Summary

Identifizierung von DNA-Mutationen in hämatopoetischen Stammzellen Gereinigtes / Vorläuferzellen

Published: February 24, 2014
doi:

Summary

Hier beschreiben wir ein in-vivo-Mutagenese-Assay für eine kleine Anzahl von gereinigten hämatopoetischen Zellen unter Verwendung des lacI transgenen Mausmodell. Die LacI Gen isoliert, um die Häufigkeit, Ort und Art der DNA-Mutanten entstanden spontan oder nach der Exposition zu Genotoxinen bestimmen.

Abstract

In den letzten Jahren hat es sich gezeigt, dass genomische Instabilität fest mit vielen Entwicklungsstörungen, Krebs und Alterung. Da die Stammzellen für die Gewährleistung Gewebshomöostase und Reparatur des gesamten Lebens verantwortlich sind, ist es vernünftig zu vermuten, dass die Stammzellpopulation ist für die Erhaltung der genomischen Integrität der Gewebe. Deshalb hat großes Interesse an der Beurteilung der Auswirkungen von endogenen und Umweltfaktoren auf die genomischen Integrität in Stammzellen und deren Nachkommen, mit dem Ziel, die Ätiologie der Stammzellen basierte Krankheiten zu verstehen entstanden.

LacI transgenen Mäuse tragen eine erzielbare λ-Phagenvektor lacI-Reportersystems, wobei das lacI-Gen dient als Reporter-Mutation kodiert. Das Ergebnis einer mutierten lacI-Gen ist die Herstellung von β-Galactosidase spaltet ein chromogenes Substrat, Drehen blau. Die LacI Reportersystem ist durch in alle Zellen, einschließlich Stammzellen / Vorläuferzellen und können problemlos wiederhergestellt und verwendet werden, um anschließend zu infizieren E. werden coli. Nach Inkubation infizierten E. coli auf Agarose, die das richtige Substrat enthält, können Plaques erzielt werden; blaue Plaques zeigen eine Mutante LacI Gen, während klare Plaques Hafen-Wildtyp. Die Häufigkeit von blau (unter klar) Plaques zeigt die Mutationsrate in der ursprünglichen Zellpopulation wurde die DNA extrahiert aus. Sequenzierung der mutierten lacI-Gen wird die Position der Mutationen in dem Gen, und die Art der Mutation anzuzeigen.

LacI transgenen Mausmodell wird als ein in vivo-Mutagenese-Assay etabliert. Außerdem werden die Mäuse und die Reagenzien für den Assay sind im Handel erhältlich. Hier beschreiben wir detailliert, wie dieses Modell geeignet ist, die Frequenz von spontan auftretenden DNA-Mutanten in Stammzell-angereichertem Lin messen IL7R Sca-1 + + + cKit (LSK) Zellen und anderen Subpopulationen des hämatopoetischen Systems.

Introduction

In den meisten Geweben, differenzierte Zellen haben eine begrenzte Lebensdauer. Um funktionale Integrität zu erhalten, langlebig, gewebespezifische Stammzellen kontinuierlich Vorläuferzellen, die wiederum führen zu den ausdifferenzierten Zellen, die für die Funktion des jeweiligen Gewebes erforderlich. Stammzellen ihre eigene Fach durch einen Prozess namens Selbsterneuerung auch wieder aufzufüllen. So, für die Aufrechterhaltung der Funktionsfähigkeit des Gewebes, sie wohnen in. Deshalb verantwortlich sind Stammzellen, ist es unerlässlich, dass sie mit robusten Mechanismen ausgestattet, um zu erfassen und möglicherweise reparieren beschädigte DNA. Wenn nicht, können sie mehrere genomische (potentiell schädlichen) Störungen, die durch ihre Nachkommen vererbt werden können, zu erwerben. Zu verstehen, wie Stammzellen si-chern ihr Genom während der Lebensdauer eines Organismus ist eine wichtige Frage und kann uns helfen zu verstehen, warum genomische Instabilität wird mit Krebs und einigen anderen altersbedingten Krankheiten (in 1,2 bewertet) verbunden ist.

<p class = "jove_content"> Controlling genomischen Integrität eines Gewebes auf der Ebene von Stammzellen und frühen Vorläuferzellpopulationen entweder durch Eliminierung defekter Stamm (oder Vorläufer-) Zellen durch Zelltod, Seneszenz oder Differenzierung und / oder Reparatur effizienter erreicht werden geschädigter DNA. Jüngste Studien haben gezeigt, dass es möglich ist, bestimmte Arten von DNA-Reparatur direkt in diesen seltenen Populationen 3-6 messen. Es wurde gefunden, daß beispielsweise in den blutbildenden Systems, Doppelstrang-DNA-Brüche können durch homologe Rekombination (HR) oder nicht-homologen Ende repariert werden (NHEJ), wobei letztere eine Reparatur des unteren Treue und damit eine erhöhte Gefahr, dass Fehler. Beide werden in hämatopoetischen Stammzellen (HSC) 4,5 verwendet, jedoch bei Mäusen scheint es überwiegend NHEJ in der Erwägung, dass HSCs frühen Vorläuferzellen nutzen HR 4. Eine ähnliche Beobachtung wurde für die Stammzellen in der Haut 6 hergestellt. Interessant ist, dass in der menschlichen Blutstammzellen HR, NHEJ nicht,scheint der Reparaturmechanismus der Wahl für die Doppelstrangbrüche 3 sein. Ob diese funktionelle Unterschied zwischen den zwei Arten ist real oder nur eine technische oder experimentellen Unterschied, bleibt abzuwarten.

Repertoire eine Stammzelle zur Reparatur beschädigter DNA ist wahrscheinlich andere DNA-Reparaturmechanismen, wie Basenexzisionsreparatur (BER), Nukleotidexzisionsreparatur (NER) und Mismatch-Reparatur (MMR) enthalten. BER und NER sind für die Reparatur von einem oder mehreren Basenpaar Läsionen in Einzelstrang-DNA verantwortlich, während MMR-Fixes Basen-Basen-Fehlpaarungen und Einfügen / Löschen Schleifen, diese Arten von DNA-Schäden kann nicht durch NHEJ oder HR repariert werden. Unterstützt wird dieser Begriff gibt mehrere Studien aus dem blutbildenden Systems, die einen Zusammenhang zwischen Veränderungen in einem dieser Wege und Anomalien in der HSC Fach 7-9, sowie einem erhöhten Risiko der Entwicklung von myelodysplastischen Syndroms 10-16, eine Krankheit, die im UrsprungHSC und dass mit zunehmender genomische Instabilität wie die Krankheit fort 17 zugeordnet. Bis jetzt wurden Messungen der BER, NER und MMR direkt in HSCs nicht berichtet.

Zusätzlich zur Verdeutlichung der verschiedenen Prozesse, die Gewebeintegrität in einem mechanistischen Pegel zu steuern, ist es unerlässlich, um das Ausmaß der mutierten DNA zu messen, so dass die Folgen von Aberrationen in einem dieser Verfahren kann getestet werden, z. B. in normalen gegenüber genetisch entwickelt, Stammzellen oder in alt gegen jung. Allerdings ist die Entwicklung einer entsprechenden Assay wegen des Mangels an gewebespezifische Stammzellen und das Fehlen von Kulturbedingungen, die "stemness" bewahrt schwierig. Darüber hinaus sollte ein solches Assay abänderbar, um umweltbedingte und genetische Manipulationen. Eine mögliche Lösung für diese Einschränkungen und Anforderungen ist die Verwendung von Maus-Modellen, die spezifisch entworfen sind, um DNA-Mutationen zu detektieren.

MulFach-transgene Mausmodelle für den Mutationsnachweis wurden entwickelt. Zum Beispiel LacI transgenen Mäusen 18 führen einen erzielbaren λ-Phagen-Vektor, der das LacI Reportersystem, in dem die LacI Gen kodiert für ein Suppressor der Lac-Operator und dient als Reporter Mutation kodiert. Nach Mutation des lacI-Gens, wird der lac-Operator aktiviert und β-Galaktosidase hergestellt wird. β-Galactosidase spaltet das chromogene Substrat X-Gal (5-Brom-4-chlor-e-indolyl-β-D-galactopyranosid), der es blau wird. Die cos-Stellen flankieren den LacI Vektor erlaubt die einfache Wiederherstellung von Lambda-Phagen-Proteine ​​und anschließende Infektion von E. coli. Nach Inkubation infizierten E. coli auf Agarose, die die X-gal-Substrat enthält, kann Plaques erzielt werden. Blaue Plaketten enthalten eine mutmaßliche Mutanten-Lac-I Durchführung Phagen, während klare Plaques Hafen nicht-Mutanten. Die Häufigkeit der blaue Plaques (unter the klar sind) gibt die Mutationsrate in der ursprünglichen Zellpopulation wurde die DNA extrahiert aus. Darüber hinaus kann die λ-Phagen-Hosting lacI Ziel leicht sequenziert werden unter Verwendung von PCR-Techniken für relativ hohe Durchsatzanalyse. Die Sequenzierung mehrere mutierte Gene LacI wichtige Informationen über das Mutationsspektrum, die wiederum auf mögliche Mängel in bestimmten DNA-Reparaturwegen oder auf bestimmte gentoxische Ereignisse zeigen offenbaren. LacI transgenen System über mehrere Laboratorien 19 standardisiert und die Reagenzien sind im Handel erhältlich. Ein Hauptnachteil des lacI-System ist die begrenzte Möglichkeit, große Deletionen oder Umordnungen nachzuweisen, weshalb andere Verfahren, z. B. Mehrfarben-FISH an Metaphasespreitungen müssen verwendet werden, um diesen Mangel zu ergänzen sein.

Innerhalb des λ-Phagenvektor des lacI-Mausmodell, gibt es eine viel kleinere Gen CII, Für die Mutationsanalyse zur Verfügung. Die Größe und die Tatsache, daß Mutanten können ausgewählt werden, macht dies zu einer weniger arbeitsintensiven und kostengünstiger als der Assay 20 lacI-Gen-Analyse. Jedoch wird das lacI-Gen umfassender zur Mutagenese 21 und der Empfindlichkeit des Gen-Mutationen untersucht worden ist und dadurch, dass es eine klare Verständnis der Aminosäurereste, die eine phänotypische Reaktion auf ein chromogenes Substrat 22-25 zu erzeugen.

Andere Maus-Modelle für den Mutationsnachweis umfassen die Verwendung der &PHgr; X174 oder das lacZ-Transgen. Die &PHgr; X174 transgenen Mausmodell, mit dem Original-A: T → G: C-Reversion-Mutationstest 26 oder die Vorwärtsmutationstest 27 die Erkennung von einem Spektrum von Basenpaar-Substitutionen, stellt eine weniger kostspielige System als die LacI Modells ermöglicht. Allerdings ist die Mutations Bildschirm in der Vorwärts Assay nicht trivial und die Mutation spectrum des &PHgr; X174 Transgen nicht wie die des LacI gut charakterisiert. In Maus-Modellen trägt LacZ Transgene wird die Mutations LacZ Reporter erholt Verwendung E. coli-Wirtszellen, die empfindlich auf Galaktose und Galaktose-Medium 28 enthalten sind. Ein Nachteil dieses Systems ist, dass die Wiederherstellung des LacZ Ziel beinhaltet auch Restriktionsendonuklease-Verdau, gefolgt von Ligation und Elektroporation von E. coli-Wirte, wodurch es schwierig wird, das System für eine kleine Anzahl von Zellen anzupassen. Obwohl es nicht eine absolute Voraussetzung für die Arbeit mit Stammzellen / Vorläuferzellpopulationen (kann man immer mit mehr Mäuse beginnen), wenn eine große Zahl von Zellen erforderlich sind (zB Millionen oder mehr) es wird schnell unpraktisch und kostspielig geworden. Auch die relativ großen Abmessungen von LacZ, während ein empfindlicher Mutations Reporter, ist umständlich und kostspielig für die DNA-Sequenzanalyse und determfung der Mutation Spektren. Ein Hauptvorteil dieses Modells ist jedoch seine Fähigkeit, große Deletionen und Insertionen zu detektieren, sowie chromosomale Rearrangements.

Da alle Zellen in lacI, &PHgr; X174 und LacZ transgenen Mausmodellen führen das Reportersystem kann jeder dieser Mausmodelle verwendet werden, um die Mutagenese in jedem Zelltyp von Interesse zu messen, einschließlich der Stamm-und Vorläuferzellen, solange sie zuverlässig entnommen werden können und in ausreichender Zahl. Weil wir umfangreiche Erfahrung mit der LacI Mausmodell und dem LacI Mutationstest, haben wir beschlossen, dieses System weiter für die Mutagenese-Analyse in hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferpopulationen zu verfolgen.

Die blutbildenden Gewebe ist gut charakterisiert hinsichtlich der Zelloberfläche Phänotyp der einzelnen Komponenten, einschließlich der langfristigen Bestandsauffüllung Stammzellen, die erkennbar der extrem seltenen Bevölkerung von Lin sind IL7R <sup> – Sca-1 + cKit + + (LSK) / Flk2 CD150 + CD48 Zellen 29. . Mohrin et al 4 gezeigt, dass die Bevölkerung von etwas größer LSK/Flk2 Zellen sind immer noch gute Vertreter für HSK und die erheblich von den primitivsten engagierte myeloischen Vorläufer (CMP) Bevölkerung, wenn es um das Studium der DNA-Reparatur kommt. Wenn darüber hinaus die HSC-angereicherten LSK (Flk-2 +-und Flk-2 -) – IL7R Zellen wurden zum Vergleich Lin Sca-1-cKit + + (K LS-Vorläuferzellen), gab es immer noch einen signifikanten Unterschied in NHEJ Fähigkeit 5 zwischen der weniger rein, Stammzell-angereichertem LSK Bevölkerung und die Vorläuferzellen. In unserer Studie verwenden wir HSC angereicherte LSK (Flk-2 +-und Flk-2 -)-Zellen, weil wir festgestellt, dass mindestens 2 x 10 5 Zellen für konsistente, zuverlässige Ergebnisse in dieser Mutagenese-Assay erforderlich, das die Zellzahl ist äußerst schwierig,zu erhalten, wenn man die LSK/Flk2 sortiert CD150 + CD48 Bevölkerung oder auch die LSK/Flk2 Bevölkerung (in Form von Mäusen, Kosten und Praktikabilität). Dieses Protokoll basiert auf der ursprünglich von Kohler et 18 al. Entwickelt beschreibt im Detail, wie die spontane DNA-Mutantenfrequenz in LSK Zellen differenzierten Populationen von myeloischen Zellen sowie nicht getrennten Knochenmark und Milz-Zellen bestimmt und definiert werden.

Protocol

Leukozyten aus LacI transgenen Mäuse auf einer C57BL / 6 Hintergrund nicht exprimieren Sca-1 (Abbildung 1). Deshalb, wenn Sca-1 ist ein Marker für Zellreinigung verwendet wird, müssen diese Mäuse mit einer entsprechenden Belastung für Sca-1-Expression zu gewinnen gekreuzt werden, in diesem Protokoll die F1 einer Kreuzung zwischen normalen C57BL / 6 (B6) Mäuse und LacI (C57BL / 6)-transgenen Mäusen (lacI) verwendet wurde (Fig. 1). Von den Zellpopulatione…

Representative Results

Die in vivo-Mutagenese-Assay misst eine seltene Ereignis (Mutante PFUs) unter vielen Ereignissen (alle PFUs). Durch Durchführen des Assays mit einer kleinen Anzahl von Zellen ist es möglich, dass das Ergebnis erheblich falsch-positive und falsch-negative Ergebnisse beeinflusst. Um dieses Problem zu adressieren wir führten eine serielle Verdünnungsexperiment mit unfraktioniertem Knochenmarkzellen, aus drei verschiedenen Tieren geerntet. Wir maßen die Mutationsrate in dem Knochenmark der Tiere mit 1,4 …

Discussion

Die hierin beschriebenen in-vivo-Mutagenese-Assay basiert auf der ursprünglich von 18 Dieses Modell verwendet einen λ-Phagenvektor, der eine lac-Reportergens Kohler et al. Erzeugt LacI transgenen Mausmodell. Die beiden cos-Stellen flankieren die Vektor ermöglichen eine relativ einfache Rückgewinnung und anschließende Verpackung in infektiöse Phagenpartikel, verwendet, um E. infizieren coli. Eine blaue Plakette wird durch Phagen-infizierten <…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir möchten David R. Rodriguez, MA für die Grafik-Design und Fotografie in diesem Manuskript danken. Diese Arbeit wurde durch Mittel aus dem GCCRI, dem NIH / NIA (5R21AG033339) und dem Cancer Center Support Grant (P30CA054174) an die UTHSCSA Durchflusszytometrie Core-Anlage und der UTHSCSA Erweiterte Nucleic Acids Core Facility unterstützt.

Materials

LacI transgenic mice  BioReliance Corporation
RecoverEase DNA Isolation Kit, including the RNace-It ribonuclease cocktail Agilent Technologies (Stratagene) 720202
Transpack Packaging Extract, including the orange and blue transpack tubes and the SCS-8 E. coli Agilent Technologies (Stratagene) 200221
DNA size standards – lambda ladder Bio Rad 170-3635
0.025 mM pore size membranes  Fisher (Millipore) VSWP 025 00
245 mm2 bioassay dishes (trays)  Fisher (Corning) 07-200-600
NZY broth (powder) Fisher (Teknova) N1144
Agar Fisher BP1423-500
Agarose Fisher E-3120-500
N, N-dimethylformamide Fisher AC34843-5000
X-gal Research Products Intl Corp (RPI) B71800-10.0
Proteinase K Roche 3-115-852
PCR Extender Taq Polimerase kit 5 PRIME 2200500
Agencourt AMPure XP cleanup kit Beckman/coulter A63880

References

  1. Maslov, A. Y., Vijg, J. Genome instability, cancer and aging. Biochim. Biophys. Acta. 1790 (10), 963-969 (2009).
  2. Aguilera, A., Gomez-Gonzalez, B. Genome instability: a mechanistic view of its causes and consequences. Nat. Rev. Genet. 9 (3), 204-217 (2008).
  3. Milyavsky, M., et al. A distinctive DNA damage response in human hematopoietic stem cells reveals an apoptosis-independent role for p53 in self-renewal. Cell. Stem Cell. 7 (2), 186-197 (2010).
  4. Mohrin, M., et al. Hematopoietic stem cell quiescence promotes error-prone DNA repair and mutagenesis. Cell. Stem Cell. 7 (2), 174-185 (2010).
  5. Shao, L., Feng, W., Lee, K. J., Chen, B. P., Zhou, D. A sensitive and quantitative polymerase chain reaction-based cell free in vitro non-homologous end joining assay for hematopoietic stem cells. PLoS ONE. 7 (3), (2012).
  6. Sotiropoulou, P. A., et al. Bcl-2 and accelerated DNA repair mediates resistance of hair follicle bulge stem cells to DNA-damage-induced cell death. Nat. Cell Biol. 12 (6), 572-582 (2010).
  7. Prasher, J. M., et al. Reduced hematopoietic reserves in DNA interstrand crosslink repair-deficient Ercc1-/- mice. EMBO J. 24 (4), 861-871 (2005).
  8. Rossi, D. J., et al. Deficiencies in DNA damage repair limit the function of haematopoietic stem cells with age. Nature. 447 (7145), 725-729 (2007).
  9. Reese, J. S., Liu, L., Gerson, S. L. Repopulating defect of mismatch repair-deficient hematopoietic stem cells. Blood. 102 (5), 1626-1633 (2003).
  10. Carney, D. A., et al. Therapy-related myelodysplastic syndrome and acute myeloid leukemia following fludarabine combination chemotherapy. Leukemia. 24 (12), 2056-2062 (2010).
  11. Jankowska, A. M., et al. Base excision repair dysfunction in a subgroup of patients with myelodysplastic syndrome. Leukemia. 22 (3), 551-558 (2008).
  12. Tam, C. S., et al. Treatment-related myelodysplasia following fludarabine combination chemotherapy. Haematologica. 91 (11), 1546-1550 (2006).
  13. Webb, S. Xeroderma pigmentosum. BMJ. 336 (7641), 444-446 (2008).
  14. Ben-Yehuda, D., et al. Microsatellite instability and p53 mutations in therapy-related leukemia suggest mutator phenotype. Blood. 88 (11), 4296-4303 (1996).
  15. Casorelli, I., et al. Drug treatment in the development of mismatch repair defective acute leukemia and myelodysplastic syndrome. DNA Repair. 2 (5), 547-559 (2003).
  16. Olipitz, W., et al. Defective DNA-mismatch repair: a potential mediator of leukemogenic susceptibility in therapy-related myelodysplasia and leukemia. Genes Chrom. Cancer. 34 (2), 243-248 (2002).
  17. Haase, D., et al. New insights into the prognostic impact of the karyotype in MDS and correlation with subtypes: evidence from a core dataset of 2124 patients. Blood. 110 (13), 4385-4395 (2007).
  18. Kohler, S. W., et al. Analysis of spontaneous and induced mutations in transgenic mice using a lambda ZAP/lacI shuttle vector. Environ. Mol. Mutagen. 18 (4), 316-321 (1991).
  19. Rogers, B. J., Provost, G. S., Young, R. R., Putman, D. L., Short, J. M. Intralaboratory optimization and standardization of mutant screening conditions used for a lambda/lacI transgenic mouse mutagenesis assay. 327 (1-2), 57-66 (1995).
  20. Jakubczak, J. L., et al. Analysis of genetic instability during mammary tumor progression using a novel selection-based assay for in vivo mutations in a bacteriophage lambda transgene target. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (17), 9073-9078 (1996).
  21. Ward, T. L., Prtenjaca, A., Hill, K. A. A novel Escherichia coli-derived mutation detected with the Big Blue cII mutant selectable assay. Environ. Mol. Mutagen. 51 (4), 344-348 (2010).
  22. Miller, J. H., Coulondre, C., Farabaugh, P. J. Correlation of nonsense sites in the lacI gene with specific codons in the nucleotide sequence. Nature. 274 (5673), 770-775 (1978).
  23. Provost, G. S., et al. Transgenic systems for in vivo mutation analysis. Mutat. Res. 288 (1), 133-149 (1993).
  24. Schaaper, R. M., Danforth, B. N., Glickman, B. W. Mechanisms of spontaneous mutagenesis: an analysis of the spectrum of spontaneous mutation in the Escherichia coli lacI gene. J. Mol. Biol. 189 (2), 273-284 (1986).
  25. Schaaper, R. M., Dunn, R. L. Spontaneous mutation in the Escherichia coli lacI gene. Genetics. 129 (2), 317-326 (1991).
  26. Burkhart, J. G., Burkhart, B. A., Sampson, K. S., Malling, H. V. ENU-induced mutagenesis at a single A: T base pair in transgenic mice containing phi X174. Mutat. Res. 292 (1), 69-81 (1993).
  27. Valentine, C. R., et al. Characterization of mutant spectra generated by a forward mutational assay for gene A of Phi X174 from ENU-treated transgenic mouse embryonic cell line PX-2. Environ. Mol. Mutagen. 39 (1), 55-68 (2002).
  28. Gossen, J. A., Molijn, A. C., Douglas, G. R., Vijg, J. Application of galactose-sensitive E. coli strains as selective hosts for LacZ- plasmids. Nucleic Acids Res. 20 (12), 3254 (1992).
  29. Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
  30. Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404 (6674), 193-197 (2000).
  31. Frascoli, M., Proietti, M., Grassi, F. Phenotypic analysis and isolation of murine hematopoietic stem cells and lineage-committed progenitors. J. Vis. Exp. (65), (2012).
  32. Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273 (5272), 242-245 (1996).
  33. Stratagene, Transpack packaging extract for lambda transgenic shuttle vector recovery. Instruction manual. , (2001).
  34. Stratagene, RecoverEase DNA isolation kit. Instruction manual. , (2009).
  35. Stratagene, Big Blue transgenic mouse mutagenesis assay system. Instruction manual. , (1992).
  36. Nishino, H., Buettner, V. L., Sommer, S. S. Towards validation of the Big Blue transgenic mouse mutagenesis assay: the mutational spectrum of ex vivo pinpoint mutant plaques. Muta. Res. 372 (1), 97-105 (1996).
  37. Stuart, G. R., Gorelick, N. J., Andrews, J. L., de Boer, J. G., Glickman, B. W. The genetic analysis of lacI mutations in sectored plaques from Big Blue transgenic mice. Environ. Mol. Mutagen. 28, 385-392 (1996).
  38. Bielas, J. H., Heddle, J. A. Proliferation is necessary for both repair and mutation in transgenic mouse cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (21), 11391-11396 (2000).
  39. Paashuis-Lew, Y., Zhang, X. B., Heddle, J. A. On the origin of spontaneous somatic mutations and sectored plaques detected in transgenic mice. Mutat. Res. 373 (2), 277-284 (1997).
  40. de Boer, J. G., Glickman, B. W. The lacI gene as a target for mutation in transgenic rodents and Escherichia coli. Genetics. 148 (4), 1441-1451 (1998).
  41. Piegorsch, W. W., et al. Study design and sample sizes for a lacI transgenic mouse mutation assay. Environ. Mol. Mutagen. 25 (3), 231-245 (1995).
  42. Yang, L., et al. Identification of Lin(-)Sca1(+)kit(+)CD34(+)Flt3- short-term hematopoietic stem cells capable of rapidly reconstituting and rescuing myeloablated transplant recipients. Blood. 105 (7), 2717-2723 (2005).
  43. Hilbe, J. M. . Negative Binomial Regression. second edn. , (2011).
  44. de Boer, J. G., Provost, S., Gorelick, N., Tindall, K., Glickman, B. W. Spontaneous mutation in lacI transgenic mice: a comparison of tissues. Mutagenesis. 13 (2), 109-114 (1998).
  45. Huffman, M. D. An improved approximation to-sample poisson test. Appl. Stat. 33 (2), 224-226 (1984).

Play Video

Cite This Article
Cheng, Z., Zhou, T., Merchant, A., Prihoda, T. J., Wickes, B. L., Xu, G., Walter, C. A., Rebel, V. I. Identifying DNA Mutations in Purified Hematopoietic Stem/Progenitor Cells. J. Vis. Exp. (84), e50752, doi:10.3791/50752 (2014).

View Video