Identifiera DNA Mutationer i renat Hematopoietic Stem / progenitorceller

Summary

Här beskriver vi en in vivo-mutagenes-analys för mindre antal renade hematopoetiska celler med Lacl transgen musmodell. Lacl-genen kan isoleras för att bestämma frekvens, plats och typ av DNA-mutanter som spontant uppstått eller efter exponering för genotoxins.

Abstract

Under senare år har det blivit uppenbart att genomisk instabilitet är tätt relaterad till många störningar i utvecklingen, cancer och åldrande. Med tanke på att stamceller ansvarar för att vävnad homeostas och reparation under hela livet, är det rimligt att antaga att stamceller befolkningen är avgörande för att bevara genomisk integritet vävnader. Därför har stort intresse uppstått för att bedöma effekterna av endogena och miljöfaktorer på genomisk integritet i stamceller och deras avkomma, i syfte att förstå etiologin av stamcellsbaserade sjukdomar.

LACI-transgena möss bär en återhämtningsbar λ fagvektor kodande lacl-reportersystem, i vilket lacl-genen tjänar som mutationen reporter. Resultatet av en muterade lacl-genen är framställningen av β-galaktosidas som klyver ett kromogent substrat, vrida den blå. Den Lacl reportersystem är genom jagn alla celler, inklusive stamceller / progenitorceller och kan lätt återvinnas och användas för att därefter infektera E. coli. Efter inkubation infekterade E. coli på agaros som innehåller rätt substrat, kan plack görs, blå plack indikerar en mutant Lacl gen, medan tydliga plack hamn vildtyp. Frekvensen av blå (bland töm) plack indikerar mutantfrekvens i den ursprungliga cellpopulationen DNA extraherades från. Sekvensering av den mutanta lacl-genen kommer att visa placeringen av mutationerna i genen och typen av mutation.

Den LacI transgen musmodell är väl etablerad som en in vivo-mutagenes-analys. Dessutom är de möss och reagensen för analysen är kommersiellt tillgängliga. Här beskriver vi i detalj hur denna modell kan anpassas för att mäta frekvensen av spontant förekommande DNA-mutanter i stamcellsberikade Lin ^– IL7R ^– Sca-1 ⁺ ckit ^{+ +} (LSK)-celler och andra subpopulationer av det hematopoietiska systemet.

Introduction

I de flesta vävnader, differentierade celler har en begränsad livslängd. För att bibehålla funktionell integritet, långlivade, vävnadsspecifika stamceller producerar kontinuerligt stamceller som i sin tur ger upphov till helt differentierade celler som krävs för funktionen av just den vävnad. Stamceller fylla även den egna fack genom en process som kallas självförnyelse. Sålunda stamceller är ansvariga för att upprätthålla den funktionella integriteten hos vävnaden de bor i. Därför är det absolut nödvändigt att de är utrustade med kraftfulla mekanismer för att känna av och eventuellt reparera skadad DNA. Om inte, kan de få flera iska (potentiellt skadliga) störningar, som kan ärvas av deras avkomma. Att förstå hur stamceller värna sin arvsmassa under livslängden för en organism är en viktig fråga och kan hjälpa oss att förstå varför genomisk instabilitet är kopplat till cancer och andra åldersrelaterade sjukdomar (recenserade i ^1,2).

<p class = "jove_content"> Styra genomisk integritet hos en vävnad på nivån för stamceller eller tidiga stamfadercellpopulationer kan uppnås genom att antingen eliminera defekta stammen (eller progenitor) celler genom celldöd, senescens eller differentiering, och / eller genom effektiv reparation av skadad DNA. Nya studier har visat att det är möjligt att mäta vissa typer av DNA-reparation direkt i dessa sällsynta populationer ^3-6. Man har funnit att, till exempel i det hematopoietiska systemet, dubbel-sträng DNA-avbrott kan repareras genom homolog rekombination (HR) eller icke-homologa slut gå (NHEJ), den sistnämnda är en reparationsprocess av lägre trohet och därmed ökad risk för att göra fel. Båda är utnyttjas i hematopoetiska stamceller (HSCs) ^4,5, men i möss verkar det främst NHEJ i HSCs medan tidiga progenitorceller utnyttjar HR ^4. En liknande observation gjordes för stamceller i huden ^6. Intressant i mänskliga HSCs HR, inte NHEJ,verkar vara den mekanism för val reparation av dubbelsträngsbrott ^3. Huruvida detta funktionella skillnaden mellan de två arterna är verklig eller bara representerar en teknisk eller experimentell skillnad återstår att se.

En stamcell repertoar för att reparera skadat DNA kommer troligen att omfatta andra mekanismer för DNA-reparation, som bas excision reparation (BER), nukleotid excision reparation (NER) och mismatch reparation (MMR). BER och NER ansvarar för reparation av enstaka eller flera baspars lesioner i enkelsträngat DNA, medan MMR fixar bas-bas-felparningar och insättning / borttagning loopar; dessa typer av DNA-skador kan inte repareras genom NHEJ eller HR. Stöd detta begrepp finns flera studier från det hematopoetiska systemet visar ett samband mellan förändringar i en av dessa vägar och avvikelser i HSC facket ^7-9, samt en ökad risk att utveckla myelodysplastiskt syndrom ^10-16, en sjukdom som har sitt ursprung iHSC och som har samband med ökad genomisk instabilitet som sjukdomen fortskrider ^17. Än så länge har mätningar av BER, NER, och MMR direkt i HSCs inte rapporterats.

Förutom att belysa de olika processer som styr vävnadsintegritet vid en mekanistisk nivå, är det viktigt att kunna mäta omfattningen av muterat DNA, så att konsekvenserna av avvikelser i en av dessa processer kan testas, till exempel i normala kontra genetiskt iscensatte stamceller eller i gamla kontra unga. Det är emellertid svårt att utveckla en relevant analys på grund av bristen på vävnadsspecifika stamceller och avsaknaden av odlingsbetingelser som bevarar "stemness". Dessutom bör en sådan analys vara möjligt att ändra till miljömässiga och genetiska manipulationer. En möjlig lösning på dessa begränsningar och krav är användningen av musmodeller som är speciellt konstruerade för att detektera DNA-mutationer.

Multiple transgena musmodeller för mutationsdetektion har utvecklats. Exempelvis Lacl transgena möss ¹⁸ bära en återhämtningsbar λ fagvektor kodande lacl-reportersystem, i vilket lacl-genen kodar för en suppressor av lac-operatorn och tjänar såsom mutationen reporter. Efter mutation av lacl-genen, är Lac operatören aktiverad och β-galaktosidas produceras. β-galaktosidas spjälkar det kromogena substratet X-gal (5-brom-4-klor-e-indolyl-β-D-galaktopyranosid), som visar det blå. De cos sajter flankerar Lacl vektorn medger enkel återvinning av lambda fag proteiner och efterföljande infektion av E. coli. Efter inkubation infekterade E. coli på agaros, som innehåller X-gal-substrat, kan plack görs. Blå plack innehåller en förmodad mutant Lac-Jag bär fag, medan tydliga plack hamn icke-mutanter. Frekvensen av blå plack (bland the tydliga ettor) indikerar mutantfrekvens i den ursprungliga cellpopulationen DNA extraherades från. Vidare kan λ-fag som är värd för Lacl målet lätt sekvenseras genom att använda PCR-tekniker för relativt hög genomströmning analys. Sekvense flera muterade Laci gener kommer att avslöja viktig information om mutationen spektrum, vilket i sin tur kan peka på eventuella brister i specifika DNA-reparationsvägar eller till specifika genotoxiska händelser. Den LacI transgena system har standardiserats över flera laboratorier ¹⁹ och reagenser finns i handeln. En stor nackdel med lacl-system är den begränsade förmågan att detektera stora deletioner eller omlagringar, varför andra metoder, t ex multi-color FISH på metafas-spreads behöver användas för att komplettera denna brist.

Inom λ fagvektor av lacl-musmodell, finns det en mycket mindre genen CII, Tillgängliga för mutationsanalys. Dess storlek och det faktum att mutanter kan väljas gör detta till en mindre arbetskrävande och billigare analys ²⁰ än genanalys LacI. Emellertid är lacl-genen mer omfattande studerat för mutagenes ²¹ och känsligheten hos den gen som mutationer har karakteriserats väl, så att det finns en tydlig förståelse av de aminosyrarester som genererar ett fenotypiskt respons på ett kromogent substrat ^22-25.

Andra musmodeller för mutationsdetektion innefattar användningen av X174 eller LacZ-transgener. Den X174 transgen musmodell, med den ursprungliga A: T → G: C återgång mutationsanalys ²⁶ eller framåtmutationstest ²⁷ som medger detektering av ett spektrum av basparsubstitutioner, utgör ett billigare system än Lacl modellen. Emellertid är inte trivialt och mutationen spec mutations skärmen i den främre assaytrum av X174 transgenen inte lika väldefinierad som den hos Lacl. I musmodeller bär LacZ transgener, är LacZ mutations reportern återvinnas utnyttja E. coli-värdceller som är känsliga för galaktos och medium innehållande galaktos ^28. En nackdel med detta system är att återvinning av LacZ mål innebär också restriktionsendonukleasspjälkning följt av ligering och elektroporering av E. coli-värd, vilket gör det svårt att anpassa systemet till ett litet antal celler. Även om det inte är ett absolut krav för att arbeta med stam / progenitor-cellpopulationer (en kan alltid börja med mer möss), om ett stort antal celler erfordras (t ex miljoner eller mer) kommer det snabbt att bli opraktiskt och kostsamt. Även den relativt stora storleken på LacZ, samtidigt som en känslig mutations reporter, är besvärlig och dyrare för DNA-sekvensanalys och determnering av mutationsspektra. En stor fördel med denna modell är dock dess förmåga att upptäcka stora deletioner och insertioner, såväl som chromosomal rearrangements.

Eftersom alla celler i transgena modeller lacl, X174 och LacZ mus bär reportersystem, kan någon av dessa musmodeller användas för mätning av mutagenes i vilken celltyp som helst av intresse, inklusive stam-och stamfaderceller, så länge som de säkert kan skördas och i tillräckligt antal. Eftersom vi hade lång erfarenhet med Lacl musmodell och Lacl mutationstest, beslutade vi att driva detta system vidare för mutagenes analys i hematopoetiska stam-och progenitorceller populationer.

Den hematopoetisk vävnad är väl karaktäriseras i termer av cellytan fenotyp av dess enskilda delar, inklusive långsiktiga återinplantering stamceller, som kan identifieras som den extremt sällsynt population av Lin ^– IL7R <sup> – Sca-1 ⁺ ckit ^{+ +} (LSK) / Flk2 ^– CD150 ⁺ CD48 ^– celler ^29. . Mohrin m.fl. ⁴ visade att något större befolkning LSK/Flk2 ^– celler är fortfarande goda representanter för HSCs och skiljer sig mycket från den mest primitiva engagerade myeloisk progenitorceller (CMP) befolkningen när det gäller att studera DNA-reparation. Dessutom, när HSC-berikade LSK (Flk-2 ⁺ och Flk-2 ^-)-celler jämfört med Lin ^– IL7R ^– Sca-1-ckit ^{+ +} (LS-K progenitorceller), fanns det fortfarande en betydande skillnad i NHEJ förmåga ⁵ mellan det mindre rena, stamcellsberikade LSK befolkningen och progenitorceller. I vår studie använder vi HSC-berikad LSK (Flk-2 ⁺ och Flk-2 ^-) celler eftersom vi funnit att minst 2 x 10 ⁵ celler krävs för konsekventa, tillförlitliga resultat i denna mutagenes analys, denna cell nummer är extremt svårtatt erhålla när en sorterar LSK/Flk2 ^– CD150 ⁺ CD48 population eller ens LSK/Flk2 ^– populationen (i fråga om möss, kostnader och praktiska). Detta protokoll, som bygger på det som ursprungligen utvecklades av Kohler et al. ¹⁸ beskriver i detalj hur den spontana DNA mutantfrekvens kan bestämmas i LSK celler och definierade populationer av differentierade myeloida celler samt osorterat benmärg och mjältceller.

Protocol

Leukocyter från LacI transgena möss på en C57BL / 6 bakgrund uttrycker inte Sca-1 (Figur 1). Därför, om Sca-1 är en markör som används för cellrening, dessa möss måste korsas med en lämplig stam för att få Sca-1 uttryck, i detta protokoll F1 av en korsning mellan vanliga C57BL / 6 (B6) möss och LacI (C57BL / 6) transgena möss (LacI) användes (Figur 1). Av cellpopulationer som används i detta protokoll, LSKs och sådana planer utgör de minsta…

Representative Results

In vivo-mutagenes analys mäter en sällsynt händelse (mutant PFU) bland många händelser (alla PFU). Genom att utföra analysen med litet antal celler är det möjligt att resultatet är det väsentligt påverkas av falskt positiva och falskt negativa resultat. För att behandla denna fråga som vi utförde en serieutspädningsexperiment med ofraktionerat benmärgsceller, skördas från tre olika djur. Vi mätte mutantfrekvens i benmärgen av dessa djur med användning av 1,4 x 10 6, 7,0 x 1…

Discussion

In vivo-mutagenes-analysen beskriven häri baseras på Lacl transgen musmodell ursprungligen genererad av Kohler et al. ¹⁸ Denna modell använder en λ fagvektor som bär en lacl-reportergen. De två cos-ställen som flankerar vektorn möjliggör en relativt enkel återvinning och efterföljande förpackning i infektiösa fagpartiklar, användes för att infektera E. coli. En blå plack kommer att genereras av fag-infekterad E. coli som innehålle…

Materials

LacI transgenic mice	BioReliance Corporation
RecoverEase DNA Isolation Kit, including the RNace-It ribonuclease cocktail	Agilent Technologies (Stratagene)	720202
Transpack Packaging Extract, including the orange and blue transpack tubes and the SCS-8 E. coli	Agilent Technologies (Stratagene)	200221
DNA size standards – lambda ladder	Bio Rad	170-3635
0.025 mM pore size membranes	Fisher (Millipore)	VSWP 025 00
245 mm2 bioassay dishes (trays)	Fisher (Corning)	07-200-600
NZY broth (powder)	Fisher (Teknova)	N1144
Agar	Fisher	BP1423-500
Agarose	Fisher	E-3120-500
N, N-dimethylformamide	Fisher	AC34843-5000
X-gal	Research Products Intl Corp (RPI)	B71800-10.0
Proteinase K	Roche	3-115-852
PCR Extender Taq Polimerase kit	5 PRIME	2200500
Agencourt AMPure XP cleanup kit	Beckman/coulter	A63880