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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Identifizierung von DNA-Mutationen in hämatopoetischen Stammzellen Gereinigtes / Vorläuferzellen

Published: February 24, 2014 doi: 10.3791/50752
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 3, 4,5, 2, 2,5, 1,2,5
1Greehey Children's Cancer Research Institute, UT Health Science Center at San Antonio, 2Department of Cellular and Structural Biology, UT Health Science Center at San Antonio, 3Department of Pathology, UT Health Science Center at San Antonio, 4Department of Microbiology, UT Health Science Center at San Antonio, 5Cancer Therapy and Research Center, UT Health Science Center at San Antonio

Summary

Hier beschreiben wir ein in-vivo-Mutagenese-Assay für eine kleine Anzahl von gereinigten hämatopoetischen Zellen unter Verwendung des lacI transgenen Mausmodell. Die LacI Gen isoliert, um die Häufigkeit, Ort und Art der DNA-Mutanten entstanden spontan oder nach der Exposition zu Genotoxinen bestimmen.

Abstract

In den letzten Jahren hat es sich gezeigt, dass genomische Instabilität fest mit vielen Entwicklungsstörungen, Krebs und Alterung. Da die Stammzellen für die Gewährleistung Gewebshomöostase und Reparatur des gesamten Lebens verantwortlich sind, ist es vernünftig zu vermuten, dass die Stammzellpopulation ist für die Erhaltung der genomischen Integrität der Gewebe. Deshalb hat großes Interesse an der Beurteilung der Auswirkungen von endogenen und Umweltfaktoren auf die genomischen Integrität in Stammzellen und deren Nachkommen, mit dem Ziel, die Ätiologie der Stammzellen basierte Krankheiten zu verstehen entstanden.

LacI transgenen Mäuse tragen eine erzielbare λ-Phagenvektor lacI-Reportersystems, wobei das lacI-Gen dient als Reporter-Mutation kodiert. Das Ergebnis einer mutierten lacI-Gen ist die Herstellung von β-Galactosidase spaltet ein chromogenes Substrat, Drehen blau. Die LacI Reportersystem ist durch in alle Zellen, einschließlich Stammzellen / Vorläuferzellen und können problemlos wiederhergestellt und verwendet werden, um anschließend zu infizieren E. werden coli. Nach Inkubation infizierten E. coli auf Agarose, die das richtige Substrat enthält, können Plaques erzielt werden; blaue Plaques zeigen eine Mutante LacI Gen, während klare Plaques Hafen-Wildtyp. Die Häufigkeit von blau (unter klar) Plaques zeigt die Mutationsrate in der ursprünglichen Zellpopulation wurde die DNA extrahiert aus. Sequenzierung der mutierten lacI-Gen wird die Position der Mutationen in dem Gen, und die Art der Mutation anzuzeigen.

LacI transgenen Mausmodell wird als ein in vivo-Mutagenese-Assay etabliert. Außerdem werden die Mäuse und die Reagenzien für den Assay sind im Handel erhältlich. Hier beschreiben wir detailliert, wie dieses Modell geeignet ist, die Frequenz von spontan auftretenden DNA-Mutanten in Stammzell-angereichertem Lin messen - IL7R - Sca-1 + + + cKit (LSK) Zellen und anderen Subpopulationen des hämatopoetischen Systems.

Introduction

In den meisten Geweben, differenzierte Zellen haben eine begrenzte Lebensdauer. Um funktionale Integrität zu erhalten, langlebig, gewebespezifische Stammzellen kontinuierlich Vorläuferzellen, die wiederum führen zu den ausdifferenzierten Zellen, die für die Funktion des jeweiligen Gewebes erforderlich. Stammzellen ihre eigene Fach durch einen Prozess namens Selbsterneuerung auch wieder aufzufüllen. So, für die Aufrechterhaltung der Funktionsfähigkeit des Gewebes, sie wohnen in. Deshalb verantwortlich sind Stammzellen, ist es unerlässlich, dass sie mit robusten Mechanismen ausgestattet, um zu erfassen und möglicherweise reparieren beschädigte DNA. Wenn nicht, können sie mehrere genomische (potentiell schädlichen) Störungen, die durch ihre Nachkommen vererbt werden können, zu erwerben. Zu verstehen, wie Stammzellen si-chern ihr Genom während der Lebensdauer eines Organismus ist eine wichtige Frage und kann uns helfen zu verstehen, warum genomische Instabilität wird mit Krebs und einigen anderen altersbedingten Krankheiten (in 1,2 bewertet) verbunden ist.

3-6 messen. Es wurde gefunden, daß beispielsweise in den blutbildenden Systems, Doppelstrang-DNA-Brüche können durch homologe Rekombination (HR) oder nicht-homologen Ende repariert werden (NHEJ), wobei letztere eine Reparatur des unteren Treue und damit eine erhöhte Gefahr, dass Fehler. Beide werden in hämatopoetischen Stammzellen (HSC) 4,5 verwendet, jedoch bei Mäusen scheint es überwiegend NHEJ in der Erwägung, dass HSCs frühen Vorläuferzellen nutzen HR 4. Eine ähnliche Beobachtung wurde für die Stammzellen in der Haut 6 hergestellt. Interessant ist, dass in der menschlichen Blutstammzellen HR, NHEJ nicht,scheint der Reparaturmechanismus der Wahl für die Doppelstrangbrüche 3 sein. Ob diese funktionelle Unterschied zwischen den zwei Arten ist real oder nur eine technische oder experimentellen Unterschied, bleibt abzuwarten.

Repertoire eine Stammzelle zur Reparatur beschädigter DNA ist wahrscheinlich andere DNA-Reparaturmechanismen, wie Basenexzisionsreparatur (BER), Nukleotidexzisionsreparatur (NER) und Mismatch-Reparatur (MMR) enthalten. BER und NER sind für die Reparatur von einem oder mehreren Basenpaar Läsionen in Einzelstrang-DNA verantwortlich, während MMR-Fixes Basen-Basen-Fehlpaarungen und Einfügen / Löschen Schleifen, diese Arten von DNA-Schäden kann nicht durch NHEJ oder HR repariert werden. Unterstützt wird dieser Begriff gibt mehrere Studien aus dem blutbildenden Systems, die einen Zusammenhang zwischen Veränderungen in einem dieser Wege und Anomalien in der HSC Fach 7-9, sowie einem erhöhten Risiko der Entwicklung von myelodysplastischen Syndroms 10-16, eine Krankheit, die im UrsprungHSC und dass mit zunehmender genomische Instabilität wie die Krankheit fort 17 zugeordnet. Bis jetzt wurden Messungen der BER, NER und MMR direkt in HSCs nicht berichtet.

Zusätzlich zur Verdeutlichung der verschiedenen Prozesse, die Gewebeintegrität in einem mechanistischen Pegel zu steuern, ist es unerlässlich, um das Ausmaß der mutierten DNA zu messen, so dass die Folgen von Aberrationen in einem dieser Verfahren kann getestet werden, z. B. in normalen gegenüber genetisch entwickelt, Stammzellen oder in alt gegen jung. Allerdings ist die Entwicklung einer entsprechenden Assay wegen des Mangels an gewebespezifische Stammzellen und das Fehlen von Kulturbedingungen, die "stemness" bewahrt schwierig. Darüber hinaus sollte ein solches Assay abänderbar, um umweltbedingte und genetische Manipulationen. Eine mögliche Lösung für diese Einschränkungen und Anforderungen ist die Verwendung von Maus-Modellen, die spezifisch entworfen sind, um DNA-Mutationen zu detektieren.

MulFach-transgene Mausmodelle für den Mutationsnachweis wurden entwickelt. Zum Beispiel LacI transgenen Mäusen 18 führen einen erzielbaren λ-Phagen-Vektor, der das LacI Reportersystem, in dem die LacI Gen kodiert für ein Suppressor der Lac-Operator und dient als Reporter Mutation kodiert. Nach Mutation des lacI-Gens, wird der lac-Operator aktiviert und β-Galaktosidase hergestellt wird. β-Galactosidase spaltet das chromogene Substrat X-Gal (5-Brom-4-chlor-e-indolyl-β-D-galactopyranosid), der es blau wird. Die cos-Stellen flankieren den LacI Vektor erlaubt die einfache Wiederherstellung von Lambda-Phagen-Proteine ​​und anschließende Infektion von E. coli. Nach Inkubation infizierten E. coli auf Agarose, die die X-gal-Substrat enthält, kann Plaques erzielt werden. Blaue Plaketten enthalten eine mutmaßliche Mutanten-Lac-I Durchführung Phagen, während klare Plaques Hafen nicht-Mutanten. Die Häufigkeit der blaue Plaques (unter the klar sind) gibt die Mutationsrate in der ursprünglichen Zellpopulation wurde die DNA extrahiert aus. Darüber hinaus kann die λ-Phagen-Hosting lacI Ziel leicht sequenziert werden unter Verwendung von PCR-Techniken für relativ hohe Durchsatzanalyse. Die Sequenzierung mehrere mutierte Gene LacI wichtige Informationen über das Mutationsspektrum, die wiederum auf mögliche Mängel in bestimmten DNA-Reparaturwegen oder auf bestimmte gentoxische Ereignisse zeigen offenbaren. LacI transgenen System über mehrere Laboratorien 19 standardisiert und die Reagenzien sind im Handel erhältlich. Ein Hauptnachteil des lacI-System ist die begrenzte Möglichkeit, große Deletionen oder Umordnungen nachzuweisen, weshalb andere Verfahren, z. B. Mehrfarben-FISH an Metaphasespreitungen müssen verwendet werden, um diesen Mangel zu ergänzen sein.

Innerhalb des λ-Phagenvektor des lacI-Mausmodell, gibt es eine viel kleinere Gen CII, Für die Mutationsanalyse zur Verfügung. Die Größe und die Tatsache, daß Mutanten können ausgewählt werden, macht dies zu einer weniger arbeitsintensiven und kostengünstiger als der Assay 20 lacI-Gen-Analyse. Jedoch wird das lacI-Gen umfassender zur Mutagenese 21 und der Empfindlichkeit des Gen-Mutationen untersucht worden ist und dadurch, dass es eine klare Verständnis der Aminosäurereste, die eine phänotypische Reaktion auf ein chromogenes Substrat 22-25 zu erzeugen.

Andere Maus-Modelle für den Mutationsnachweis umfassen die Verwendung der &PHgr; X174 oder das lacZ-Transgen. Die &PHgr; X174 transgenen Mausmodell, mit dem Original-A: T → G: C-Reversion-Mutationstest 26 oder die Vorwärtsmutationstest 27 die Erkennung von einem Spektrum von Basenpaar-Substitutionen, stellt eine weniger kostspielige System als die LacI Modells ermöglicht. Allerdings ist die Mutations Bildschirm in der Vorwärts Assay nicht trivial und die Mutation spectrum des &PHgr; X174 Transgen nicht wie die des LacI gut charakterisiert. In Maus-Modellen trägt LacZ Transgene wird die Mutations LacZ Reporter erholt Verwendung E. coli-Wirtszellen, die empfindlich auf Galaktose und Galaktose-Medium 28 enthalten sind. Ein Nachteil dieses Systems ist, dass die Wiederherstellung des LacZ Ziel beinhaltet auch Restriktionsendonuklease-Verdau, gefolgt von Ligation und Elektroporation von E. coli-Wirte, wodurch es schwierig wird, das System für eine kleine Anzahl von Zellen anzupassen. Obwohl es nicht eine absolute Voraussetzung für die Arbeit mit Stammzellen / Vorläuferzellpopulationen (kann man immer mit mehr Mäuse beginnen), wenn eine große Zahl von Zellen erforderlich sind (zB Millionen oder mehr) es wird schnell unpraktisch und kostspielig geworden. Auch die relativ großen Abmessungen von LacZ, während ein empfindlicher Mutations Reporter, ist umständlich und kostspielig für die DNA-Sequenzanalyse und determfung der Mutation Spektren. Ein Hauptvorteil dieses Modells ist jedoch seine Fähigkeit, große Deletionen und Insertionen zu detektieren, sowie chromosomale Rearrangements.

Da alle Zellen in lacI, &PHgr; X174 und LacZ transgenen Mausmodellen führen das Reportersystem kann jeder dieser Mausmodelle verwendet werden, um die Mutagenese in jedem Zelltyp von Interesse zu messen, einschließlich der Stamm-und Vorläuferzellen, solange sie zuverlässig entnommen werden können und in ausreichender Zahl. Weil wir umfangreiche Erfahrung mit der LacI Mausmodell und dem LacI Mutationstest, haben wir beschlossen, dieses System weiter für die Mutagenese-Analyse in hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferpopulationen zu verfolgen.

Die blutbildenden Gewebe ist gut charakterisiert hinsichtlich der Zelloberfläche Phänotyp der einzelnen Komponenten, einschließlich der langfristigen Bestandsauffüllung Stammzellen, die erkennbar der extrem seltenen Bevölkerung von Lin sind - IL7R + cKit + + (LSK) / Flk2 - CD150 + CD48 - Zellen 29. . Mohrin et al 4 gezeigt, dass die Bevölkerung von etwas größer LSK/Flk2 - Zellen sind immer noch gute Vertreter für HSK und die erheblich von den primitivsten engagierte myeloischen Vorläufer (CMP) Bevölkerung, wenn es um das Studium der DNA-Reparatur kommt. Wenn darüber hinaus die HSC-angereicherten LSK (Flk-2 +-und Flk-2 -) - IL7R - Zellen wurden zum Vergleich Lin Sca-1-cKit + + (K LS-Vorläuferzellen), gab es immer noch einen signifikanten Unterschied in NHEJ Fähigkeit 5 zwischen der weniger rein, Stammzell-angereichertem LSK Bevölkerung und die Vorläuferzellen. In unserer Studie verwenden wir HSC angereicherte LSK (Flk-2 +-und Flk-2 -)-Zellen, weil wir festgestellt, dass mindestens 2 x 10 5 Zellen für konsistente, zuverlässige Ergebnisse in dieser Mutagenese-Assay erforderlich, das die Zellzahl ist äußerst schwierig,zu erhalten, wenn man die LSK/Flk2 sortiert - CD150 + CD48 Bevölkerung oder auch die LSK/Flk2 - Bevölkerung (in Form von Mäusen, Kosten und Praktikabilität). Dieses Protokoll basiert auf der ursprünglich von Kohler et 18 al. Entwickelt beschreibt im Detail, wie die spontane DNA-Mutantenfrequenz in LSK Zellen differenzierten Populationen von myeloischen Zellen sowie nicht getrennten Knochenmark und Milz-Zellen bestimmt und definiert werden.

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Protocol

Leukozyten aus LacI transgenen Mäuse auf einer C57BL / 6 Hintergrund nicht exprimieren Sca-1 (Abbildung 1). Deshalb, wenn Sca-1 ist ein Marker für Zellreinigung verwendet wird, müssen diese Mäuse mit einer entsprechenden Belastung für Sca-1-Expression zu gewinnen gekreuzt werden, in diesem Protokoll die F1 einer Kreuzung zwischen normalen C57BL / 6 (B6) Mäuse und LacI (C57BL / 6)-transgenen Mäusen (lacI) verwendet wurde (Fig. 1). Von den Zellpopulationen in diesem Protokoll verwendet, und LSKS CMPs stellen die kleinsten Populationen im Knochenmark. Um zu reinigen, mindestens 2 x 10 je 5 / Art, kombinieren das Mark aus etwa zehn Mäusen bei der Ernte nur das Mark aus den Hinterbeinen oder aus mindestens vier Mäuse, wenn auch die Hip-, Front-Beine, Wirbelsäule Knochen, und Brustbein verwendet.

Machen Einzelzellsuspensionen aus dem Knochenmark und Milz. Ein kleiner Anteil des Knochenmarks wird verwendet, wie es ist, wird verwendet, um die Mehrheit purIfy LSKS und differenzierten myeloiden Vorläuferzellen, dh CMPs und Granulocyten / Monozyten-Progenitoren (GMP) durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS). Die Isolierung von Knochenmarkszellen und FACS-Reinigung dieser Populationen anderswo 30-32 beschrieben. Etwa sechs unabhängige Arten sind erforderlich, um signifikante Unterschiede in der Mutationshäufigkeiten zwischen den Populationen zu identifizieren.

Das folgende Protokoll für die Messung der spontanen Mutationsrate in vivo in gereinigtem hämatopoetischen Subpopulationen aus mehreren Stratagene Bedienungsanleitungen 33-35, basierend auf Originalarbeit von 18 Kohler et al. Angepasst Die wichtigsten Unterschiede zwischen den bestehenden Protokollen 33-35 und dieses Protokoll bei Verwendung relativ kleine Anzahl von Zellen erforderlich ist, sind Unterschiede in Volumina von Reagenzien und die Zeiten und Temperaturen für die Proteinase K-Inkubation verwendet.

Nach dem Sammeln der gewünschten Zellpopulationen Aliquot Zellen in 1-ml-Zentrifugenröhrchen (für die Zellzahl pro Aliquot, siehe Tabelle 1). Zentrifuge bei 266 × g für 7 min bei 4 ° C. Saugen Sie den Überstand vorsichtig. Setzen Sie die Röhrchen in flüssigem Stickstoff für 5 min und dann übertragen Sie sie auf einem -80 ° C Gefrierschrank zur weiteren Verwendung. Die Proben für mindestens 6 Monate gelagert werden.

2. Isolierung genomischer DNA

  1. Nehmen Sie die Proben aus dem -80 ° C Gefrierschrank. Hinzufügen von 500 &mgr; l eiskaltem Lysepuffer DNA (Tabelle 3) in das Probenröhrchen. Vortex die Rohre für 3-5 Sekunden auf mittlerer Geschwindigkeit und legen Sie die Röhrchen auf Eis für 10 min.
  2. Zentrifugieren der Röhrchen für 12 min, 4000 × g, 4 ° C Sorgfältig verwerfen ~ 450 ul des Überstands. Spin in die Röhre für 3-5 sek. Verwenden Sie eine Glaskapillare, um vorsichtig den Rest des Überstandes. Luft trocknen die Innenwände von ter Rohr, bis keine Tropfen mehr sichtbar sind (ca. 2 min).
  3. Add 2 ul RNace Es Ribonuklease-Cocktail und 10 ul 1 M DTT und 100 ul der DNA-Verdauungspuffer (Tabelle 3). Einstellen der Volumina nach der Anzahl der Proben, die verarbeitet werden; pro Probe 20 &mgr; l dieser DNA-Verdauungslösung erforderlich. Nach Zugabe von 20 ul dies dem Zellpellet, versuchen, das Pellet lösen sich von der Unterseite, durch leichtes Antippen des Röhrchens mit dem Finger oder einem Stift.
    Hinweis: es schwierig sein kann, um das Pellet wegen der niedrigen Zellzahlen zu sehen.
  4. In 20 ul Proteinase-K-Lösung * (Tabelle 3) zu jeder Probe, sehr vorsichtig auf Rohr wieder.
    * Anmerkung: Die Proteinase-K-Lösung sollte in einem 50 ° C-Wasserbad erwärmt, 2 Minuten vor, um das Enzym zu aktivieren verwenden.
  5. Das Röhrchen sofort in einem 50 ° C Wasserbad. Digest die Probe nach den Richtlinien in Hinweis: Bei so kleinen Anzahl von Zellen, die Temperatur des Wasserbades und die Aufschlusszeiten sind für qualitativ hochwertige genomische DNA erfolgreich Erhalt absolut entscheidend.
  6. Bereiten Sie die DNA-Dialysesystem im Kühlraum (Abbildung 2). Gießen 600 ml TE-Puffer (Tabelle 3) in einem 600 ml Becherglas, einen kleinen magnetischen Rührstab, so dass der Puffer während der Dialyse gerührt werden und lassen die 0,025 mm (Porengröße) Membranen schwimmen auf der Oberfläche des Puffers. Eine Membran pro Probe; 1-4 Membranen können in einem Becherglas Dialyse verwendet werden. Machen Sie eine Markierung am Rand der Membran mit einer Schere zur Identifizierung jeder Probe.
  7. Nach der entsprechenden Verdauungszeit, fügen Sie das jetzt sehr zähflüssig genomische DNA * vorsichtig in die Mitte der schwimmenden Membran (Abbildung 2). Das Becherglas sofort mit Aluminiumfolie. Dialysieren der genomischen DNA bei 4 ° C für ~ 16-20hr, rühren den Puffer sanft.
    * Hinweis: Bei der Arbeit mit viskosen DNA-Lösungen verwenden Pipettenspitzen mit einer breiten Öffnung.
  8. Am nächsten Tag gießen Sie 600 ml frisch zubereitet TE-Puffer (Tabelle 3) auf ein sauberes Becherglas und übertragen die Membranen auf die neue Becherglas mit einem Löffel vorsichtig und decken das Becherglas mit Folie. Dialyse für weitere 2 Stunden.
  9. Entfernen Sie die Dialysemembran aus dem Becher mit dem TE-Puffer mit einem Löffel und übertragen nur den viskosen "Klumpen" der DNA-Lösung zu einer neuen, sterilen 1-ml-Tube. Die Probe bei 4 ° C Weiterhin die Mutagenese-Assay am nächsten Tag oder bis zu 1,5 Monate später. Für den gereinigten Populationen, warten Sie mindestens 1 Woche.

3. Herstellung von Tabletts für die E. coli / Phagen-Kultur (Tag 1)

Jedes Fach wird zwei verschiedene Schichten enthalten; eine Agar-Schicht an der Unterseite und eine Agarose-Schicht an der Oberseite, die X-gal enthält. Die E.coli / Phagenlösung wird zu dieser zugegeben werden. Die Anzahl und Art von Zellen isoliert wird bestimmen, wie viele Fächer erforderlich. Informationen in Tabelle 1, die Anzahl von Schalen erforderlich und anschließende Mengen von Lösungen für diesen Teil des Protokolls zu berechnen. Im Folgenden wird zu generieren ~ 60 Böden, die eine erfahrene Person kann leicht zu verarbeiten.

  1. Bereiten Sie die folgenden Medien:
    1. für die Bodenschicht, bereiten 6 x 2 L Flaschen mit jeweils 1600 ml ddH 2 O enthält, In NZY Pulver (21 g / L) und Agar (15 g / l), gut mischen.
    2. für die Deckschicht, bereiten 4 x 1 l-Flaschen mit jeweils 800 ml ddH 2 O enthält, In NZY Pulver (21 g / L) und Agarose (7,2 g / L), gut mischen.
    3. für die Kultivierung von E. coli, füge 2,5 g NZY Pulver jeweils 2 x 250 ml-Kolben und bringe das Volumen auf 100 ml mit ddH 2 O;
    4. zur Bestätigung Tabletts bei Schritt 8 verwendet, fügen Sie 8,4 g NZY Pulver und 6 g agar in einen 1-l-Kolben und bringe das Volumen auf 400 ml mit ddH 2 O.
  2. Decken Sie die Öffnung der Flaschen mit Aluminiumfolie. Gut mischen und autoklavieren bei 121 ° C, 15 bar für 30 min.
  3. Entfernen Sie die Flaschen (SEHR HEISS!) Aus dem Autoklaven. Vorsichtig schwenken die Flaschen, die Agar mischen und Agarose, dann legen Sie sie in einem 50 ° C Wasserbad. Wenn das Wasserbad von 50 ° C wieder erreicht, gießen aus den 2 L-Kolben (Schritt 3.1.1) ~ 150 ml NZY Agar in jedem Fach (untere Schicht).
  4. Lassen Sie das Agar bei RT für mindestens 2 Stunden fest werden, dann wandeln und öffnen Sie die Fächer. Legen Sie den Boden der Schalen auf dem Deckel, 45 ° von der Mitte (Abbildung 3) und trocknen lassen für 30 min. Schließen Sie die Fächer und lassen O / N bei RT.
  5. Unterdessen bereiten die SCS-8 E. coli-Kultur für den nächsten Tag. Von einem der zwei 250-ml-Kolben * (Schritt 3.1.3), nehmen 5 ml Brühe NZY (Tabelle 3) und Transfer zu einem sterilen 14 ml Röhre. Supplement mit 62,5 ul von Maltose / MgSO 4-Lösung und fügen Sie 10 ul der SCS-8 E. coli Glycerin Lager. Inkubieren bei 37 ° C für 3-4 Stunden unter Schütteln bei 250-300 UpM. Verwenden 15 ul dieser Kultur zu 95 ml NZY-Brühe bei 37 º C zu impfen (in einem 250 ml-Seitenarm-Kolben), Kultur O / N in einem Schüttelinkubator (250-300 rpm).
    * Hinweis: Die anderen 250-ml-Kolben kann später verwendet werden, um die OD der Kultur, wenn erforderlich (Schritt 4.1)
  6. Nehmen Sie die 1-Liter-Kolben mit Agar (Schritt 3.1.4), und gießen ~ 6-7 ml NZY Agar in 60 mm Schalen (das reicht für ~ 50 Gerichte zum Schritt 8 erforderlich sein). Lassen Agar zu verhärten (~ 10 min), dann invertieren und wickeln in Kunststoff. Diese Gerichte können bei 4 ° C bis zu einem Monat aufbewahrt werden.

4. Herstellung von Tabletts für die E. coli / Phagen-Kultur (Tag 2)

  1. Überprüfen Sie die OD der SCS-8 E. coli-Kultur (Schritt 3.5) auf dem Spektralphotometer.Stellen Sie die OD 600 bis 0,6 mit NZY Brühe (Tabelle 3) (Schritt 3.1.3), und legen Sie die Flasche auf Eis, um das Wachstum zu stoppen und halten auf dem Eis bis zum Gebrauch. Dies wird für die Schritte 6.3 und 8.2 eingesetzt werden. Diese Kultur kann für 5 Tage bei 4 ° C aufbewahrt werden
  2. Alle Air-Assay Schalen trocknen (goss den Vortag) für ca. 5 Stunden (Abbildung 3).

5. Verpackung von genomischer DNA (Tag 2, Fortsetzung)

  1. Nehmen Sie die erforderliche Anzahl von Orange Trans Rohre aus dem -80 ° C Gefrierschrank und legen Sie sie auf Trockeneis bis zum Gebrauch, nehmen Sie eine Orange Transrohr für jede Verpackungsreaktion durchgeführt werden. Beschriften Sie jedes Rohr entsprechend. Haben die genomischen DNA-Proben (Schritt 2.9) bereit, auf Eis.
  2. Dieser Schritt sollte ein Rohr zu dem Zeitpunkt durchgeführt werden. Beenden Sie die komplette Schritt, bevor Sie mit der nächsten DNA-Probe. Auftauen orange Rohr * Anmerkung 1 schnell: mit den Fingern, bis der größte Teil davon wird aufgetaut, dann legteauf Eis. Nehmen Sie die entsprechenden genomischen DNA-Probe und sofort übertragen 8-12 ul-Probe * Note 2,3 auf die orange Rohr. Mischen Sie den Inhalt durch vorsichtiges Auf-und Abpipettieren 3x, als auch durch leichtes Antippen des Röhrchens mit dem Finger. Versuchen Sie nicht, Blasen einzuführen beim Mischen. Das Röhrchen wird in ein 30 º C Wasserbad für 90 min.
    * Hinweis 1: eine schnelle Runde in einer Mikro kann notwendig sein, alle Inhalte von den Innenwänden und den Deckel zu sammeln.
    * Anmerkung 2: Volumen der zugegebenen Probe hängt von der Anzahl von Zellen verwendet, um das Sample zu erzeugen: 11-12 ul Proben von 2,0 bis 5,0 x 10 5 Zellen präpariert, 10 &mgr; l von 1,0 × 10 6-Zellen-Muster, und 8 ul von 1,5 x 10 6 Zellen-Proben.
    * Anmerkung 3: Die DNA ist immer noch sehr zähflüssig, um die DNA zu nehmen, drücken Sie die Pipettenspitze auf den Boden des Probenröhrchens und vorsichtig drehen die Spitze um gegen die Innenwand des Rohres.
  3. Nehmen Sie 1 oder 2 blaue Trans tubes * die -80 ° C-Gefrierschrank und legen Sie sie auf Trockeneis bis zur weiteren Verwendung. Thaw sie schnell und über 12 ul zu jedem der Orange Röhren. Mischen Sie die Lösung durch vorsichtiges Pipettieren es nach oben und unten 3 mal. Drehen Sie das Rohr nach unten für 2-3 sec, tippen Sie dann auf das Rohr mit dem Finger für weitere Misch-und sofort wieder an die 30 ° C Wasserbad für weitere 90 min.
    * Hinweis: Verwenden Sie ein blaue Röhre für 5-6 Reaktionen und 2 blaue Rohre für 10-12 Reaktionen.
  4. Nach 90 min, verdünnen jede Reaktion mit 970 ul SM-Puffer * (Tabelle 3), um die Reaktion und Wirbel auf mittlerer Geschwindigkeit für 5 Sekunden stoppen. Setzen Röhrchen auf Eis bis zur weiteren Verwendung.
    * Hinweis: Wenn die Anzahl der Zellen ist ≤ 5 x 10 5, verwendet 500 &mgr; l SM-Puffer (Tabelle 3), um die Reaktion zu stoppen; 2 Röhren (der gleichen Probe) kann dann später (Schritt 6.4) kombiniert werden.

6. Galvanik Verpackt Genomische DNA (Tag 2, Fortsetzung)

  1. Schließen Sie den umgekehrten Agar tStrahlen, die zum Trocknen in den Morgen geöffnet wurden. Beschriften Sie die Fächer für jede Probe.
  2. Man löst 4,8 g X-Gal in 16,8 ml N, N-Dimethylformamid (für Schritt 6.5 erforderlich). Rühren Sie sofort und legte auf einem Schüttler-Plattform. Schutz vor Licht. Lösung sollte in 20-30 Minuten klar sein.
  3. Aliquoter Teil, der SCS-8 E. coli-Zellen. Für jede Gruppe von Schalen * Verwenden Sie eine 50 ml konischen Röhrchen. Das Röhrchen mit dem Namen der verpackten DNA-Probe. 2 ml E. coli-Suspension für jedes Fach.
    * Hinweis: Zum Beispiel 3 x 10 5 GVP erfordert eine Reihe von 8 Böden (siehe Tabelle 1). Somit werden zwei Aliquote, erfordern 8 x 2 = 16 Böden. Halten Sie die Teilmengen zu trennen und so bereiten zwei 50-ml-Röhrchen mit je 8 x 2 = 16 ml E. coli-Suspension.
  4. Fügen Sie die 1 ml * von verpackten DNA-Probe (aus Schritt 5.4) in die entsprechende 50-ml-Röhrchen mit dem SCS-8 E. coli aliquoten und gut mischen. Inkubieren diesem E. coli / Phagen-Gemisch in einem Schütteln incuBator (250-300 rpm) bei 37 ° C für 23 min.
    * Hinweis: Die DNA wurde von ≤ 5 x 10 5 Zellen extrahiert wurden 500 ul SM-Puffer verwendet, um die Reaktion (Schritt 5,4) zu stoppen. Bei diesem Schritt können die Röhrchen vereinigt und auf einem 50 ml konischen Röhrchen zugegeben werden.
  5. Wenn das E. coli / Phagen-Gemisch inkubiert, beginnen die Vorbereitungen für die Top-Agarose-Schicht. 5 ml X-gal / N, N-Dimethylformamid-Lösung (Schritt 6.2), um pro 800 ml-Kolben, der Deckschicht Agarose-Lösung (aus Schritt 3.1.2; bei 50 ° C gehalten). Endkonzentration von X-gal wird 1,5 mg / ml. Die X-Gal vielleicht ein wenig zu fällen, wenn sie der Agarose aufgenommen. Wirbel um die X-gal zu lösen und stellte die Flasche zurück in den 50 ° C warmen Wasserbad.
  6. Nehmen Sie die E. coli / Phagen-Gemisch aus dem Brutschrank (Schritt 6.4). Jede Probe erfordert mehrere Fächer, jedes Fach, erfordert 50 ml X-gal/agarose Lösung (Schritt 6.5). Gießen Sie das erforderliche Volumen der X-gal/agarose für jede Probe (dh 50 ml xAnzahl der Böden) in einem größeren sterilen Plastikflasche und fügen Sie die entsprechende E. coli / Phagen-Gemisch. Schwenken Sie die Flasche zu mischen. Teilen Sie die Mischung in Aliquots von 45-50 ml in 50 ml konischen Röhrchen. Die Anzahl der Rohre sollte die gleiche wie die Anzahl der Fächer für die Probe erforderlich ist.
    Hinweis: Die übrig gebliebenen X-gal/agarose Lösung wird in Schritt 8.3 verwendet werden. Die Lösung kann in einem 50 ° C Wasserbad bis zur weiteren Verwendung gelagert werden.
  7. Gießen Sie die 50 ml Top-Agarose-Gemisch in der unteren Hälfte des Assays Fach. Verbreitete sich schnell die Agarose durch Kippen des Testmagazin leicht in eine Richtung.
    Hinweis: Die Agarose wird sehr schnell abkühlen und wird es unmöglich, über den Boden verteilt. Daher muss dieser Schritt relativ schnell und mit Agarose, die bei 50 ° C gehalten wurde, durchgeführt werden
  8. Ermöglichen die Top-Agarose für mindestens 15 min zu härten. Dann umdrehen und öffnen Sie die Assay-Schalen, um sie an der Luft trocknen für 30 min (Abbildung 3) zu lassen. Schließen Sie die Fächer, Inkubation der Testschalen umgekehrt (unten Agar Schichtseite nach oben) bei 37 ° C für 15-16 Std. Stapeln Sie nicht mehr als 5 Fächer.

7. Die Bestimmung einer mutmaßlichen Mutant Frequenz (Tag 3)

  1. Entfernen Sie die Schalen von der 37 ° C-Inkubator und lassen Sie sie abkühlen. Zählen Sie die schein Plaque-bildenden Einheiten (PFU) auf jedem Boden, zufällig auswählen 2 Seiten auf den Böden, zeichnen Sie ein Quadrat * von 2,5 x 2,5 cm 2 oder 5 x 5 cm 2 und zählen Sie die PFUs in jedem Quadrat mit einer Markierung Zellzähler (4A, B).
    * Hinweis: Zu zeichnen ist das Quadrat Verwendung einer Vorrichtung, wie in Abbildung 5 dargestellt. Wenn die Anzahl der gezählten PFUs ≥ 40 ist, verwenden Sie den kleineren Platz, ansonsten verwenden Sie die größere.
  2. Der Mittelwert der Quadrate gezählt und multiplizieren mit 96 zu zählen, wenn mit einem kleineren Quadrat, oder multiplizieren Sie diese Zahl mit 24, wenn Zählung mit der großen. Fügen Sie die Anzahl der gezählten PFUs für alle Fächer von der samich probieren. Dies ist die Gesamtzahl der PFU für diese Probe erzeugt.
  3. Weiter zählen die mutierten Plaques in jedem Fach. Die Schalen haben nun abgekühlt, die dabei helfen, die mutierten Plaques finden wird. Um weiter zu erleichtern das Auffinden des blauen Plaques, bewegen Sie das Tablett über einen roten und / oder weißen Oberfläche, Blätter von roten und weißen Papier gut funktionieren. Kreisen Sie jede blaue Plakette mit einem Marker-Stift. Nehmen Sie die Form und die Intensität der blauen Farbe der jede Mutante (zB Voll-, Kreis-, Sektor-, 4C) 36,37.
  4. Bestimmung der mutmaßlichen Mutationsrate für jede Probe durch Dividieren der Anzahl der Mutanten PFU (Schritt 7.3) von der Gesamtzahl der PFU (Schritt 7.2).

8. Überprüfung der mutmaßlichen Mutant Plaques (Tag 3-5)

  1. Mit einer Pasteurpipette Kern jeder Mutante (blau) PFU und übertragen Sie den Stecker in 250 ul sterilem SM-Puffer (Tabelle 3). In 25 ul Chloroform, Vortex für 5 Sekunden eind bei 4 ° C bis am nächsten Tag fortzusetzen oder für 2 h bei RT, bevor Sie mit dem nächsten Schritt, um sicherzustellen, dass die Mutante PFU ist in der Tat eine Mutante. Die Proben können bei 4 ° C für mindestens 1 Jahr gelagert werden.
  2. Beschriften Sie ein 1 ml und 4 ml einer sterilen Röhrchen für jede Mutante, die eingesteckt wurde. In der neuen 1-ml-Tube, verdünnen das resuspendiert Phagen aus dem Agar-Stecker (Schritt 8.1) 01.50 Uhr in sterilen SM-Puffer (2 ul Probe in 100 ul SM-Puffer (Tabelle 3)), Vortex kurz beiseite veröffentlicht. Zu den 4 ml sterilen Röhrchen mit 200 ul SCS-8 E. coli-Kultur (aus Stufe 4.1) und 2 ul der verdünnten Phagen aus der entsprechenden 1-ml-Röhrchen, bei 37 ° C für 5-10 min.
  3. Fügen Sie 2,5 ml der Top-Agarose, die X-gal (links-ab Schritt 6.6) zu je 4 ml Tube, Wirbelrohr zu mischen und auf eine 60-mm-NZY Agar-Platte gießen zuvor gegossen (Schritt 3.6). Lassen Sie für 10 min (zu lassen ter Top-Agarose erstarren), invertieren die Schüssel und Inkubation O / N bei 37 ° C
  4. Am nächsten Morgen wird die Schale aus dem Inkubator und bestimmen den Blauanteil PFUs auf jeder Schale (Abbildung 6). Wenn 70% oder mehr der PFUs blau sind, wird eine Mutante als bestätigt, 38,39. Kern die Mutante Plaque von der Schale und in ein 1,5 ml-schrauben Oberrohr, mit 250 ul SM-Puffer (Tabelle 3) und 25 ul Chloroform, es ist jetzt bereit für die Sequenzierung.
  5. Wenn 50% oder weniger der PFU ist blau, ist es nicht als eine echte Mutante 38,39. Wenn die Frequenz der blauen PFUs liegt zwischen 60-70%, prüfen Sie mit zurück in den Erläuterungen über die Form der Plaque, wenn die Form der PFU war "voll", fahren Sie mit Sequenzierung.

9. Sequenzierung für Mutationen im LacI G ene

  1. Richten Sie PCR-Reaktionen in einem 25 ul Reaktionsvolumen, einschließlich 1,5 μ, L Überstand von Plaque (Schablone, Schritt 8.4), der Vorwärtsprimer SF1 (5'-GGAAACGCCTGGTATCTT-3 ') und der reverse Primer SR2 (5'-GCCAGTGAATCCGTAATCA-3'). Verwenden der PCR-Verlängerungs Taq-Polymerase-Kit nach den Anweisungen des Herstellers. Die Zyklusbedingungen sind wie folgt: 94 ° C für 2 min, dann 35 Zyklen von 94 ° C für 20 sec, 60 ° C für 20 sec, 72 ° C für 2 min, mit einem abschließenden Schritt von 72 ° C für 5 min, gefolgt .
  2. Nehmen Sie ein 5 ul Aliquot jeder Reaktion und auf einem 0,8% Agarose-Gel laufen gelassen, um eine Verstärkung zu bestätigen.
  3. Bereinigen Sie die PCR-Reaktionen mit den Aufräumarbeiten Augencourt Kit nach den Anweisungen des Herstellers.
  4. Quantifizieren Template-DNA.
  5. Verwenden Sie ~ 100 ng PCR-Produkt als Template-DNA für die Sequenzierung. Sequenz Amplikons in beiden Richtungen unter Verwendung der gleichen PCR-Primer wie Sequenzierprimer (siehe oben).
  6. Montieren Sequenzen und richten mit der Referenzsequenz LacI 40 bis Mutati erkennenons.

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Representative Results

Die in vivo-Mutagenese-Assay misst eine seltene Ereignis (Mutante PFUs) unter vielen Ereignissen (alle PFUs). Durch Durchführen des Assays mit einer kleinen Anzahl von Zellen ist es möglich, dass das Ergebnis erheblich falsch-positive und falsch-negative Ergebnisse beeinflusst. Um dieses Problem zu adressieren wir führten eine serielle Verdünnungsexperiment mit unfraktioniertem Knochenmarkzellen, aus drei verschiedenen Tieren geerntet. Wir maßen die Mutationsrate in dem Knochenmark der Tiere mit 1,4 × 10 6, 7,0 × 10 5, 3,5 × 10 5 und 1,75 × 10 5 Zellen. Die Ergebnisse (7) zeigen eine lineare Beziehung zwischen der Eingangszellennummer und der Anzahl der PFU erzeugt. Wichtig ist, dass die Mutationsrate konsistent, auch mit niedrigen oder hohen Anzahl von Zellen gemessen. Obwohl nicht direkt (aufgrund des Mangels an Zellen) getestet, es gibt keinen Grund zu glauben, dass dies nicht der Fall LSKS und GMP.

t "> Der wichtigste Schritt in diese Mutagenese-Assay ist die Isolierung von genomischer DNA (Schritt 2). Obwohl die DNA-Konzentration sollte idealerweise auf ≥ 500 ng / ul, dieses Protokoll funktioniert gut mit 40-150 ng / ul. Wichtiger ist die 260/280 Verhältnis (dies sollte> 1,8 bis 2,0 sein), und das Molekulargewicht (sollte um 300-500 kb sein). Es wird empfohlen, wenn man nicht mit dem Test vertraut, die Qualität und die Größe der isolierten DNA überprüfen . Fig. 8 zeigt ein Beispiel eines elektrophoretischen Durchlauf von hochmolekularer DNA.

Die Markierungen der einzelnen PFUs auf einem in 4B gezeigt Tablett stellen eine sinnvolle und erreichbare Dichte der Plaques, wenn man mit einer kleinen Anzahl von gereinigten Zellen beginnt, ein Tablett sollte zwischen 40-150 PFUs / kleinen Platz zu halten. In diesem speziellen Experiment, das kleine Quadrat in 4B enthält 103 Plaques. Die andere Quadrat auf der Schale, in der oberen Ecke der Fig. 4A gezeigt 41, weil wir etwas kleiner Schalen und 12.000 PFUs auf diesen Schalen erlaubte uns nicht, eine gute Unterscheidung zwischen einzelnen Plaques.

4C zeigt Beispiele der verschiedenen Arten von blauen Plaques, die beobachtet werden können. Bei den LACI-Mutagenese-Assay wird die Morphologie der Plaques (dh vollständige, Sektor oder Kreis) ist ein Hinweis auf die Herkunft der Mutation; voll ist eine Mutation von Maus stammen, während die beiden anderen sind wahrscheinlich in E. erzeugten coli 36,37. Nach Replattierung (siehe ALSo Abbildung 6), die fast alle "voll" Plaques reproduzieren> 70% blaue Plaques wieder, während nur ein sehr kleiner Teil der Sektor Plaques zu tun und nahezu keine der oft kleiner, kreisförmige Plaques.

Tabelle 2 zeigt die Reproduzierbarkeit der Plaquebildung bei relativ kleinen Anzahl von gereinigten Zellen im Vergleich zu der mit einer hohen Zahl von Knochenmarkszellen (demselben Pool von Zellen, wobei die Zellen aus sortierten) und Milzzellen.

Mutant PFUs bestätigt werden, zunächst durch Neubelegung (Abbildung 6 zeigt repräsentative Beispiele von Gerichten zur Bestätigung der primären Mutante (blau) PFU) und zweitens, durch Sequenzierung. Die Gerichte in 6, die> 70% blau PFUs (unten zwei) bestätigen, dass die Mutante entstand in der Maus (und nicht in der E. coli). , Die linke obere Schale zeigt jedoch keine blauen PFUs und daher sollte die primäre PFU nicht als gezählt werden Mutante und sequencing ist nicht erforderlich. Die rechte Schale zeigt ~ 65% blau PFUs. Je nach der Form des primären Plaques, wird diese Probe für die Sequenzierung gesendet (siehe Schritt 8.4). Nur wenn eine DNA-Mutation durch Sequenzierung bestätigt werden, wird dies als PFU Mutante gezählt werden. Wenn Sie sich unsicher über die Form der PFU, Reihenfolge!

Figur 1
Abbildung 1. Sca-1-Färbung auf Knochenmarkszellen aus Wildtyp-Mäusen C57BL6 (B6), transgene Mäuse LacI (LacI) und die Nachkommen einer Kreuzung zwischen diesen beiden (B6 x LacI). Knochenmarkzellen von B6 Mäuse exprimieren Sca- 1 auf ihrer Zelloberfläche und diese Eigenschaft wird verwendet, um Stamm-und Vorläuferzellen zu reinigen. Transgene Mäuse auf einem LacI B6 Hintergrund jedoch nicht exprimieren Sca-1; diese Markierung muß wh verloren habenile Gründung der Kolonie. Um Sca-1 in transgenen Mäusen LacI wieder einzuführen, wurden diese Mäuse mit normalen B6-Mäusen gekreuzt.

Figur 2
Abbildung 2. DNA Dialysesystem. Drei Membranen hält einen viskosen DNA-Lösung in der Mitte (blau gefärbt zur besseren Visualisierung) auf TE-Puffer schweben. Die roten Pfeile zeigen kleine Einkerbungen in der Membran, die zur Identifizierung der Proben verwendet werden.

Fig. 3
Abbildung 3. Effiziente Möglichkeit, 60 oder mehr Agar / Agarose, die Schalen trocknen.

gether.within-page = "always"> Fig. 4
4. Nachweis von Plaque-bildenden Einheiten (PFU). Dargestellt sind (von Teilen) groß Agar Platten (in Fig. 3 dargestellt) mit primären Kolonien von Phagen-infizierten E. coli. (A) Dargestellt ist eine ganze Platte mit 2 kleinen Quadrate auf sie zu zählen Plaques gezogen. Die rote Einsatz in (B) vergrößert dargestellt. (B) Die einzelnen schwarzen Marker Punkt zeigt eine klare Wildtyp PFU in der Agar-Platte (103 insgesamt). (C) Verschiedene Formen von potenziell Mutante PFUs. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

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Abbildung 5. Plexiglas Zählen Plätzen. Dargestellt sind eine kleine und große Zählen Platz. Die Innenmaße des großen Platzes sind 5 cm x 5 cm, die von dem kleinen Platz von 2,5 cm x 2,5 cm.

Fig. 6
Abbildung 6. Bestätigung der Mutante Plaque-bildenden Einheiten (PFU). Dargestellt sind vier kleine Gerichte geimpft am Tag zuvor mit einem Verdünnungsmittel von einem blauen PFU. Die linke obere Schale zeigt keine blauen PFUs. Die obere rechte Schale zeigt ~ 65% blau PFUs. Die beiden unteren Böden zeigen 80-90% PFUs blau (links) und 100% Blau PFUs (rechts). Die roten Pfeile zeigen klar (Wildtyp) PFUs.

Wieder 7 "fo: content-width =" 4in "fo: src =" / files/ftp_upload/50752/50752fig7highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50752/50752fig7.jpg "/>
Abbildung 7. Mutant Frequenz in unfraktioniertem Knochenmark. Dargestellt sind (A) die Anzahl der PFUs, (B) die Anzahl der Mutanten und (C) die Mutationsrate in drei verschiedenen Tieren (24-26 Monate alt) gemessen, die vertreten sind, durch verschiedene Farben. Für jede Maus wurden die Messungen an vier verschiedenen Stichproben durchgeführt: 1,4 x 10 6, 7,0 × 10 5, 3,5 × 10 5 und 1,75 × 10 5 Zellen. Die Daten zeigen, dass in diesem Bereich von Zellen, Stichprobengröße nicht signifikant Mutante Frequenzmessungen beeinflussen.

Fig. 8
FeigeAbbildung 8. Pulsed-field-Elektrophorese von hochmolekularen DNA-Proben von gereinigten Zellen isoliert. Genomische DNA wurde wie in Schritt 2 des Protokolls beschrieben isoliert und auf einem Bio-Rad (CHEF-DR III) System laufen. Die verschiedenen Proben auf das Gel geladen sind DNA-Proben von Leber isoliert (Li, Spur 1), Knochenmarkzellen von reifen Linie +-Zellen aufgebraucht (LB; Bahnen 2 und 14), CD34 +-Zellen LSK (L; Spur 6), CMPs (Spuren 7-9), GVP (Spuren 11 und 12) und Sca-1 +-Zellen (S, Spur 15). Lane 4 hält die Leiter für hochmolekularer DNA. Das Bild zeigt, dass die Mehrheit der DNA mit hohem Molekulargewicht (> 600 kb).

Tabelle 1. Verschiedene Parameter der Probe gereinigt Populationen Gesamtknochenmark und Milz. Verwenden Sie diese Tabelle, wo im Protokoll angegeben. Zum oben angegebenen jede Population, die Anzahl der Zellen (x 10 5) pro Aliquot DNA-Digestionszeit, Volumen der DNA-Probe,Nach der Dialyse werden die Anzahl von Reaktionen für jedes Aliquot und Anzahl der Schalen pro Aliquot erforderlich erforderlich auf der linken Seite angegeben. Die Aufschlusszeiten bei 50 ° C sind für den Erfolg des Experiments.

Tabelle 1

LSK = Lin - Sca-1 + Kit + +-Zellen; CMP = engagierte myeloischen Vorläufer; GMP = Granulozyten / Monozyten-Vorläufer; WBM = (unsortiert) Gesamtknochenmark. Milz-Zellen werden unsortiert.

Tabelle 2. Effizienz der Plaquebildung ist bei verschiedenen Zellpopulationen vergleichbar. Diese Tabelle zeigt die Bildung von Plaque innerhalb der verschiedenen Populationen. Sechs Monate alte C57BL / 6 Mäuse wurden für diese Experimente (Oberschenkelknochen und Schienbein von 10-11 Mäuse pro Experiment 6 Versuche insgesamt) verwendet. Alle außer einem der in diesen Experimenten verwendet ga Populationenve mindestens 1, bis zu 24, (bestätigt)-Mutante PFUs (Zhou et al., Manuskript in Vorbereitung). PFU Nummern können pro Mausstamm variieren.

Tabelle 2

LSK = Lin - Sca-1 + Kit + +-Zellen; CMP = engagierte myeloischen Vorläufer; GMP = Granulozyten / Monozyten-Vorläufer; WBM = (unsortiert) Gesamtknochenmark * Milzzellen unsortiert sind.. SD = Standardabweichung.

Tabelle 3. Anleitung für die Vorbereitung der zusätzlichen Reagenzien.

Tabelle 3

§ Von der Stratagene Bedienungsanleitung der RecoverEase DNA Isolation Kit

¶ Bedienungsanleitung der Verpackung Extract Trans

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Discussion

Die hierin beschriebenen in-vivo-Mutagenese-Assay basiert auf der ursprünglich von 18 Dieses Modell verwendet einen λ-Phagenvektor, der eine lac-Reportergens Kohler et al. Erzeugt LacI transgenen Mausmodell. Die beiden cos-Stellen flankieren die Vektor ermöglichen eine relativ einfache Rückgewinnung und anschließende Verpackung in infektiöse Phagenpartikel, verwendet, um E. infizieren coli. Eine blaue Plakette wird durch Phagen-infizierten E. erzeugt werden coli, die ein mutiertes Gen LacI enthalten. Die blaue Plakette gegen einen farblosen Hintergrund gesetzt, damit die Aufgabe der Mutante Scoring erheblich vereinfacht. DNA-Sequenzierungstechniken können verwendet werden, um die Position und die Art der Mutation, der aufgetreten ist, die weitere Untersuchungen zu den Mechanismen, die Mutagenese helfen können, zu identifizieren.

Die Modifikationen man dem Protokoll dieser Mutagenese-Assay hergestellt erlauben es, mit FACS-gereinigte hematopoie verwendentic-Zell-Populationen. Wir fanden jedoch, dass eine reproduzierbare Analyse noch mindestens 2 x 10 5 hämatopoetischen Zellen benötigt, um ausreichende Mengen an hochwertigem DNA zu gewährleisten. Da die Frequenz der langfristigen Bestandsauffüllung HSK extrem niedrig ist 29, die Durchführung eines Mutagenese-Analyse auf diesen HSK ist an dieser Stelle nicht erreichbar. Die Stammzell-angereichertem Bevölkerung, die wir in diesem Protokoll LSK-Zellen, die neben Flk-2 - langfristige Bestandsauffüllung HSK, auch Flk-2 - Kurzzeit-und Bestandsauffüllung HSK Flk-2 +-Zellen, die multiVorläufer stellen Zellen (MPP) 42. Trotz dieser Einschränkung fühlen wir uns, dass mit LSK-Zellen als Auslese für HSK-Mutagenese in diesem Test ist sinnvoll, da es sich gezeigt, dass LSK Zellen verhalten sich mehr wie LSK-Flk-2 - HSK im Hinblick auf die Verwendung NHEJ als Vorläuferzellen 5. Darüber hinaus, Arbeit von Rossi et al. 8 schlägt vor, dass der MPP besser in Kopieren mit damaged DNA als HSK, besonders wenn sie älter werden, führt uns zu der Hypothese, dass die Anzahl der Mutanten in der Bevölkerung gefunden LSK spiegelt wider, dass der HSK statt der MPP.

Da eine kleine Anzahl von sortierten Zellen werden zu jedem Versuch erhalten, ein wichtiges Thema bei der Planung dieser in vivo-Mutagenese-Assay zu betrachten, ist die Stichprobengröße (dh der Gesamtzahl der Plaques pro Probe) notwendig, um eine statistische Signifikanz zu erreichen. In anderen Worten, wenn das Ziel ist, zum Beispiel, zu vergleichen, die Mutationsfrequenz von manipulierten LSK Zellen mit Wildtyp-Kontrolle LSK Zellen, wie viele Plaques sind insgesamt für jeden LSK Population erforderlich, um eine zwei-oder dreifache Differenz in erfassen Mutationsfrequenz? Zu beachten ist, kann die Gesamtzahl von Plaques von allen Experimenten kombiniert werden, da wir keinen signifikanten Unterschied zwischen Sortierversuche zumindest in Wildtyp-Zellen, die auf einer negativen binomialen Regressionsanalyse 43. Plaque numMitglieder sind wichtig zu wissen, denn das wird die Zahl der Arten, die (für die WBM und GVP für Milz, LSKS und CMPs ~ 10.000 ~ 7.000) durchgeführt werden müssen, zu bestimmen. Da die Mutationshäufigkeiten sind klein in Wildtyp-Gewebe 44, die normale Annäherung statistisch Vergleich dieser ist nicht korrekt. Aus diesem Grund verwenden wir die Poisson-Verteilung, da sie in etwa der wahren Binomialverteilung (von der Mutationsfrequenz), wenn diese Frequenz ist klein und die Stichprobengröße relativ groß ist; Huffman-45 bietet eine Formel (Gleichung 4) Stichprobengröße berechnen auf Basis auf Poisson-Verteilung. Wenn auf hypothetische Mutation Frequenzen von 2,5, 4, und 7 Mutationen pro 100.000 Zellen in den Kontrollzellen 44 angelegt, benötigen wir 456.949 Seuchen, 285592 und 163196 jeweils eine signifikante zweifache Differenz (zwei Probe-Test mit zwei tailed Bedeutung erkennen von 0,05 und Macht 0,80). Weniger Plaques erforderlich sind, um eine dreifache erkennenUnterschied: 122148; 76342 und 43624 auf. Somit kann die Anzahl der Plaques für jede Population von Interesse (und damit die Anzahl der möglichen erforderlich, um genügend Zellen zu erhalten), ist abhängig von der Mutationsfrequenz, die in der Kontrollzellpopulation und der vorhergesagten fold change im Vergleichspopulation zu erwarten sind.

Der wichtigste Schritt in dieser Mutagenese-Assay ist die Isolierung von genomischer DNA (Schritt 2). Zwar ist es wichtig, dieses Protokoll mit hoher Qualität DNA-Proben zu starten (siehe "repräsentative Ergebnisse"), bei der Arbeit mit sortierten Zellen, Zellzahlen sind oft begrenzt und kann nicht auf Bestimmung der DNA-Konzentration oder Größe verschwendet werden. Wir fanden, dass ein weiterer guter Indikator für die Qualität der DNA-Probe ist seine Viskosität, bei Schritt 2.9 sollte die Probe extrem zähflüssig und schwer, mit zu arbeiten. Es erfordert einige Übung, um diesen Schritt richtig zu machen. Daher empfiehlt es sich, mit großen Zellzahlen, z. B. erarbeiten das Protokoll mit ganzen Knochenmark oder sortiert Sca-1 +-Zellen, und sich bequem mit Isolierung von DNA aus diesen Proben und lernen, wie man die Qualität der DNA durch seine Viskosität zu beurteilen.

Die Qualität und die Größe der DNA beeinflusst die Anzahl der PFUs erzeugt. Wenn die DNA-Isolierung Schritt perfektioniert, ist der nächste wichtige Element der Optimierung der Assay die Dichte PFU pro Platte. Tabelle 1 zeigt die empfohlene Anzahl von Schalen für jeden Probentyp entspricht, um eine optimale Anzahl von Zellen für diese Probe verwendet. Mit dieser Leitlinie sollte in Trays, wo einzelne Plaques noch unterschieden werden, aber nicht zu dünn verteilt führen. Ein Tablett sollte zwischen 40 bis 120 pro PFUs kleinen Platz zu halten, die in 4B gezeigt Beispiel stellt eine angemessene Dichte. Wobei diese Optimierungsaspekte arbeitet, ist die Anzahl der PFU pro Probe erzeugten hocheffiziente und reproduzierbar (Tabelle 2).

"> LacI transgenen Mausmodell mit einer Vielzahl von anderen Geweben verwendet worden, aber nicht in Verbindung mit einer relativ kleinen Anzahl von hoch gereinigten Populationen. Wenn zum anderen aufgebracht (als hämatopoetische) Gewebe beschränkt Stammzellen angereicherte Populationen, wird empfohlen auf besondere Aufmerksamkeit auf die DNA-Isolationsverfahren zahlen;. können sie von Zelltyp zu Zelltyp unterscheiden und die Empfehlung für die hämatopoetischen Zellen nicht unbedingt für andere Gewebezelltypen arbeiten Die kritischen Faktoren, wie der Menge der Reagenzien, der Temperatur, bei der die Proteinase K Verdauung stattfinden muss und, was am wichtigsten ist, werden die Proteinase K Verdauung brauchen Zeit für jeden Zelltyp ausgearbeitet werden, das Protokoll kann als Ausgangspunkt dienen.

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Disclosures

Die Autoren erklären, keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Acknowledgments

Wir möchten David R. Rodriguez, MA für die Grafik-Design und Fotografie in diesem Manuskript danken. Diese Arbeit wurde durch Mittel aus dem GCCRI, dem NIH / NIA (5R21AG033339) und dem Cancer Center Support Grant (P30CA054174) an die UTHSCSA Durchflusszytometrie Core-Anlage und der UTHSCSA Erweiterte Nucleic Acids Core Facility unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LacI transgenic mice  BioReliance Corporation
RecoverEase DNA Isolation Kit, including the RNace-It ribonuclease cocktail Agilent Technologies (Stratagene) 720202
Transpack Packaging Extract, including the orange and blue transpack tubes and the SCS-8 E. coli Agilent Technologies (Stratagene) 200221
DNA size standards – lambda ladder Bio Rad 170-3635
0.025 mM Pore size membranes  Fisher (Millipore) VSWP 025 00
245 mm2 Bioassay dishes (trays)  Fisher (Corning) 07-200-600
NZY broth (powder) Fisher (Teknova) N1144
Agar Fisher BP1423-500
Agarose Fisher E-3120-500
N,N-Dimethylformamide Fisher AC34843-5000
X-gal Research Products Intl Corp (RPI) B71800-10.0
Proteinase K Roche 3-115-852
PCR Extender Taq Polimerase kit 5 PRIME 2200500
Agencourt AMPure XP cleanup kit Beckman/Coulter A63880

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Infektion , hämatopoetischen Stammzellen / Vorläuferzellen, DNA-Mutationen,
Identifizierung von DNA-Mutationen in hämatopoetischen Stammzellen Gereinigtes / Vorläuferzellen
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Cheng, Z., Zhou, T., Merchant, A., Prihoda, T. J., Wickes, B. L., Xu, G., Walter, C. A., Rebel, V. I. Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (84), e50752, doi:10.3791/50752 (2014).

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