Vi presenterar en förberedelse för att visualisera och manipulera kalciumsignalering i native, intakt mikrokärlendotel. Endothelial rör nyligen isolerade från mus motstånds artärer levererar skelettmuskulaturen behålla in vivo morfologi och dynamisk signalering inom och mellan angränsande celler. Endothelial tuber kan framställas från mikrokärl i andra vävnader och organ.
Styrningen av blodflödet genom motståndet kärl reglerar tillförseln av syre och näringsämnen samtidigt med avlägsnandet av metaboliska biprodukter, som exemplifieras genom att utöva skelettmuskulaturen. Endotelceller (ECS) linje intima av alla motståndsfartyg och tjäna en viktig roll i kontrollen diameter (t.ex. endotelberoende vasodilatation) och därmed omfattningen och fördelningen av vävnad blodflödet. Regleringen av vaskulär resistens av ECS åstadkommes genom intracellulära Ca2 +-signalering, vilket leder till produktion av diffunderbart autakoider (t.ex. kväveoxid och arakidonsyrametaboliter) 1-3 och hyperpolarisation 4,5 att framkalla glatta muskelceller avkoppling. Således förstå dynamiken i endothelial Ca2 +-signalering är ett viktigt steg mot att förstå mekanismerna som styr blodflödet kontroll. Isolera endothelial tuber eliminerar störande variabler i samband med blood i kärlets lumen och med närliggande glatta muskelceller och perivaskulära nerverna, som annars påverkar EG struktur och funktion. Här presenterar vi isoleringen av endothelial rör från den överlägsna epigastrisk artär (SEA) med hjälp av ett protokoll optimerat för detta fartyg.
För att isolera endothelial rör från en sövda mus, är SMB ligeras på plats för att hålla blodet i kärllumen (för att underlätta visualisera det under dissektion), och hela ark magmuskel skärs. Havet är dissekeras fri från omgivande skelettmuskelfibrerna och bindväv, blod spolas från lumen, och mild enzymatisk digerering utförs för att möjliggöra avlägsnande av adventitia, nerver och glatt muskel-celler med användning av mild triturering. Dessa färska isolerade preparat av intakt endotel behåller sitt eget morfologi, med individuell EC förblir funktionellt kopplade till varandra, kunna överföra kemiska och elektriska signals intercellularly genom gap-junctions 6,7. Förutom att ge nya insikter i kalcium signalering och membran biofysik, dessa preparat möjliggör molekylära studier av genuttryck och protein lokalisering inom infödda mikrokärlendotel.
I detta protokoll, beskriver vi isolering av endothelial cell rör från musen SEA. Den SEA uppstår från den interna bröstkorg artären och förnödenheter syresatt blod till den anteriora bukmuskulaturen. Vårt arbete med havet som en modell är hänförlig till det som ger relativt långa, ogrenade mikrokärls segment som är väl lämpade för att studera intercellulära signaler händelser som ligger till grund roll endotelet i styr och samordnar glatta muskelceller avkoppling. För dem som är intresserade av andra än skelettmuskler vävnad, har vi funnit denna teknik för att lätt anpassas för att erhålla endothelial tuber från mikrokärl i hjärnan, tarmen och det lymfatiska systemet.
De viktigaste funktionerna i denna metod är att intakta längder (1-3 mm) av mikrokärlendotel isoleras, säkrade mot ett täckglas i en flödeskammare där de superfuseras med PSS, och avbildas för Ca2 + signalering 7-9 ellerspetsad för elektrisk signalering 6,8. Inom flödeskammaren är den övre halvan av ett rör som utsätts för den superfusionslösningen och reagerar på experimentella ingrepp, medan den nedre halvan (i kontakt med täckglas) skyddas och förblir stilla. Förutom att studera både intra-och intercellulära Ca2 + signaleringshändelser kan endotela tuber användas för kvantitativ realtids-PCR för att utvärdera genuttryck 6,10, immunhistokemi för att undersöka proteinuttryck 6,10, och elektrofysiologiska studier att definiera biofysiska egenskaper av elektrisk ledning 6,11.
Det finns flera fördelar med att endothelial rör förberedelse för att studera endotelfunktion det. Först är att isoleringsprocessen ger en enkel distinktion mellan två cellpopulationer: endotelceller (som finns kvar i röret bildning) och glatta muskelceller (individuellt dissocierade, vanligtvis "C" formad näravslappnad). Detta möjliggör selektiv provtagning och undersökning av unika egenskaper som ligger bakom respektive celler bidrag till fartygets funktion. För det andra möjliggör denna modell lösningen av signaleringshändelser inneboende till endotelet, oberoende av påverkan av blodflödet, omgivande glatta muskler, nerver och parenkymet. För det tredje är den endotel studerades medan nyisolerade och därigenom undvika förändringar i gen-eller proteinexpression associeras med cellkultur.
Här beskriver vi isoleringen av endothelial rör från SEA och användningen av detta preparat för att visualisera Ca2 + signalering händelser inom sitt konstituerande EC. Detta förfarande var anpassad från en ursprungligen utvecklades för att isolera endothelial rör från arterioler i hamster kremastermuskeln 8. Använda mindre ändringar av de tekniker som presenteras här, har vi isolerat endothelial rör från en mängd olika kärlbäddar, inklusive: foder artärerna i hamster upprullningsdon muskler och kinden påse arterioler 10, mus överlägsen epigastrisk artär 6,7,9, mus mesenterial och cerebral artärer och lymfatiska mikrokärl (opublicerade observationer, referenser ingår för att isolera mesenteriala kärl 12 och cerebrala kärl 13). Isolera endothelial rör från nya kärlbäddar kan kräva ändringar i det ursprungliga protokollet. Om isolering inte lyckas, är det bäst att börja med att förändra uppslutningstider:Öka uppslutningstiden om endoteliala rören är svåra att isolera från glatta muskelceller och adventitia och reducera koktiden om den endoteliala röret inte förblir intakt. Om förändra uppslutningstider misslyckas, justering av koncentrationen av matsmältningsenzymer eller rötningstemperaturen bör prövas. Ett annat alternativ är att minska den inre diametern hos den triturering pipett, vilket ökar skjuvkraften vid avlägsnande av glatta muskelceller. En ökning av hastigheten för fluidum utskjutning kan också prövas för samma effekt men är mer benägna att skadas beredning. Det ska erkännas att det inte alltid är möjligt att isolera intakta endotelceller rör från fartyg där endotelceller inte är väl förbundna med varandra genom Junktional proteiner.
Dissociation av glatta muskelceller efter enzymatisk spjälkning inledningsvis utfördes med användning av en hand-stil pipett 8. Vi har förfinat pulverisering proceduren med en microsyrInge-systemet, vilket har möjlig konsekvent isolering av längre endothelial rör (upp till 3 mm) 6. Vid användning av detta system, är triturering pipetten återfylls med mineralolja för att åstadkomma en kontinuerlig vätskepelaren mellan kolven kontrollerande fluidrörelse och PSS innehållande kärlsegmentet. Den incompressibility av vätska tillsammans med den ständiga drivkraften i mikroskolv ger konstant skjuvning som fartyget tvingas genom pipettspetsen. Däremot handtekniker används ofta för dissocierande celler (t.ex. klämma gummikolven vid slutet av en Pasteur-pipett) involverar komprimering av luft, som introducerar variationer i drivtrycket och därigenom skjuvning utövas på pipettspetsen.
Det finns flera fördelar med att röret förberedelse för att studera endotelfunktion i mikrokärl. Den första är att isoleringsprocessen ger tydliga homogena interna cellulära populationer av EC och smidig muscle celler. Eftersom EC vara fysiskt ansluten som rör, de skiljer sig från enskilda glatta muskelceller, som behåller en "C"-konfiguration, om de förblir avslappnad under rivning. Således respektive celltyper lätt urskiljas, t.ex. när få prover för molekylära tekniker såsom realtids-PCR och immunohistokemi 10. Eftersom flera rör är isolerade från ett enda kärl (eller från bilaterala fartyg som gjort för SMB), kan molekylära data och funktionella uppgifter erhållas från samma fartyg i ett visst djur. Sålunda molekyluttryck kan korreleras med den funktionella beteende mikrovaskulära endotel. Vidare kan signaleringshändelser både intra-och intercellulära inneboende till mikrokärlendotel lösas oberoende från påverkan av hemodynamiska krafter (tryck, flöde), vasoaktiva ämnen transporteras i blodet (t.ex. hormoner), eller från omgivande glatta muskelceller (t.ex.60, via myoendothelial koppling 14-16), nerver 17, eller vävnads parenkymet 18.
Huvudsakligen eftersom endotelet är nyisolerade från utsedda mikrokärl, det finns ingen förändring av fenotyp som annars är associerad med odlingen EC 19-21. Till exempel, odlade EC förlorar muskarinreceptor uttryck och därmed ändra sina kalciumsignalerprofiler. Vidare kan elektrofysiologiska egenskaper hos EC förändring i kultur 22. Eftersom enskilda EC förblir kopplade genom funktionella gap junction-kanaler, den endothelial röret utgör en idealisk modell för att studera ledning av elektriska och Ca 2 +-signaler mellan celler 6,7. Det bör också vara medveten om att de dissocierade glatta muskelceller lätt studeras med patch-clamp teknik för kompletterande uppgifter som ligger till grund mikrovaskulära funktion 23.
En viktig begränsning av endothelial röret mOdel är instabiliteten av preparatet med ökande temperatur. Medan våra förberedelser från SMB har visat stabil och sund vid rumstemperatur (~ 24 ° C) och under flera timmar vid 32 ° C, morfologisk och funktionell försämring inträffar i mindre än en timme vid 37 ° C 9. En annan viktig begränsning av endothelial röret är förlusten av myoendothelial korsningar och deras inneboende signaleringsdomäner som är sammanbyggda till EG-funktion i den intakta kärlväggen 14-16. Det bör också vara medveten om att, medan längre rör möjliggör intercellulära signaler studeras över relativt stora avstånd 6, förberedelse av rör är komplicerat eftersom de får längre eftersom det blir svårare att helt ta avstånd omgivande glatta muskelceller och adventitia. Vi har funnit att rören är längre än 1-2 mm är också svårare att placera och säkra i flödet kammaren. Däremot, medan kortare rör (t.ex. <1 mm) ENAble Ca 2 + och elektriska signaler som skall studeras åtta, de är svåra att underhålla under superfusion i flödeskammaren. Slutligen, även med optimal isolering av rör bilateralt, finns det inte tillräckligt underlag för traditionell kvantifiering av proteinuttryck med hjälp av Western blot, men immunomärkning ger ett index på proteinuttryck och lokalisering. Trots dessa begränsningar utgör den endoteliala röret en ny beredning för att åstadkomma ny insikt i mekanismerna för mikrovaskulära endotelcell-funktion in vivo.
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar Dr Pooneh Bagher och Dr Erika Westcott för redaktionella kommentarer i utarbetandet av manuskriptet. Detta arbete stöddes av National Heart, Lung and Blood Institute of National Institutes of Health i tilldelningsnummer R37-HL041026 och R01-HL086483 till SSS-och F32-HL107050 till MJS. Detta innehåll är ensamt ansvarig för författare och inte nödvändigtvis representerar officiella ståndpunkter National Institutes of Health.
Sodium Chloride | Fisher | S642-212 | |
Potassium Chloride | Sigma | P9541 | |
Magnesium Sulfate | Sigma | M2643 | |
Calcium Chloride | Sigma | C1016 | |
Sodium Nitroprusside | Sigma | 431451 | |
Bovine Serum Albumin | USB Products | 9048-46-8 | |
Papain | Sigma | P-4762 | |
Collagenase | Sigma | C-8051 | |
Dithioerythritol | Sigma | D-8255 | |
Boroscilicate Glass (Cannulation and Pinning Pipettes) | Warner Instruments | G150-4 | |
Boroscilicate Glass (Trituration Pipettes) | World Precision Instruments | 4897 | |
Nanoliter Injector Microsyringe | World Precision Instruments | B203MC4 | Updated to Nanoliter 2010 from Nanoliter 2000 |
Micro4 Controller | World Precision Instruments | SYS-MICRO4 | |
12 mm x 75 mm Culture Tubes | Fisher | 14-961-26 | |
3-Axis Micromanipulator | Siskiyou Corp | DT3-100 | Holding and positioning the pinning pipettes |
Flow Chamber | Warner Instruments | RC-27N | |
100-1,000 µl Pipette | Eppendorf | 3120000062 | For transferring digested vessel segment to the flow chamber |
1 ml Pipette Tips | Fisher | 02-707-405 | For transferring digested vessel segment to the flow chamber |
Upright Microscope | Olympus | BX51W1 | The actual microscope is up to the user |
Spinning Disc Confocal System | Yokogawa | CSU-X1 | Confocal imaging is optional |
XR/TURBO EX Camera | Stanford Photonics | XR/TURBO EX | Ideal for our needs; may vary with user |
Piper Control Software | Stanford Photonics | Imaging software for TURBO EX camera | |
Stereo Microscrope | Leica | MZ8 | may vary with user |
Sylgard | Dow Corning | 184 | |
Microdissection Scissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
Dumont Forceps | Fine Science Tools | #5/45 | |
Minutiens Insect Pins | Austerlitz | M size 0.15 mm | |
GP Millipore Express PLUS Membrane | Millipore | SCGPT05RE | |
Pipette Scoring Device | Austin Flameworks | Small Handheld Scoring Tool | austinflameworks.com |
Compact Pet Trimmer | Wahl Clipper Corp. | Model 9966 | Clean well after each use to maintain life |