tvätta det kirurgiska området med PBS och sedan sutur incisionen stängdes.
9. Den anestesi kan nu tas bort. Håll musen varm tills nytt uppvaknande. För postoperativ vård, kan 2-4 mg / kg lidokain injiceras subkutant vid snittet platsen före åter uppvaknande. Ytterligare smärtlindring kan inkludera subkutan leverans av 0,05-0,1 mg / kg buprenorfin vid 12 och 24 tim. Övervaka hälsotillståndet hos mössen en gång om dagen i sju dagar genom att observera förändringar i andningsmönster, öppen smärta eller ångest, och hudfärg.
10. Bekräfta bakdelen ischemi med laser Doppler perfusion imaging.

5. Cell Injektioner

1. När de transfekterade cellerna och möss är klar, tvätta transfekterade cellerna med PBS, trypsinize, centrifug, och sedan räkna.
2. Återsuspendera celler vid en densitet av 10 x 10 ⁶ celler per ml i PBS.
3. Cellsuspensioner bör separeras i separata Eppendorf-rör i en volym av 110 | il. Detta kommer att säkerställa att varje mus mottar en lika stor mängd celler.
4. Placera varje mus under anestesi (2,5% isofluran, 1 L / min syreflöde).
5. Rengör injektionsstället med desinfektionsservetter.
6. Med hjälp av en 27 G tuberkulinspruta, rita cellerna upp och ner i sprutan för att säkerställa en homogen suspension erhålls. Rita upp 100 ul av cellsuspensionen volym in i sprutan.
7. Injicera hälften cellsuspensionen i adduktormuskeln regionen och sedan injicera den andra halvan i vadmuskeln regionen. Vid injicering, låt sprutan på plats i minst 15-30 sekunder tillförhindra läckage av cellsuspensionen.
8. Korrekt kontroller för djur studien är: 1) celler transfekterade med en icke-kodande plasmiden (t.ex. plasmid utan biologisk aktivitet), 2) enbart celler, och 3) PBS.
9. När injektioner är klar, ta bort musen från anestesi och håll varm tills mus åter vaknar.

6. Bioluminescence Imaging

1. Till att börja mareld avbildning (BLI), söva möss som beskrivits ovan.
2. Rengör injektionsstället med desinfektionsservetter.
3. Spruta Använda insulin, belastning 100 | il av 15 mg / ml D-luciferin (substrat för luciferas från eldfluga). Håll substrat borta från ljus.
4. För att utföra intraperitoneala injektioner, håller möss genom huden på ryggen för att dra sin främre huden spänd. För in nålen intraperitonealt in i bukhålan och injicera 100 pl substrat.
5. Placera musen i IVIS luciferas avbildning kammare under narkos.
6. När bilden förvärvas, markera regionen av intresse att mäta luciferas signal. I det här fallet, markera ischemiska extremiteten vid cellinjektionsstället.
7. Fortsätt att mäta luciferas signal varje 3-5 min tills signalen når en topp och börjar sjunka. Detta är det värde som används för jämförelse mellan möss och över flera tidpunkter.
8. När klar, ta bort mössen från kammaren och anestesi. Håll möss varm tills nytt uppvaknande.

7. Laser Doppler perfusion imaging

1. Laser Doppler perfusion imaging utförs såsom beskrivits tidigare. ⁸ Proceduren beskrivs kortfattat här.
2. Före doppler musen ska vara rent renrakad på de områden som ligger över både bakben och bukhålan för att förhindra artefakt på grund av hår.
3. När beredd att dopplerbilden, mouSE bör bedövades enligt beskrivningen ovan.
4. Värm mus till 36 ° C på en het platta, medan kontroll av kroppstemperatur genom rektal termometer.
5. Placera musen på en icke-reflekterande svart yta och hålla bedövad av noskon. Musen bör placeras på dess rygg ytan med sina armar och ben exponeras jämnt.
6. Placera laser Doppler sensorn ungefär 15 cm ovanför musen och rikta laserpekaren från sensorn mot ljumsken regionen av musen.
7. När musen och dopplersensorn är på plats, kan bilder tas utnyttja LDPIwin programvaran genom att trycka på startknappen.
8. Relativa mätningar perfusion kan tas genom att ange båda bakben (ischemisk och icke-ischemisk) som regionen intressen (ROI). Förhållandet av medelvärdet perfusion av det ischemiska till den icke-ischemiska bakbenet kommer att indikera relativa perfusion.

8. Vävnad skördordningen

1. När beredda att skörda mus tisstämma för histologi och / eller biokemisk behandling, bör musen avlivas. Här är musen avlivades genom exponering till 5% isofluran under 3-5 minuter, därefter euthanizing musen genom cervikal dislokation.
2. Skär den överliggande huden runt bakbenen omkretsen på den distala delen av buken och proximal till bakbenen. Huden skärs från den ventrala till ryggytor, så att huden kan dras tillbaka över bakdelen på foten.
3. På dra huden tillbaka, skulle lemmen amputeras genom att utnyttja dissektion sax för att klippa i bäcken och lårben gemensamt.
4. Två huvud vävnader tas för analys: den mediala adduktorer och gastrocnemius musklerna.
5. För histologi, bädda in en eller båda vävnader i optimal skärtemperatur (oktober) för kryosektionering.
6. För biokemisk analys, samla en eller båda vävnader in i ett 1,5 ml Eppendorf-och nedsänkas i ett bad av flytande kväve under åtminstone 2 min. Proverna kan varalagrades vid -80 ° C för framtida bearbetning.

Representative Results

Vid blandning tillsammans, den positivt laddade polymeren (C32-122) och negativt laddade DNA-plasmiden själv monterar in i nanopartiklar. Nanopartiklar bildas kan bekräftas genom elektrofores analys dvs komplexbildning mellan C32-122 och plasmid-DNA kommer att förhindra utnyttjandet av DNA under elektrofores. Polymeren fungerar som en transfektion reagens för att underlätta förstärkt upptag av DNA in i målcellerna och efterföljande expression av kodar för proteiner (fig 2). Celler kan transfekteras med alla terapeutiska gener eller reporter-DNA, såsom grönt fluorescerande protein (GFP) för att underlätta en snabb optimering av polymera vektordesign och transfektion betingelser med hög effektivitet med användning av fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) och fluorescensmikroskopi (Fig. 3). För ADSCs är en verkningsgrad över 20% bedöms lämplig.

För att underlätta spårning av cellens öde efter transplantationtion, kan celler stabilt omvandlas med luciferas, som möjliggör realtidsövervakning av cellernas livskraft och distribution in vivo med hjälp av icke-invasiv mareld imaging (BLI). BLI imaging visade hög intensitet luminiscens signal från bakbenet (Figur 4, till vänster), vilket indikerar att implanterade celler kvar på injektionsstället under flera dagar, och vi följer inte märkbar cellmigration till andra vävnader eller organ under loppet av 21 dagar. Cell signal i allmänhet minskad övertid och varade upp till 14 dagar (Figur 4, högra fältet), vilket antyder att de flesta transplanterade celler finns tillgängliga för att överuttrycka terapeutiska faktorer i upp till två veckor.

Doppler imaging är ett användbart verktyg som möjliggör realtidsövervakning av blod reperfusion till den ischemiska extremiteten. Den vänstra panelen i figur 5 är en representativ bild av blodflödet efter induktion av ischemi. Det mörka området visar successful blockering av blodflödet efter operationen. Den högra panelen i figur 5 illustrerar fullständig reperfusion av lemmen 14 dagar efter behandling med transfekterade celler.

De tekniker som beskrivs ovan tillåter realtid kvantifiering, och bör kompletteras med ytterligare slutpunkt analyser att grundligt undersöka den terapeutiska effekten. Muskelvävnad som har fått transplanterade cellerna kan skördas vid olika tidpunkter för genexpression och histologiska analyser. RT-PCR kan användas för att kvantifiera genuttryck i bakbenet för att bekräfta genetisk uppreglering i transfekterade celler flera dagar efter transplantation. Figur 6 visar VEGF uttryck i den obehandlade lem, injicerade med PBS eller injiceras med VEGF uttrycker ADSCs . Resultaten bekräftar VEGF uppreglering i icke-virala transfekterade celler fyra dagar efter transplantation, ytterligare ger belägg för transplanterade cellöverlevnad.

Histologiska färgning möjliggör direkt visualisering av vävnad morfologi och graden av vävnadsregenerering. Histologisk analys för blodkärlstätheten kan kopplas med Doppler bilddata för att utvärdera effekten av blod reperfusion (Figur 7). Vävnadsmorfologi färgning som H & E och Masson trikrom färgningar är användbara för att bedöma graden av vävnadsregenerering eller nekros. Framgångsrikt nyligen regener muskelvävnad präglas av muskelceller med centralt belägna kärnor, medan nekrotiska vävnad visar ofta betydande vävnad fibros eller ökat antal inflammatoriska celler såsom makrofager.

Figur 1. Schematisk illustrerar syntesen av poly-(β-amino)-ester (PBAE)-baserad vektor, C32-122. (A) akryle terminerad C32-Ac bildades genom en Michael-additionsreaktion mellan en monomer med diacrylate ändgrupper (C) och en monomer med primär amin ändgrupp (32). (B) End-modifierad PBAE polymerer kan bildas genom tillsats av aminterminerade monomerer för förbättrad effektivitet transfektion. (C) Tetraethyleneglycoldiamine (122) valdes som terminal aminmonomeren. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 2. Schematisk av bildandet av biologiskt nedbrytbara polymera nanopartiklar, och deras efterföljande cell upp-tar processen för proteinuttryck.

Figur 3. Mänskliga adipos-härledda stamceller som överuttrycker grönt fluorescerande protein (GFP). Transfektion utfördes genom att använda polymera nanopartiklar som bildades med användning C32-122 och GFP-DNA-plasmid. Scale bar: 200 | im.

Figur 4. Uppgifter av musen benen vid dag 0 (vänster) och dag 14 (högra panelen) efter injektion av GFP-luciferas positiva fett som härrör stamceller i musen bakbenen representant mareld avbildning (BLI).

Figur 5. Representativa Doppler bilder som visar induktion av ischemi i en sida av murin bakbenet på dag 0 (vänster panel) och framgångsrika blodreperfusion 14 dagar efter injektionen av VEGF-overexpressing adipos-härledda stamceller (höger panel).

Figur 6. För att bekräfta cellöverlevnad och överuttryck av kodade terapeutiska faktorer i situ, kan vävnader skördas från injektionsstället för gen uttryckession analyser. RT-PCR bekräftade framgångsrikt uppreglering av VEGF, den kodade terapeutiska proteinet, i den behandlade gruppen (ADSC-VEGF) fyra dagar efter cellinjektion, medan ingen expression kunde påvisas i PBS-kontroll.

Figur 7. Representant immunhistokemisk bild visar kapillär densitet genom anti-CD31 färgning på 28 dagar efter det kirurgiska ingreppet Skala bar:. 100 nm.

Discussion

Här rapporterar vi en metod för att programmera vuxna stamceller för att överuttrycker terapeutiska faktorer med hjälp av icke-virala, biologiskt nedbrytbara nanopartiklar. Denna plattform är speciellt användbar för behandling av sjukdomar där stamceller kan naturligtvis hem, såsom ischemi och cancer. ^9-10 Dessutom tillåter icke-viral genterapiplattform för transient överuttryck av terapeutiska faktorer, som är lämplig för de flesta vävnadsregenerering och sår läkningsprocesser. Transfektionsbehandlingen beror på effektiv DNA-inträde i celler, och i allmänhet fungerar bra i aktivt-delande celltyper, men inte lika bra i icke-delande celler. Transfektionseffektiviteten av PBAE polymerer kan variera från celltyp till celltyp, och bör optimeras individuellt och ytterligare kemisk struktur modifieringar kan undersökas för att uppnå optimal transfektionseffektivitet i särskilda riktade cellpopulationer. ^11-12 Celler transfekterade med den ovan beskrivna metoden oftast resulterar i.n gående genuttryck och proteinutsöndring i två veckor, med maximal genuttryck uppnås runt dag 2-4. För djurförsök är ADSCs med transfektion effektivitet över 20% anses vara lämpligt. Det rekommenderas att utföra FACS-analys varje gång en processparameter ändras för upprätthålla konsekvens (t.ex. ny sats av polymererna, plasmider eller celler).

Jämfört med de kommersiellt tillgängliga transfektionsreagens, såsom PEI och Lipofectamine 2000, vilka är icke-nedbrytbara, de PBAE polymerer som används vid den rapporterade plattform ovan är biologiskt nedbrytbara och mer lämpade för klinisk översättning. Med tanke på att sådana polymera vektorer är hydrolytiskt nedbrytbara ¹³ och ljuskänslig, bör försiktighet iakttas för att lagra PBAE polymerer ordentligt (-20 ° C, i mörker, med torkmedel) för att förhindra oönskad hydrolys och nedbrytning. De resulterande polymererna har en fördelning av molekylvikten, och storleksuteslutande kromatografi (SEC) may utföras för att ytterligare rena PBAEs med ökad transfektion effektivitet. ¹⁴ Det rekommenderas också att utföra kärnmagnetisk resonans (NMR) vid varje steg i polymersyntesprotokollet. NMR bör utföras för att bekräfta bildningen av C32 från dess enskilda komponenter och igen för att bekräfta lyckad tillägg av ändskyddande grupper dvs 122. Observera: efter tillsats av slut tak grupper bör akrylatgrupper försvinna från NMR-spektrum. Närvaron av överskott av aminterminerade monomerer i den slutliga polymeren kan leda till ökad celltoxicitet, därför är det viktigt att tillräckligt tvätta slutliga polymeren i dietyleter för att säkerställa avlägsnande av överskott av monomerer. Såsom nämnts ovan, kan SEC också användas för att främja renhet hos slutprodukten.

Till skillnad från många virusbaserade gen leveransplattformar, inte polymerbaserade gen leveranssystem som används här inte integreras i värdgenomet, och därmed undvika den potentiella risken för inser mutagenesis och immunogenicitet. ^15-16

I det beskrivna förfarandet, celler transplanterades utan sortering direkt efter transfektion processen, som innehåller en blandning av celler som överuttrycker som kodar för proteiner och icke-transfekterade celler. Detta förfarande möjliggör minimal ex vivo manipulering av cellerna, och kommer sannolikt att vara mer kliniskt översättningsbart med tanke på minskad tid, kostnader och risken för kontaminering. Celler kan också renas ytterligare för att välja transfekterade celler endast för att ytterligare öka graden av överuttryck av terapeutiska faktorer i situ.

Effekten av programmerade stamceller för angiogenes bör undersökas med hjälp av en kombination av analyser för att grundligt bedöma resultaten på flera nivåer, inklusive cellulära, morfologiska och fysiologiska. Bioluminescence avbildning möjliggör realtidsövervakning av överlevnad och distribution av transplanterade celler över tiden. Gene expression analyser från harvserad vävnader tillåter kontroll av cellöverlevnad och genetisk uppreglering av kodade faktorer på plats. Histologisk färgning möjliggör direkt visualisering av blodkärlstätheten, inflammation och vävnadsregenerering. Det bör noteras att en ökad blodkärlstätheten inte alltid leder till framgångsrik blod reperfusion, eftersom de nybildade kärl kan vara omogna och icke-funktionella. Därför är det viktigt att utvärdera den fysiologiska funktionen av nybildade kärl med hjälp av laser Doppler perfusion imaging. Även om metoderna ovan fokus på att använda fett som härrör stamceller för att främja angiogenes i ett bakben ischemi modell, är begreppet programmering celler som läkemedelsbärare bred tillämpning. Plattformen kan enkelt anpassas för att programmera andra celltyper för överuttryck av terapeutiska faktorer som är relevanta för att behandla andra sjukdomar som cancer och sjukdomar i rörelseorganen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Invitrogen	11965
Fetal Bovine Serum	Invitrogen	10082
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15070
Basic Fibroblast Growth Factor	Peprotech	100-18B
1,4-Butanediol Diacrylate (90 %)	Sigma Aldrich	411744	Acronym: C
5-amino-1-pentanol (97 %)	Alfa Aesar	2508-29-4	Acronym: 32
Tetraethyleneglycoldiamine >99 %)	Molecular Biosciences	17774	Acronym: 122
Sodium Acetate	G-Biosciences	R010
Phosphate Buffered Saline	Invitrogen	14190-144
Tetrahyofuran Anhydrous (>99.9 %)	Sigma Aldrich	401757
Diethyl Ether Anhydrous (>99 %)	Fisher Scientific	E138-4
DMSO Anhydrous (>99.9 %)	Sigma Aldrich	276855
Gelatin	Sigma Aldrich	G9391
Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200
D-luciferin	GoldBio
Optimal Cutting Temperature (O.C.T)	Tissue-Tek	4583
Rat anti-Mouse CD31	BD Pharmingen	550274
Alexa Fluor 594 anti-rat IgG	Invitrogen	A11007