Выявление ДНК мутации в Очищенная гемопоэтических стволовых / клеток-предшественников
Summary
Здесь мы опишем в естественных условиях мутагенеза анализ для небольшого количества очищенных гемопоэтических клеток с использованием трансгенных мышах Лачи. Ген LacI могут быть выделены для определения частоты, расположение и тип мутантов ДНК спонтанно возникшую или после воздействия генотоксинов.
Abstract
В последние годы стало очевидно, что нестабильность генома тесно связана со многими нарушениями развития, рака, и старения. Учитывая, что стволовые клетки несут ответственность за обеспечение тканевого гомеостаза и ремонт на протяжении всей жизни, то разумно предположить, что популяции стволовых клеток имеет решающее значение для сохранения геномной целостности тканей. Таким образом, значительный интерес возник в оценке воздействия эндогенных и экологических факторов на геномной целостности в стволовых клетках и их потомства, с целью понять этиологию болезней стволовых клеток на основе.
LĀČI трансгенные мыши несут восстановительной λ вектор фага, кодирующей репортерный систему LĀČI, в котором ген LacI служит в качестве репортера мутаций. Результатом мутантного гена LacI является производство β-галактозидазы, который расщепляет хромогенный субстрат, превратив его синий. Репортер система LacI осуществляется яп все клетки, в том числе стволовых клеток / клеток-предшественников и могут быть легко восстановлены и использованы в дальнейшем заражают E. палочка. После инкубации зараженного E. палочка на агарозы, содержащей правильный субстрат, бляшки могут быть забил; голубые бляшки указывают мутантный ген Лачи, в то время как чистые таблички гавань дикого типа. Частота синего (среди ясных) бляшек указывает мутантный частоту в исходной популяции клеток ДНК, извлеченной из. Секвенирование мутантный ген Лачи покажет расположение мутаций в гене и тип мутации.
LacI трансгенных мышах хорошо разработана как в естественных условиях мутагенеза анализа. Кроме того, мыши и реагенты для анализа являются коммерчески доступными. Здесь мы подробно описывают, как эта модель может быть адаптирована для измерения частоты спонтанно возникающего мутантов ДНК в стволовых клеток обогащенный Lin – IL7R – SCA-1 + cKit + + (LSK) клетки и другие субпопуляции кроветворной системы.
Introduction
В большинстве тканей, дифференцированные клетки имеют ограниченный срок службы. Для поддержания функциональной целостности, долгоживущие, тканеспецифические стволовые клетки непрерывно производят клетки-предшественники, которые, в свою очередь, привели к возникновению полностью дифференцированных клеток, необходимых для функционирования этой конкретной ткани. Стволовые клетки также пополнить свой собственный отсек посредством процесса, называемого самообновлению. Таким образом, стволовые клетки несут ответственность за поддержание функциональной целостности ткани они проживают дюйма Таким образом, крайне важно, чтобы они оснащены надежными механизмами толку и потенциально ремонт поврежденной ДНК. Если нет, то они могут приобрести несколько геномных (потенциально опасные) возмущения, которые могут быть унаследованы их потомства. Понимание того, как стволовые клетки безопасной охранять их геном течение жизни организма очень важный вопрос, и может помочь нам понять, почему нестабильность генома связано с раком и некоторыми другими возрастными заболеваниями (отзывы в 1,2).
<p clзад = "jove_content"> Управление геномной целостности ткани на уровне стволовых клеток или популяции клеток-предшественников в начале может быть достигнуто путем либо устранение дефектный шток (или клетки-предшественники) клетки через клеточной гибели, старение или дифференцировки и / или эффективного ремонта поврежденной ДНК. Недавние исследования показали, что это возможно для измерения определенных типов репарации ДНК непосредственно в этих редких популяций 3-6. Было установлено, что, например, в кроветворной системы, двойные разрывы цепи ДНК могут быть устранены путем гомологичной рекомбинации (HR) или негомологичной конце присоединения (NHEJ), причем последний ремонт процесс более низкой точностью и таким образом увеличивается риск принятия ошибки. Оба в настоящее время используются в гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) 4,5, однако, у мышей кажется, что это в основном NHEJ в ГСК в то время как ранние прародители клетки используют HR 4. Аналогичное наблюдение было сделано для стволовых клеток в коже 6. Интересно, что в человеческой ГСК HR, не NHEJ,кажется, ремонт механизма выбора для двойных разрывов ДНК 3. Является ли это функциональное различие между двумя видами реально или просто представляет технические или экспериментальную разницу еще предстоит выяснить.Репертуар стволовая клетка для восстановления поврежденных ДНК, вероятно, включать другие механизмы репарации ДНК, такие как эксцизионной репарации оснований (BER), нуклеотид ремонта иссечение (НЭК) и несоответствие ремонта (MMR). BER а НЭК отвечают за ремонт одного или нескольких поражений пар оснований в одноцепочечной ДНК, в то время как MMR исправления база-основные несоответствия и вставки / удаления петли; эти типы повреждений ДНК не может быть отремонтировано NHEJ или HR. Поддержка этого понятия несколько исследований из кроветворной системы, демонстрируя связь между изменениями в одном из этих путей и нарушений в отсек HSC 7-9, а также повышенным риском развития миелодиспластический синдром 10-16 болезнь, которая берет свое начало вHSC и что связано с увеличением геномной нестабильности как болезнь прогрессирует 17. Пока еще не сообщалось измерения BER, НКО и MMR непосредственно в ГСК.
В дополнение к выяснению различные процессы, которые контролируют целостность тканей на механистической точки зрения, крайне важно, чтобы иметь возможность измерить степень мутировал ДНК, так что последствия аберраций в одном из этих процессов могут быть проверены, например, в нормальный по сравнению с генетически инженерные стволовые клетки или в старый по сравнению молодой. Тем не менее, развитие соответствующих анализа трудно из-за недостатка тканеспецифических стволовых клеток, а также отсутствие условий культивирования, сохраняющий "стволовости". Более того, такой анализ должен быть исправимо в экологических и генетических манипуляций. Возможным решением этих ограничений и требований является использование мышиных моделях, которые специально сконструированных для обнаружения мутаций ДНК.
Mulбыли разработаны Кратные трансгенные модели мыши для обнаружения мутаций. Например, трансгенные мыши LacI 18 несут восстановительной λ вектор фага, кодирующей репортерный систему LĀČI, в котором ген кодирует LacI подавитель оператора Lac и служит в качестве репортера мутаций. После мутацией гена LacI, оператор Lac активируется и β-галактозидазы производится. β-галактозидазы расщепляет хромогенный субстрат Х-Gal (5-бром-4-хлор-е-индолил-β-D-галактопиранозид), который поворачивает это синий. ЦС сайты фланговые вектор Лачи позволяет легко восстановления по фага лямбда белков и последующего заражения E. палочка. После инкубации зараженного E. палочка на агарозы, содержащей X-гал субстрат, бляшки могут быть забил. Синие таблички содержат предполагаемый мутант Лак-я балансовую фаг, а четкие таблички гавани не-мутантов. Частота голубых бляшек (среди йе четкие те) указывает мутантный частоты в исходной клеточной популяции ДНК экстрагировали из. Кроме того, λ фага хостинг цель Лачи можно легко секвенировали с использованием методов ПЦР для относительно высокопроизводительного анализа. Секвенирование несколько мутантные гены Лачи покажет важную информацию о мутации спектра, что в свою очередь может указывать на возможные недостатки конкретных восстановления повреждений ДНК или к конкретным генотоксических событий. Трансгенные система LacI был стандартизирован в нескольких лабораториях 19 и реагенты коммерчески доступны. Одним из основных недостатков системы LacI является ограниченная способность обнаруживать большие делеции или перестановки, поэтому другие методы, например, многоцветные рыбы на метафазных должны быть использованы, чтобы хвалить этот недостаток.
В λ-фага вектора модели LacI мыши, существует гораздо меньше ген, CII, Доступны для анализа мутаций. Его размер и то, что мутанты могут быть выбраны делает это менее трудоемким и более дешевым анализ 20, чем анализ генов LacI. Тем не менее, ген LacI более широко изучены в течение 21 мутагенеза и чувствительности к мутациям гена был хорошо охарактеризован, так что существует четкое понимание аминокислотных остатков, которые генерируют ответ на фенотипическую хромогенного субстрата 22-25.
Другие модели мыши для обнаружения мутаций включают использование ΦX174 или LacZ трансгенов. ΦX174 трансгенных мышах, с оригинальным A: T → G: мутация возвращение C анализа 26 или вперед мутация пробирного 27, что позволяет обнаружение спектра пар оснований замен, представляет собой менее дорогостоящую систему, чем модели LacI. Тем не менее, мутационный экран в прямом анализе не является тривиальной и мутация спецификацииспектра трансгена ΦX174 не так хорошо охарактеризованный как и у LacI. В мышиных моделях, несущих LacZ трансгены, мутационный репортер LacZ восстанавливается с использованием E. палочки клетки-хозяева, которые чувствительны к галактозы и среде, содержащей галактозу 28. Недостатком этой системы является то, что восстановление мишени LacZ также включает рестрикционной эндонуклеазой с последующим лигированием и электропорации Е. палочка проходит, тем самым затрудняя адаптировать систему для небольшого числа клеток. Хотя это не является обязательным требованием для работы с клеточных популяций стволовых / прародитель (всегда можно начать с более мышей), если большое количество клеток необходимы (например, миллионы или более) она быстро станет непрактичным и непомерно. Кроме того, относительно большие размеры LacZ, обеспечивая при этом чувствительную мутационный репортер, является громоздкой и более дорогостоящим для анализа последовательности ДНК и DETERMминации спектров мутаций. Главное преимущество этой модели, однако, является его способность обнаруживать крупные делеции и вставки, а также хромосомные перестройки.
Так как все клетки в трансгенных моделей LacI, ΦX174 и LacZ мыши несут репортерной системы, любой из этих мышиных моделях может быть использован для измерения мутагенеза в любом типе клеток, представляющих интерес, в том числе стволовых клеток и клеток-предшественников, поскольку они могут быть надежно собраны и в достаточном количестве. Поскольку у нас был большой опыт работы с мышиной модели LacI и мутация пробирного LacI, мы решили продолжить эту систему в дальнейшем для анализа мутагенеза в гемопоэтических стволовых и населения предшественников.
Кроветворной ткани хорошо охарактеризованы в терминах клеточной поверхности фенотипа отдельных его компонентов, в том числе долгосрочных заселения стволовых клеток, которые можно идентифицировать как крайне редких населения Лин – IL7R <suр> – SCA-1 + cKit + + (ЛСК) / Flk2 – CD150 + CD48 – клетки 29. . Mohrin др. 4 показали, что немного больше, население LSK/Flk2 – клетки все еще хорошие представители для ГСК и значительно отличается от самой примитивной совершенного миелоидной прародителя (СМР) населения, когда дело доходит до изучения репарации ДНК. Более того, когда HSC обогащенный ЛСК (Flk-2 Flk-2 + и -) клетки по сравнению с Лин – IL7R – SCA-1-cKit + + (клеток LS-K-предшественники), по-прежнему значительная разница в способность 5 NHEJ между менее чистыми, клеток обогащенный население LSK и клетки-предшественники стволовых. В нашем исследовании мы используем HSC обогащенный ЛСК (Flk-2 + и Flk-2 -) клетки, потому что мы обнаружили, что по крайней мере 2 х 10 5 клеток необходимы для последовательных, надежных результатов в этом мутагенеза анализа; это число клеток крайне сложнодля получения, когда один сортирует LSK/Flk2 – население CD150 + CD48 или даже LSK/Flk2 – населения (с точки зрения мышей, затрат и практичности). Этот протокол, основанный на один первоначально разработанный Kohler и соавт. 18 подробно описывает, как спонтанный мутант частота ДНК может быть определена в LSK клеток и определили популяции дифференцированных миелоидных клеток, а также безотрывно костного мозга и клеток селезенки.
Protocol
Representative Results
Discussion
В естественных условиях мутагенеза описанный здесь анализ основан на LacI трансгенных мышах первоначально генерируемого Kohler и соавт. 18 Эта модель используетс λ вектор фага, несущего ген-репортер LĀČI. Два COS-сайты, фланкирующие вектор позволяют относительно…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Дэвида Р. Родригес, MA для графического дизайна и фотографии в этой рукописи. Эта работа была поддержана финансирование из GCCRI, в NIH / NIA (5R21AG033339) и онкологического центра поддержки Грант (P30CA054174) к UTHSCSA проточной цитометрии основной комплекс и UTHSCSA Расширенный нуклеиновые кислоты Основной фонда.
Materials
| LacI transgenic mice | BioReliance Corporation | |
| RecoverEase DNA Isolation Kit, including the RNace-It ribonuclease cocktail | Agilent Technologies (Stratagene) | 720202 |
| Transpack Packaging Extract, including the orange and blue transpack tubes and the SCS-8 E. coli | Agilent Technologies (Stratagene) | 200221 |
| DNA size standards – lambda ladder | Bio Rad | 170-3635 |
| 0.025 mM pore size membranes | Fisher (Millipore) | VSWP 025 00 |
| 245 mm2 bioassay dishes (trays) | Fisher (Corning) | 07-200-600 |
| NZY broth (powder) | Fisher (Teknova) | N1144 |
| Agar | Fisher | BP1423-500 |
| Agarose | Fisher | E-3120-500 |
| N, N-dimethylformamide | Fisher | AC34843-5000 |
| X-gal | Research Products Intl Corp (RPI) | B71800-10.0 |
| Proteinase K | Roche | 3-115-852 |
| PCR Extender Taq Polimerase kit | 5 PRIME | 2200500 |
| Agencourt AMPure XP cleanup kit | Beckman/coulter | A63880 |
References
- Maslov, A. Y., Vijg, J. Genome instability, cancer and aging. Biochim. Biophys. Acta. 1790 (10), 963-969 (2009).
- Aguilera, A., Gomez-Gonzalez, B. Genome instability: a mechanistic view of its causes and consequences. Nat. Rev. Genet. 9 (3), 204-217 (2008).
- Milyavsky, M., et al. A distinctive DNA damage response in human hematopoietic stem cells reveals an apoptosis-independent role for p53 in self-renewal. Cell. Stem Cell. 7 (2), 186-197 (2010).
- Mohrin, M., et al. Hematopoietic stem cell quiescence promotes error-prone DNA repair and mutagenesis. Cell. Stem Cell. 7 (2), 174-185 (2010).
- Shao, L., Feng, W., Lee, K. J., Chen, B. P., Zhou, D. A sensitive and quantitative polymerase chain reaction-based cell free in vitro non-homologous end joining assay for hematopoietic stem cells. PLoS ONE. 7 (3), (2012).
- Sotiropoulou, P. A., et al. Bcl-2 and accelerated DNA repair mediates resistance of hair follicle bulge stem cells to DNA-damage-induced cell death. Nat. Cell Biol. 12 (6), 572-582 (2010).
- Prasher, J. M., et al. Reduced hematopoietic reserves in DNA interstrand crosslink repair-deficient Ercc1-/- mice. EMBO J. 24 (4), 861-871 (2005).
- Rossi, D. J., et al. Deficiencies in DNA damage repair limit the function of haematopoietic stem cells with age. Nature. 447 (7145), 725-729 (2007).
- Reese, J. S., Liu, L., Gerson, S. L. Repopulating defect of mismatch repair-deficient hematopoietic stem cells. Blood. 102 (5), 1626-1633 (2003).
- Carney, D. A., et al. Therapy-related myelodysplastic syndrome and acute myeloid leukemia following fludarabine combination chemotherapy. Leukemia. 24 (12), 2056-2062 (2010).
- Jankowska, A. M., et al. Base excision repair dysfunction in a subgroup of patients with myelodysplastic syndrome. Leukemia. 22 (3), 551-558 (2008).
- Tam, C. S., et al. Treatment-related myelodysplasia following fludarabine combination chemotherapy. Haematologica. 91 (11), 1546-1550 (2006).
- Webb, S. Xeroderma pigmentosum. BMJ. 336 (7641), 444-446 (2008).
- Ben-Yehuda, D., et al. Microsatellite instability and p53 mutations in therapy-related leukemia suggest mutator phenotype. Blood. 88 (11), 4296-4303 (1996).
- Casorelli, I., et al. Drug treatment in the development of mismatch repair defective acute leukemia and myelodysplastic syndrome. DNA Repair. 2 (5), 547-559 (2003).
- Olipitz, W., et al. Defective DNA-mismatch repair: a potential mediator of leukemogenic susceptibility in therapy-related myelodysplasia and leukemia. Genes Chrom. Cancer. 34 (2), 243-248 (2002).
- Haase, D., et al. New insights into the prognostic impact of the karyotype in MDS and correlation with subtypes: evidence from a core dataset of 2124 patients. Blood. 110 (13), 4385-4395 (2007).
- Kohler, S. W., et al. Analysis of spontaneous and induced mutations in transgenic mice using a lambda ZAP/lacI shuttle vector. Environ. Mol. Mutagen. 18 (4), 316-321 (1991).
- Rogers, B. J., Provost, G. S., Young, R. R., Putman, D. L., Short, J. M. Intralaboratory optimization and standardization of mutant screening conditions used for a lambda/lacI transgenic mouse mutagenesis assay. 327 (1-2), 57-66 (1995).
- Jakubczak, J. L., et al. Analysis of genetic instability during mammary tumor progression using a novel selection-based assay for in vivo mutations in a bacteriophage lambda transgene target. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (17), 9073-9078 (1996).
- Ward, T. L., Prtenjaca, A., Hill, K. A. A novel Escherichia coli-derived mutation detected with the Big Blue cII mutant selectable assay. Environ. Mol. Mutagen. 51 (4), 344-348 (2010).
- Miller, J. H., Coulondre, C., Farabaugh, P. J. Correlation of nonsense sites in the lacI gene with specific codons in the nucleotide sequence. Nature. 274 (5673), 770-775 (1978).
- Provost, G. S., et al. Transgenic systems for in vivo mutation analysis. Mutat. Res. 288 (1), 133-149 (1993).
- Schaaper, R. M., Danforth, B. N., Glickman, B. W. Mechanisms of spontaneous mutagenesis: an analysis of the spectrum of spontaneous mutation in the Escherichia coli lacI gene. J. Mol. Biol. 189 (2), 273-284 (1986).
- Schaaper, R. M., Dunn, R. L. Spontaneous mutation in the Escherichia coli lacI gene. Genetics. 129 (2), 317-326 (1991).
- Burkhart, J. G., Burkhart, B. A., Sampson, K. S., Malling, H. V. ENU-induced mutagenesis at a single A: T base pair in transgenic mice containing phi X174. Mutat. Res. 292 (1), 69-81 (1993).
- Valentine, C. R., et al. Characterization of mutant spectra generated by a forward mutational assay for gene A of Phi X174 from ENU-treated transgenic mouse embryonic cell line PX-2. Environ. Mol. Mutagen. 39 (1), 55-68 (2002).
- Gossen, J. A., Molijn, A. C., Douglas, G. R., Vijg, J. Application of galactose-sensitive E. coli strains as selective hosts for LacZ- plasmids. Nucleic Acids Res. 20 (12), 3254 (1992).
- Kiel, M. J., et al. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and progenitor cells and reveal endothelial niches for stem cells. Cell. 121 (7), 1109-1121 (2005).
- Akashi, K., Traver, D., Miyamoto, T., Weissman, I. L. A clonogenic common myeloid progenitor that gives rise to all myeloid lineages. Nature. 404 (6674), 193-197 (2000).
- Frascoli, M., Proietti, M., Grassi, F. Phenotypic analysis and isolation of murine hematopoietic stem cells and lineage-committed progenitors. J. Vis. Exp. (65), (2012).
- Osawa, M., Hanada, K., Hamada, H., Nakauchi, H. Long-term lymphohematopoietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell. Science. 273 (5272), 242-245 (1996).
- Stratagene, Transpack packaging extract for lambda transgenic shuttle vector recovery. Instruction manual. , (2001).
- Stratagene, RecoverEase DNA isolation kit. Instruction manual. , (2009).
- Stratagene, Big Blue transgenic mouse mutagenesis assay system. Instruction manual. , (1992).
- Nishino, H., Buettner, V. L., Sommer, S. S. Towards validation of the Big Blue transgenic mouse mutagenesis assay: the mutational spectrum of ex vivo pinpoint mutant plaques. Muta. Res. 372 (1), 97-105 (1996).
- Stuart, G. R., Gorelick, N. J., Andrews, J. L., de Boer, J. G., Glickman, B. W. The genetic analysis of lacI mutations in sectored plaques from Big Blue transgenic mice. Environ. Mol. Mutagen. 28, 385-392 (1996).
- Bielas, J. H., Heddle, J. A. Proliferation is necessary for both repair and mutation in transgenic mouse cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (21), 11391-11396 (2000).
- Paashuis-Lew, Y., Zhang, X. B., Heddle, J. A. On the origin of spontaneous somatic mutations and sectored plaques detected in transgenic mice. Mutat. Res. 373 (2), 277-284 (1997).
- de Boer, J. G., Glickman, B. W. The lacI gene as a target for mutation in transgenic rodents and Escherichia coli. Genetics. 148 (4), 1441-1451 (1998).
- Piegorsch, W. W., et al. Study design and sample sizes for a lacI transgenic mouse mutation assay. Environ. Mol. Mutagen. 25 (3), 231-245 (1995).
- Yang, L., et al. Identification of Lin(-)Sca1(+)kit(+)CD34(+)Flt3- short-term hematopoietic stem cells capable of rapidly reconstituting and rescuing myeloablated transplant recipients. Blood. 105 (7), 2717-2723 (2005).
- Hilbe, J. M. . Negative Binomial Regression. second edn. , (2011).
- de Boer, J. G., Provost, S., Gorelick, N., Tindall, K., Glickman, B. W. Spontaneous mutation in lacI transgenic mice: a comparison of tissues. Mutagenesis. 13 (2), 109-114 (1998).
- Huffman, M. D. An improved approximation to-sample poisson test. Appl. Stat. 33 (2), 224-226 (1984).
