La identificación de mutaciones del ADN en Purificada hematopoyéticas células madre / progenitoras

Summary

Aquí se describe un ensayo in vivo mutagénesis por un pequeño número de células hematopoyéticas purificadas utilizando el modelo de ratón transgénico LacI. El gen LacI puede ser aislado para determinar la frecuencia, la ubicación y tipo de mutantes de ADN espontáneamente surgido o después de la exposición a genotoxinas.

Abstract

En los últimos años, se ha hecho evidente que la inestabilidad genómica está estrechamente relacionada con muchos trastornos del desarrollo, cáncer y envejecimiento. Dado que las células madre son responsables de asegurar la homeostasis del tejido y la reparación durante toda la vida, es razonable plantear la hipótesis de que la población de células madre es crítico para la preservación de la integridad genómica de tejidos. Por lo tanto, un interés significativo se ha producido en la evaluación del impacto de los factores endógenos y ambientales sobre la integridad genómica en las células madre y su progenie, con el objetivo de comprender la etiología de las enfermedades basados ​​en células madre.

Ratones transgénicos LacI llevan un vector de fago λ recuperable que codifica el sistema reportero de LacI, en el que el gen LacI sirve como reportero de la mutación. El resultado de un gen mutado LacI es la producción de β-galactosidasa que escinde un sustrato cromogénico, convirtiéndose azul. El sistema indicador LacI es i llevado an todas las células, incluyendo las células madre / progenitoras y pueden ser fácilmente recuperados y utilizados para infectar posteriormente E. coli. Después de la incubación de E. infectada coli en agarosa que contiene el sustrato correcto, las placas se puede marcar; placas azules indican un gen mutante LacI, mientras que las placas claras puerto de tipo salvaje. La frecuencia de azul (entre claras) placas indica la frecuencia de mutantes en la población original de células se extrajo el ADN de. La secuenciación del gen mutante LacI mostrará la ubicación de las mutaciones en el gen y el tipo de mutación.

El modelo de ratón transgénico LacI es bien conocido por ser un ensayo in vivo de mutagénesis in. Por otra parte, los ratones y los reactivos para el ensayo están disponibles comercialmente. A continuación se describe en detalle la forma en este modelo puede ser adaptado para medir la frecuencia de mutantes de ADN que ocurre de forma espontánea en el tallo enriquecida con células Lin ^– IL7R ^– Sca-1 ⁺ cKit ^{+ +} (LSCélulas K) y otras subpoblaciones del sistema hematopoyético.

Introduction

En la mayoría de los tejidos, las células diferenciadas tienen una vida útil limitada. Para mantener la integridad funcional,, las células madre específicas de tejido y de larga duración producen continuamente células progenitoras que a su vez dan lugar a las células completamente diferenciadas necesarios para la función de ese tejido particular. Las células madre también reponer su propio compartimento a través de un proceso llamado auto-renovación. Por lo tanto, las células madre son responsables de mantener la integridad funcional del tejido que residen pulg Por lo tanto, es imperativo que están equipadas con mecanismos robustos para detectar y potencialmente reparar el ADN dañado. Si no, se pueden adquirir múltiples perturbaciones genómicos (potencialmente nocivos), que pueden ser heredadas por sus descendientes. La comprensión de cómo las células madre salvaguardar su genoma durante el período de vida de un organismo es una pregunta importante y puede ayudar a entender por qué la inestabilidad genómica está vinculado con el cáncer y otras enfermedades relacionadas con la edad (revisado en ^1,2).

<p clculo = "jove_content"> El control de la integridad genómica de un tejido en el nivel de células madre o poblaciones de células progenitoras tempranas se puede lograr ya sea por la eliminación de vástago defectuosa (o progenitor) células a través de la muerte celular, la senescencia o la diferenciación, y / o por la reparación eficiente ADN de dañado. Estudios recientes han demostrado que es posible medir ciertos tipos de reparación del ADN directamente en estas poblaciones raras ^3-6. Se encontró que, por ejemplo, en el sistema hematopoyético, roturas de doble cadena de ADN se pueden reparar mediante recombinación homóloga (HR) o de extremos no homólogos (NHEJ), siendo este último un proceso de reparación de baja fidelidad y por lo tanto un mayor riesgo de hacer errores. Ambos están siendo utilizados en las células madre hematopoyéticas (HSC) ^{de 4,5,} sin embargo, en ratones parece que es predominantemente de NHEJ en HSCs mientras que las células progenitoras tempranas utilizan HR ^4. Una observación similar se hizo para las células madre de la piel ^6. Curiosamente, en las CMH humano HR, no NHEJ,parece ser el mecanismo de reparación de la opción para la línea se rompe dobles ^3. Si esta diferencia funcional entre las dos especies es real o simplemente representa una diferencia tecnológico o experimental aún está por verse.

Un repertorio de células madre para reparar el ADN dañado es probable que incluya otros mecanismos de reparación del ADN, como la reparación por escisión de base (BER), la reparación por escisión de nucleótidos (NER) y desajuste de reparación (MMR). BER y NER son responsables de la reparación de lesiones únicas o múltiples de pares de bases en el ADN de una sola hebra, mientras que los desajustes correcciones MMR de base-base y los bucles de inserción / deleción; este tipo de daños en el ADN no pueden ser reparados por NHEJ o HR. En apoyo de esta noción son varios estudios del sistema hematopoyético que demuestra una relación entre las alteraciones en una de estas vías y anormalidades en el compartimiento HSC ^7-9, así como un mayor riesgo de desarrollar el síndrome mielodisplásico ^10-16, una enfermedad que se origina en laHSC y que se asocia con el aumento de la inestabilidad genómica conforme avanza la enfermedad ^17. Hasta el momento, no se han reportado mediciones de BER, TNE y MMR directamente en las CMH.

Además de la aclaración de los diversos procesos que controlan la integridad del tejido a un nivel mecanicista, es imperativo que ser capaz de medir la extensión de ADN mutado, de modo que las consecuencias de las aberraciones en uno de estos procesos se pueden probar, por ejemplo, en normal frente genéticamente células madre genéticamente o en viejo y joven. Sin embargo, el desarrollo de un ensayo relevante es difícil debido a la escasez de células madre específicas de tejido y la falta de condiciones de cultivo que conserva "stemness". Además, un ensayo de este tipo debe ser modificable a las manipulaciones ambientales y genéticos. Una posible solución a estas limitaciones y requisitos es el uso de modelos de ratón que se han diseñado específicamente para detectar mutaciones en el ADN.

MulSe han desarrollado modelos de ratones transgénicos ples para la detección de mutaciones. Por ejemplo, LacI ratones transgénicos ¹⁸ llevar un vector de fago λ recuperable que codifica el sistema reportero de LacI, en el que el gen LacI codifica un supresor del operador lac y sirve como reportero de la mutación. Tras la mutación del gen LacI, el operador lac se activa y se produce β-galactosidasa. escinde β-galactosidasa del sustrato cromogénico X-gal (5-bromo-4-cloro-E-indolil-β-D-galactopiranósido), lo que la convierte azul. Los sitios cos que flanquean el vector LacI permite una fácil recuperación de proteínas del fago lambda y la posterior infección de E. coli. Después de la incubación de E. infectada coli en agarosa que contiene el sustrato X-gal, las placas se puede puntuar. Las placas azules contienen un mutante putativo fago Lac-Me realización, mientras que las placas claras albergan los no mutantes. La frecuencia de placas azules (entre ªe las claras) indica la frecuencia de mutantes en la población original de células se extrajo el ADN de. Por otra parte, el fago λ que aloja el objetivo LacI se puede secuenciar fácilmente usando técnicas de PCR para el análisis de relativamente alto rendimiento. La secuenciación de múltiples genes mutantes LacI revelará información importante sobre el espectro de mutaciones, que a su vez puede señalar posibles deficiencias en las vías específicas de reparación del ADN o para eventos genotóxicos específicos. El sistema transgénico LacI se ha estandarizado a través de múltiples laboratorios ¹⁹ y los reactivos están disponibles comercialmente. Una desventaja importante del sistema de LacI es la capacidad limitada para detectar grandes deleciones o reordenamientos, por lo tanto, otros métodos, por ejemplo, peces de múltiples colores en metafase para untar necesitan ser utilizado para complementar esta deficiencia.

Dentro del vector de fago λ del modelo de ratón LacI, hay un gen mucho más pequeño, CII, Disponible para el análisis de mutaciones. Su tamaño y el hecho de que los mutantes se pueden seleccionar hacen de este un ensayo de mano de obra intensiva y más barato menos ²⁰ que el análisis del gen LacI. Sin embargo, el gen LacI se estudia más ampliamente para la mutagénesis ²¹ y la sensibilidad del gen de mutaciones ha sido bien caracterizado de modo que haya una clara comprensión de los residuos de aminoácidos que generan una respuesta fenotípica en un sustrato cromogénico ^22-25.

Otros modelos de ratón para la detección de mutaciones incluyen el uso de la ΦX174 o los transgenes LacZ. El modelo de ratón transgénico ΦX174, con el original: T → G: mutación de reversión C de ensayo ²⁶ o el ensayo de mutación hacia adelante ²⁷ que permite la detección de un espectro de sustituciones de pares de bases, representa un sistema menos costoso que el modelo de LacI. Sin embargo, la pantalla de mutaciones en el ensayo directo no es trivial, y la especificación de la mutaciónTRUM del transgén ΦX174 no está tan bien caracteriza-como la de la LacI. En modelos de ratones que llevan transgenes LacZ, el reportero LacZ mutacional se recupera utilizando E. células huésped de E. coli que son sensibles a la galactosa y medio que contiene galactosa ^28. Un inconveniente de este sistema es que la recuperación de la diana LacZ también implica digestión con endonucleasas de restricción seguido por ligamiento y la electroporación de E. coli acoge, lo que dificulta la adaptación del sistema para un pequeño número de células. Aunque no es un requisito absoluto para el trabajo con poblaciones de células madre / progenitoras (siempre se puede empezar con más ratones), si se requieren grandes cantidades de células (por ejemplo, millones o más) se convertirá rápidamente poco práctico y un costo prohibitivo. Además, el tamaño relativamente grande de LacZ, mientras que proporciona un reportero mutacional sensible, es engorroso y más costoso para el análisis de secuencia de ADN y determminación de los espectros de mutación. Una ventaja importante de este modelo sin embargo, es su capacidad para detectar grandes deleciones e inserciones, así como reordenamientos cromosómicos.

Dado que todas las células en los modelos de ratones transgénicos LacI, LacZ ΦX174 y llevan el sistema reportero, cualquiera de estos modelos de ratón se puede utilizar para medir la mutagénesis en cualquier tipo de célula de interés, incluyendo las células madre y progenitoras, mientras que puedan ser cosechadas de forma fiable y en número suficiente. Porque tuvimos una gran experiencia con el modelo de ratón LacI y el ensayo de mutación LacI, hemos decidido llevar a cabo este sistema aún más para el análisis de mutagénesis en madre hematopoyéticas y las poblaciones progenitoras.

El tejido hematopoyético es bien caracterizado en términos de fenotipo de la superficie celular de sus componentes individuales, incluyendo las células madre de repoblación a largo plazo, que son identificables como la población extremadamente rara de Lin ^– IL7R <sup> – Sca-1 ⁺ cKit ^{+ +} (TSI) / Flk2 ^– CD150 ⁺ CD48 ^– células ^29. . Mohrin et al ⁴ demostraron que la población ligeramente más grande de LSK/Flk2 ^– células son todavía buenos representantes de las HSC y significativamente diferente de las más primitivas progenitoras mieloides comprometidos población (CMP) cuando se trata de estudiar la reparación del ADN. Por otra parte, cuando el TSI enriquecido-HSC (Flk-2 ⁺ y Flk-2 ^-) las células se compararon con los Lin ^– IL7R ^– Sca-1-cKit ^{+ +} (células progenitoras LS-K), todavía había una diferencia significativa en NHEJ capacidad ⁵ entre el menos puro, tallo población TSI enriquecida con células y las células progenitoras. En nuestro estudio utilizamos HSC enriquecido LSK (Flk-2 Flk-2 ⁺ y ^-) de las células, ya que encontramos que se requieren al menos 2 x 10 ⁵ células para obtener resultados consistentes y confiables en este ensayo de mutagénesis, lo que el número de células es extremadamente difícilobtener cuando uno ordena la LSK/Flk2 ^– población CD150 ⁺ CD48 o incluso el LSK/Flk2 ^– población (en términos de los ratones, los costos y practicidad). Este protocolo, basada en la que originalmente desarrollada por Kohler et al. ¹⁸ describe en detalle cómo la frecuencia de mutantes de ADN espontánea puede ser determinada en células LSK y poblaciones de células mieloides diferenciadas, así como células de la médula ósea y del bazo no separada definida.

Protocol

Los leucocitos de LacI ratones transgénicos en un fondo C57BL / 6 no expresan Sca-1 (Figura 1). Por lo tanto, si Sca-1 es un marcador utilizado para la purificación de células, estos ratones tienen que ser cruzado con una cepa apropiada para ganar Sca-1 de expresión, en este protocolo de la F1 de un cruzamiento entre C57BL / 6 (B6) ratones normales y LacI (C57BL / 6) ratones transgénicos (LacI) se utiliza (Figura 1). De las poblaciones de células utiliza…

Representative Results

El ensayo in vivo de la mutagénesis in mide un evento raro (UFP mutante) entre muchos eventos (todo UFP). Al realizar el ensayo con pequeño número de células, es posible que el resultado está influido considerablemente por los resultados falsos positivos y falsos negativos. Para solucionar este problema se realiza un experimento de dilución en serie con las células de la médula ósea no fraccionadas, cosechado de tres animales diferentes. Se midió la frecuencia de mutantes en la médula …

Discussion

El ensayo in vivo de mutagénesis in descrito en el presente documento se basa en el modelo de ratón transgénico LacI originalmente generada por Kohler et al. ¹⁸ Este modelo utiliza un vector de fago λ que lleva un gen reportero lacI. Los dos sitios cos que flanquean el vector permite una recuperación relativamente simple y envasado posterior en partículas de fago infecciosas, utilizados para infectar E. coli. Una placa azul será generado po…

Materials

LacI transgenic mice	BioReliance Corporation
RecoverEase DNA Isolation Kit, including the RNace-It ribonuclease cocktail	Agilent Technologies (Stratagene)	720202
Transpack Packaging Extract, including the orange and blue transpack tubes and the SCS-8 E. coli	Agilent Technologies (Stratagene)	200221
DNA size standards – lambda ladder	Bio Rad	170-3635
0.025 mM pore size membranes	Fisher (Millipore)	VSWP 025 00
245 mm2 bioassay dishes (trays)	Fisher (Corning)	07-200-600
NZY broth (powder)	Fisher (Teknova)	N1144
Agar	Fisher	BP1423-500
Agarose	Fisher	E-3120-500
N, N-dimethylformamide	Fisher	AC34843-5000
X-gal	Research Products Intl Corp (RPI)	B71800-10.0
Proteinase K	Roche	3-115-852
PCR Extender Taq Polimerase kit	5 PRIME	2200500
Agencourt AMPure XP cleanup kit	Beckman/coulter	A63880