Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

وكشف عن المنظمة هيكل الخلية من خلايا سرطان الغازية في 3D

Published: October 26, 2013 doi: 10.3791/50763
Automatic Translation
1, 1, 1
1UMR 144 CNRS, Institut Curie

Summary

تقدم هذه المقالة طريقة لتسمية fluorescently الكولاجين التي يمكن استخدامها لمزيد من الإصلاح على حد سواء والتصوير الحي من الثقافات الخلية 3D. كما نقوم بتوفير بروتوكول الأمثل لتصور البروتينات هيكل الخلية الذاتية من الخلايا المستزرعة في بيئات 3D.

Abstract

وقد جرت العادة على دراسة الهجرة الخلية في ركائز 2D. ومع ذلك، فقد أصبح من الواضح بشكل متزايد أن هناك حاجة لدراسة الهجرة خلية في بيئات 3D أكثر ملاءمة، التي تشبه بشكل أفضل الأبعاد من العمليات الفسيولوجية في السؤال. الخلايا المهاجرة يمكن أن تختلف إلى حد كبير في التشكل، ووضع الهجرة اعتمادا على ما إذا كانت تتحرك على ركائز 2D أو 3D. ونظرا للصعوبات التقنية وعدم التوافق مع بروتوكولات معظم القياسية، التحليل البنيوي والوظيفي للخلايا جزءا لا يتجزأ من داخل المصفوفات 3D لا يزال من غير المألوف. توضح هذه المقالة الطرق لإعداد وتصوير 3D الثقافات الخلايا السرطانية، إما كخلايا مفردة أو الأجسام الشبه الكروية. باعتبارها الركيزة ECM المناسبة للهجرة الخلايا السرطانية، ونحن نستخدم nonpepsinized الفئران الكولاجين ذيل أنا بلمرة في درجة حرارة الغرفة وfluorescently المسمى لتسهيل التصور باستخدام المجاهر مبائر القياسية. ويشمل هذا العمل أيضا protocرأ لوضع العلامات مناعي 3D من الهيكل الخلوي الخلية الذاتية. استخدام هذه البروتوكولات ونحن نأمل أن تسهم في وصف أفضل من التركيب الجزيئي، التعريب، ومهام الهياكل الخلوية في 3D.

Introduction

مجال الهجرة الخلية وقد تحدوا في العلامة التجارية الجديدة في العالم الثالث الأبعاد. فمن بديهية لدراسة الهجرة الخلية في بيئة التي تمثل الأكثر تطابقا واحد الفسيولوجية، وبالتالي، ثلاثي الأبعاد (3D). ومع ذلك، بسبب القيود التقنية، أجريت دراسات الهجرة الأكثر خلية تحليل حركة الخلية عبر ثنائية البعد (2D) ركائز صلبة، إما غير المعالجة أو المغلفة مع البروتينات المصفوفة خارج الخلية المناسب (ECM).

الدراسات الأولى مخصصة لهجرة الخلية في ثلاث السياج الكولاجين الأبعاد أعود أكثر من 20 عاما 1-3. ومع ذلك، فقط على مدى السنوات ال 5 الماضية أصبح من الواضح أن الخلايا المهاجرة يمكن أن تختلف إلى حد كبير في التشكل، ووضع الهجرة اعتمادا على أبعاد من الركيزة. في 2D، وخلايا الاتصال فقط الركيزة مع سطحها البطني باستخدام الالتصاقات البؤرية، مما أدى إلى تشكيل نتوءات مسطحة عريضة (أقدام صفاحية) معجزءا لا يتجزأ من الإصبع تشبه نتوءات (أرجل كاذبة خيطية) في قدرتها الرائدة. هذه الهياكل، جنبا إلى جنب مع الألياف الإجهاد التي تربط الجبهة الخلية إلى الحافة، ويعتقد أن تكون حاسمة بالنسبة لحركة الخلية في 2D. في المصفوفات 3D، والخلايا عادة ما تكون أكثر ممدود، مع سطح الخلية بأكملها الاتصال ECM، مما تسبب تغييرات كبيرة في تشكيل وصلة وظيفية لكثير من هذه الهياكل. وعلى العكس، ملامح الخلوية الأخرى تكتسب أهمية في الهجرة 3D، مثل تشوه والهياكل النووية تشارك في إعادة عرض ECM 4.

على الرغم من هذه التغيرات المورفولوجية المعروفة، فضلا عن الاختلافات في طرق الهجرة 5-7، والتي يمكن أن تختلف تبعا لECM وأنواع الخلايا، التحليل البنيوي والوظيفي للخلايا جزءا لا يتجزأ من داخل المصفوفات 3D لا يزال غير عادية. العمل مع سميكة وكثيفة المصفوفات 3D يحمل الصعوبات الفنية، مثل التصوير المجهري عالية الدقة، وعدم التوافق مع معظم ستابروتوكولات ndard الأمثل للثقافات 2D، مثل وضع العلامات مناعي من البروتينات الذاتية. أيضا، لأن استخدام المصفوفات 3D هو نهج جديد نسبيا، والباحثين مازالوا يحققون أفضل الظروف لتشبه محددة في حالات الجسم الحي، مثل الهندسة المعمارية انسجة طبيعية من الأنسجة المختلفة أو أجهزة المنظمة ECM حول الورم. تناقضات في النتائج من قبل مجموعات مختلفة فيما يتعلق، على سبيل المثال، قد ولدت وسائط الخلايا السرطانية من الهجرة أو وجود الالتصاقات البؤرية، بعض الجدل 8. وهناك الكثير من الجهد فقد تم تخصيص مؤخرا للتوصل إلى توافق في الآراء من حيث ECM الكيميائية طبيعة وحجم المسام، وسمك الألياف، وتصلب المصفوفة. وتستخدم حاليا العديد من أنواع مختلفة من موبينيل 3D، تتفاوت من خلية إلى مصفوفات المستمدة matrigel المتاحة تجاريا، والكولاجين البقري pepsinized أنا، أو nonpepsinized ذيل فأر الكولاجين I. كل من هذه المصفوفات له خصائص فيزيائية وكيميائية محددة، ويحتاج المرء إلى العالقاتالشركة المصرية للاتصالات مصفوفة من خيار لعملية الفسيولوجية التي تجري دراستها. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن حجم المسام وسماكة الألياف تعتمد على ظروف البلمرة، مثل الرقم الهيدروجيني ودرجة الحرارة 9،10. يمكن الربط إلى والمسافة من ركائز صلبة مثل الزجاج، وأيضا تغيير خصائص المرونة في مصفوفة 10،11.

توضح هذه المقالة الطرق لإعداد وتصوير 3D الثقافات الخلايا السرطانية، إما كخلايا مفردة أو الأجسام الشبه الكروية. وقد سبق وصف طرق لجعل الأجسام الشبه الكروية الخلايا السرطانية، وأكثرها شعبية يجري عملية الشنق قطرة أسلوب 12،13 وطريقة لوحة الاغاروز المغلفة 14. باعتبارها الركيزة ECM المناسبة للهجرة الخلايا السرطانية، ويستخدم nonpepsinized الفئران الكولاجين ذيل أنا بلمرة في درجة حرارة الغرفة في 2 ملغ / مل. Nonpepsinized الكولاجين حمض المستخرج أنا من ذيل الفئران يحتفظ كل من N-C ومحطة telopeptides، أجزاء nonhelical للجزيء الكولاجين المسؤولة عن الأم الكولاجين intermolecيشابك جزيئية والاستقرار fibrilar 15. معا، وهذه الظروف تسمح بتشكيل شبكات الكولاجين التي تشبه أوثق تلك التي لوحظت في الجسم الحي 10. للسماح التصور من ألياف الكولاجين، سواء في الثقافات الثابتة والمعيشة، ويتم توفير بروتوكول مفصلة لتسمية fluorescently الكولاجين في المختبر باستخدام 10 5 - (و-6)-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA)، succinimidyl استر. وقد تم تكييف هذا البروتوكول من Baici وآخرون. 16،17، حيث يتم استخدام فلوريسئين ثيوسيانات لتسمية جزيئات الكولاجين القابل للذوبان. كما فلوريسئين، TAMRA هو صبغة الفلورسنت الأمينية المتفاعل أن يتفاعل مع nonprotonated الأليفاتية المجموعات الأمينية للبروتينات، مثل مجموعة الأمينية الحرة في N-محطة، والأهم، والمجموعة الأمينية من الجانب lysines. رد الفعل هذا لا يحدث إلا في درجة الحموضة الأساسية، عندما يكون للمجموعة الأمينية ليسين في شكل nonprotonated. بالإضافة إلى TAMRA كونها أكثر استقرارا من خلال فلوريسئينالوقت، أطياف الانبعاثات ليسقط على نطاق برتقالي / أحمر (م ت / م = 555/518 نانومتر)، والتي يمكن دمجها بشكل مفيد لتصوير الخلايا الحية من البروتينات GFP الموسومة. باستخدام الكولاجين للذوبان جزيئات المسمى مع الأصباغ الأمينية التفاعل لا يؤثر على عملية البلمرة ولا كثافة، حجم المسام وحالة يشابك من المصفوفة الكولاجين 10،16،18،19.

ويشمل هذا البروتوكول أيضا وسيلة لوضع العلامات مناعي 3D من البروتينات الذاتية، التي تم تحسين أخرى لتسمية الهيكل الخلوي أو البروتينات المرتبطة الهيكل الخلوي. التركيز النهائي من هذا البروتوكول هو على طرق للحصول على الصور عالية الدقة من الثقافات 3D باستخدام المجهر متحد البؤر مع انخفاض مساهمة من coverslips الزجاج جامدة على التوتر مصفوفة الكولاجين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. TAMRA-الكولاجين أنا وصفها

  1. إعداد 10 ملغ / مل حل TAMRA عن طريق إضافة 2.5 مل DMSO إلى توفير 25 ملغ مسحوق TAMRA. حله قبل vortexing حتى حل كامل. المحل في -20 درجة مئوية وحمايتها من الضوء.
  2. إعداد 2 لتر من وصفها العازلة (0.25 M NaHCO 3، 0.4 M كلوريد الصوديوم). ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 9.5 باستخدام 10 M حل من هيدروكسيد الصوديوم. الحفاظ على 4 درجة مئوية. من هذه النقطة، يتم تنفيذ جميع العمليات خارج في 4 º C ما لم ينص على خلاف ذلك هو مادي والفلورسنت محمية من الضوء باستخدام رقائق الألومنيوم.
  3. ملء الحقنة 1 مل مع 1 مل من مركزة للغاية ذيل فأر الكولاجين أنا الحل. وعادة ما يتم توفير حلول عالية الكولاجين تركيز بتركيزات حوالي 10 ملغ / مل و هي لزجة جدا. تأكد من التلاعب به ببطء لتجنب تشكيل فقاعات الهواء.
  4. باستخدام 21 G إبرة تحت الجلد، حقن الكولاجين في presoaked 3 مل غسيل الكلى كاسيت من 10،000 قطع MWCO قبالة. توخي الحذر لتجنب داماجينج الغشاء مع الإبرة. إزالة كل الهواء من راديو كاسيت غسيل الكلى عن طريق سحب ما يصل المكبس المحاقن. Dialyze بين عشية وضحاها ضد 1 L من الاحتياطي وصفها.
  5. مزيج 100 ميكرولتر من 10 ملغ / مل حل TAMRA مع 900 ميكرولتر من الاحتياطي وصفها. ملاحظة: يجب أن يتم ذلك مع كل حل TAMRA والعازلة وصفها في درجة حرارة الغرفة منذ DMSO يتجمد عند 4 درجة مئوية. بعد الخلط، وجلب الحل TAMRA المخفف مرة أخرى إلى 4 درجة مئوية.
  6. بعناية إزالة الكولاجين من كاسيت لغسيل الكلى باستخدام الحقنة 2 مل مع 21 G إبرة تحت الجلد. مزيج 1 مل من محلول الكولاجين مدال مع 1 مل من محلول TAMRA المخفف بواسطة pipetting.
  7. نقل الكولاجين / TAMRA المزيج في أنبوب microcentrifuge 2 مل واحتضان بين عشية وضحاها مع التناوب.
  8. نقل مل 2 من الكولاجين TAMRA المسمى إلى presoaked 3 مل كاسيت غسيل الكلى وdialyze بين عشية وضحاها ضد 1 لتر من وصفها الواق لإزالة الزائدة من الصبغة مجانا.
  9. لاستعادة TAMRA-LABالكولاجين إليد إلى حل الكولاجين الأصلية، ضع كاسيت غسيل الكلى في 1 لتر من 0.2٪ (V / V) محلول حمض الخليك، ودرجة الحموضة 4، وdialyze بين عشية وضحاها.
  10. قياس الحجم النهائي من الكولاجين TAMRA المسمى وحساب تركيز النهائي، بالنظر إلى حجم الأولية وتركيز المحلول المستخدم الكولاجين. تخزينها في 4 درجة مئوية.

2. 3D مصفوفات TAMRA الكولاجين مع الخلايا واحدة جزءا لا يتجزأ من

  1. حساب حجم 2 ملغ / مل TAMRA-الكولاجين ميكس اللازمة للتجربة. إعداد دائما 20٪ أكثر لحساب pipetting لخسائر بسبب اللزوجة العالية الكولاجين.
  2. إعداد محلول المخزون من برنامج تلفزيوني 10X و1 N هيدروكسيد الصوديوم. فلتر تعقيم والمحافظة على 4 درجة مئوية. من هذه النقطة، يتم تنفيذ جميع العمليات خارج على الجليد ما لم ينص على خلاف ذلك، وتحت ظروف معقمة.
  3. مزيج PBS 10X و1 N هيدروكسيد الصوديوم بكميات مناسبة لتحقيق تركيز الكولاجين المطلوب ودرجة الحموضة 7.4. على سبيل المثال، للحصول على الحجم النهائي من 1 ملمن TAMRA-الكولاجين المزيج في درجة الحموضة 7.4، والجمع بين 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 10X مع 5 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم 1N. تخلط جيدا.
  4. إضافة كميات مناسبة من كل من الكولاجين TAMRA المسمى الكولاجين وغير المسماة في نسبة 01:06 لتحقيق ما مجموعه تركيز الكولاجين النهائي من 2 ملغ / مل. على سبيل المثال، للحصول على الحجم النهائي من 1 مل من 2 ملغ / مل TAMRA-الكولاجين ميكس، إضافة 90.48 ميكرولتر من 3.68 ملغ / مل الكولاجين TAMRA المسمى و415.71 ميكرولتر من 4.01 ملغ / مل من الكولاجين غير المسماة. تخلط جيدا وببطء من قبل pipetting، وتجنب تشكيل فقاعات الهواء.
  5. إضافة الخلايا علقت في حجم مناسب من المتوسط ​​الخلية المبردة دون FBS إلى المزيج TAMRA-الكولاجين للحصول على كثافة الخلية النهائي من 10 5 خلية / مل وتركيز الكولاجين النهائي من 2 ملغ / مل. على سبيل المثال، ل1 مل من 2 ملغ / مل TAMRA-الكولاجين ميكس، إضافة 388،81 ميكرولتر من وسائل الإعلام التي تحتوي على 10 5 خلايا. تخلط جيدا وببطء من قبل pipetting، وتجنب تشكيل فقاعات الهواء. تأكيد درجة الحموضة عن طريق اختبار 10 ميكرولتر من مزيج على الرقم الهيدروجيني اختبار قرحلة.
  6. ماصة 100 ميكرولتر من قطرات TAMRA-الكولاجين ميكس على أطباق أسفل الزجاج والسماح لها تتبلمر في درجة حرارة الغرفة لمدة 30-45 دقيقة. 100 قطرات الكولاجين ميكرولتر ويبلغ قطرها نموذجية من 7 ملم ومرتفعة 2 مم. عندما بلمرة، يتحول إلى هلام الكولاجين الأبيض العش. ملاحظة: ستكون السماح للالكولاجين لبلمرة دون إغلاق طبق تجنب تشكيل الفيلم المياه حول انخفاض الكولاجين، والحد من مفرزة من الزجاج. لزيادة الالتزام، يمكن أن تطلى أطباق الزجاج مع بولي-L-يسين في 100 ميكروغرام / مل.
  7. بعناية إضافة مستنبت كافية لتغطية قطرات الكولاجين / خلية. تجنب تدفقات عالية من وسائل الإعلام أو حركات مفاجئة منذ قطرات الكولاجين يمكن فصل بسهولة. الحفاظ على 37 º C في 10٪ CO 2 مرطب الهواء ما يكفي من الوقت للخلايا لترحيل في المصفوفة (عادة 1-3 أيام).

3. 3D مصفوفات TAMRA الكولاجين مع الأجسام الشبه الكروية الخليوي جزءا لا يتجزأ من

  1. حساب حجم 2 ملغ / مل TAMRA-الكولاجين Mتاسعا اللازمة للتجربة. إعداد دائما 20٪ أكثر لحساب pipetting لخسائر بسبب اللزوجة العالية الكولاجين.
  2. إعداد محلول المخزون من برنامج تلفزيوني 10X و1 N هيدروكسيد الصوديوم. فلتر تعقيم والمحافظة على 4 درجة مئوية. من هذه النقطة، يتم تنفيذ جميع العمليات خارج على الجليد ما لم ينص على خلاف ذلك، وتحت ظروف معقمة.
  3. مزيج PBS 10X، 1 N هيدروكسيد الصوديوم وسائل الإعلام خلية دون FBS في أحجام مناسبة لتحقيق تركيز الكولاجين المطلوب ودرجة الحموضة 7.4. على سبيل المثال، للحصول على الحجم النهائي من 1 مل من TAMRA-الكولاجين المزيج في درجة الحموضة 7.4، والجمع بين 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 10X، 5 ميكرولتر من 1 N هيدروكسيد الصوديوم و388.81 ميكرولتر من وسائل الإعلام. تخلط جيدا.
  4. إضافة كميات مناسبة من كل من الكولاجين TAMRA المسمى الكولاجين وغير المسماة في نسبة 01:06 لتحقيق ما مجموعه تركيز الكولاجين النهائي من 2 ملغ / مل. على سبيل المثال، للحصول على الحجم النهائي من 1 مل من 2 ملغ / مل TAMRA-الكولاجين ميكس، إضافة 90.48 ميكرولتر من 3.68 ملغ / مل الكولاجين TAMRA المسمى و415.71 ميكرولتر من 4.01 ملغ / مل من جيش التحرير الوطني الأوغنديالكولاجين beled. تخلط جيدا وببطء من قبل pipetting، وتجنب تشكيل فقاعات الهواء. تأكيد درجة الحموضة عن طريق اختبار 10 ميكرولتر من مزيج على اختبار الرقم الهيدروجيني قطاع.
  5. ماصة 100 ميكرولتر من قطرات TAMRA-الكولاجين ميكس على أطباق أسفل الزجاج والسماح لها لبدء البلمرة لمدة 2-5 دقيقة. هذا سوف يساعد على منع غرق الأجسام الشبه الكروية عن طريق زيادة طفيفة في اللزوجة هلام. 100 قطرات الكولاجين ميكرولتر ويبلغ قطرها نموذجية من 7 ملم ومرتفعة 2 مم.
  6. جمع كروي الخلية ووضعه على طبق بيتري نظيفة. إزالة أي فائض من السائل و resuspend في 10 ميكرولتر من TAMRA-الكولاجين المزيج. وهذا أمر مهم لمنع التخفيف من الكولاجين مع وسائل الاعلام الخلية.
  7. باستخدام ماصة P20، وجمع الكولاجين علقت كروي ووضعه على رأس مركز للميكرولتر TAMRA-الكولاجين انخفاض مزيج 100. ملاحظة: لا تضع كروي أكثر من واحد من كل قطرة ماء الكولاجين، لأنها يمكن أن تؤثر على كل القدرات الأخرى لغزو و / أو الهجرة.
  8. السماح للمزيج TAMRA-الكولاجين لبوليmerize في درجة حرارة الغرفة لمدة 30-45 دقيقة. عندما بلمرة، يتحول إلى هلام الكولاجين الأبيض العش. ملاحظة: ستكون السماح للالكولاجين لبلمرة دون إغلاق طبق تجنب تشكيل الفيلم المياه حول انخفاض الكولاجين، والحد من مفرزة من الزجاج. لزيادة الالتزام، يمكن أن تطلى أطباق الزجاج مع بولي-L-يسين في 100 ميكروغرام / مل.
  9. بعناية إضافة مستنبت كافية لتغطية الكولاجين / قطرات الأجسام الشبه الكروية. تجنب تدفقات عالية من وسائل الإعلام أو حركات مفاجئة منذ قطرات الكولاجين يمكن فصل بسهولة.
  10. الحفاظ على 37 º C في 10٪ CO 2 مرطب الهواء ما يكفي من الوقت للخلايا لغزو / تهاجر في المصفوفة (عادة 1-3 أيام).

4. تلوين المناعي 3D

  1. إزالة بعناية وسائل الإعلام خلية وشطف المصفوفات تحتوي على خلايا الكولاجين / الأجسام الشبه الكروية مع برنامج تلفزيوني.
  2. إصلاح في وقت واحد واستخراج الخلايا التي يحتضنها مع استخراج / تثبيت العازلة (PFA 4٪، 0.3٪ تريتون X-100، والسكروز 5٪ في PBS) لمدة 5 دقائق. تكملة المخزن المؤقت مع 2 ميكرومتر Phalloidin و 2 ميكرومتر تاكسول لرؤية الهيكل الخلوي أو البروتينات المرتبطة الهيكل الخلوي.
  3. مزيد من إصلاح الخلايا مع PFA 4٪، والسكروز 5٪ في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة. شطف مع 0.05٪ توين-20 في برنامج تلفزيوني.
  4. إعداد حلول الأجسام المضادة الأولية في برنامج تلفزيوني. احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الأولية لا يقل عن 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية. تأكد من إضافة حل ما يكفي لتغطية انخفاض الكولاجين بأكمله. ل35 مم طبق أسفل الزجاج، وسوف 1.5-2 مل من محلول يكون ضروريا. ملاحظة: لتقليل حجم محلول الأجسام المضادة، وهو حاجز غير قابل للذوبان المياه، مثل خط دائرة الشحوم سيليكون أو حلقة PDMS، يمكن وضعها حول انخفاض الكولاجين.
  5. غسل 3X 30 دقيقة مع 0.05٪ توين-20 في برنامج تلفزيوني.
  6. إعداد الأجسام المضادة الثانوية مترافق اليكسا، اليكسا phalloidin مترافق والحلول دابي في برنامج تلفزيوني. احتضان الخلايا مع الأجسام المضادة الثانوية المناسبة لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  7. غسل 3X 30 دقيقة مع 0.05٪ توين-20 في برنامج تلفزيوني.
  8. إزالة الزائدة من السوائل، إضافة ما يكفي من تصاعد وسائل الإعلام لملء الزجاج أسفل قاع الطبق (حوالي 500 ميكرولتر) ووضع 24 ملم ساترة على رأس لختم. لا تضغط باستمرار على ساترة لتجنب ضغط انخفاض الكولاجين والإضرار منظمة 3D.

5. التصوير عينة

المجاهر مبائر القرص الكلاسيكية أو الغزل يمكن استخدامها. يجب تفضيلي نظام مقلوب أن تستخدم لتحديد المسافة من الخلايا المصورة من أسفل الزجاج. النظام المستخدم لهذا العمل هو القرص غزل متحد البؤر مقلوب مجهزة 40X/1.3NA والأهداف النفط الغمر 60X/1.4NA (العمل مسافات 200 ميكرون و 130 ميكرون، على التوالي)، وCoolSNAP كاميرا HQ2 Photometrics 1392 X 1040 مجموعة التصوير، 6.45 X 6.45 ميكرون بكسل والتي تسيطر عليها Metamorph برامج التصوير. وعادة ما تستخدم 405 نانومتر، 491 نانومتر، 561 نانومتر، و 633 نانومتر ليزر في السلطة 30-50٪، والحصول على 1 وbinning من 2× 2 للحد من التعرض مرات. وقد تم تجهيز المجهر أيضا مع مصباح الزئبق ومكعبات مرشح للدابي (غير شامل 400-418 نانومتر؛ م 450-465)، FITC (غير شامل 478-495؛ 510-555 م) وتكساس الأحمر (غير شامل 560-580؛ EM 600 -650) لاستخدامها مع قطعة العين.

  1. باستخدام مصباح الفلورسنت، ووضع الهدف 40X في منتصف انخفاض الكولاجين. الحصول على لمحة عامة عن العينة، سواء في محور XY وفي المحور Z. تأكد من عدم تحيد أكثر من 100 ميكرون من حافة هلام على محور س ص عند الحصول على الصور لتجنب آثار الحافة. عندما الأجسام الشبه الكروية التصوير، والتأكد من أنها تعمل في إطار مسافة الهدف. تغيير الهدف إذا كان ذلك مناسبا.
  2. التبديل إلى وضع التصوير الحي متحد البؤر. باستخدام الليزر نانومتر 561 لتصور الكولاجين TAMRA المسمى، بدءا من القاع الزجاجي تحديد قيمة Z في ألياف الكولاجين التي تبدأ في الظهور. هذا هو الجزء السفلي الركيزة و z = 0.
  3. باستخدام مقبض التركيز، وترتفع 100 ميكرون من Z = 0. الخلايا فقط في ض = 100 ميكرونأو أعلاه ينبغي تصويرها لتجنب آثار التوتر من أسفل الزجاج جامدة.
  4. تحديد الخلايا إلى صورة. تحسين مرات التعرض الكاميرا وقوة الليزر لكل طول موجي. مرات التعرض نموذجية للدابي واليكسا-488 Phalloidin ما بين 100-200 ميللي ثانية. قد تختلف أوقات التعرض لتلوين الأجسام المضادة.
  5. على طريقة العيش متحد البؤر باستخدام الليزر المناسب لتصور تلطيخ Phalloidin وباستخدام مقبض التركيز، وتحديد الفترة سلسلة Z من خلال وضع أعلى وأسفل القيم Z إلى الحالي.
  6. تحديد حجم Z-الخطوة. لتحقيق أهداف 40X، واستخدام 1 ميكرون. ل60X، استخدم 0.5 ميكرون. بدء الاستحواذ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وسم الفئران الذيل الكولاجين أنا مع TAMRA يسمح للإعداد سهلة والتصور شبكات الكولاجين 3D. البلمرة بطيئة في النتائج درجة حرارة الغرفة في تشكيل شبكات الكولاجين مع منظمة مماثلة لتلك التي وجدت في الجسم الحي 10.

هنا نقدم بروتوكول للتلوين المناعي من الهيكل الخلوي للخلايا السرطانية CT26، على حد سواء كما الأجسام الشبه الكروية وشكل خلايا مفردة. لأفضل الحفاظ على الهيكل الخلوي، وتستكمل مخازن مع phalloidin الخالي من الملصقات والتاكسول، الأدوية المعروفة لتحقيق الاستقرار F-الأكتين والأنابيب الدقيقة، على التوالي. وبالإضافة إلى ذلك، يتم إصلاحها في وقت واحد واستخراج خلايا لإزالة nonpolymerized حمامات تويولين عصاري خلوي التي يمكن أن تتداخل مع التصور من الأنابيب الدقيقة الفردية. ويمكن أيضا استخدام هذه التقنية لتصور الهيكل الخلوي البروتينات المرتبطة. عندما تكون في 3D، CT26 الخلايا يقدم مورفولوجيا الوسيطة نموذجي يتميز ممدودجسم الخلية، يميل مع F-الأكتين نتوءات الخلوية الغنية التي تشبه أرجل كاذبة خيطية وأقدام صفاحية (الشكلان 1 و 2). هذا التشكل ممدود هو أكثر وضوحا في الخلايا محاولة للهروب الأجسام الشبه الكروية الخلوية عن طريق غزو المصفوفة الكولاجين (الشكل 2). تلطيخ من الأنابيب الدقيقة باستخدام الأجسام المضادة لمكافحة تويولين يظهر شبكة أنيبيب المحفوظة جيدا ومنظمة تنظيما (الشكلان 1 و 2). هذا شكل الخلية يختلف كثيرا عن واحد من الخلايا في CT26 ركائز 2D، حيث لديهم عادة عدة الحواف الأمامية مع كبير أقدام صفاحية شقة واسعة ومحددة جيدا أرجل كاذبة خيطية 10.

لمعالجة الصور المكتسبة في هذا العمل، تم استخدام Imaris. هذا البرنامج تلقائيا بتحويل الكبيرة المكتسبة Z-المداخن إلى الإسقاط 3D من سهولة التصفح والتصور في جميع الطائرات (XY، XZ YZ و) وزوايا مختلفة (الشكلان 1 و 2 و 3، orthogonaالمشاهدات لتر). باستخدام "3D اقتصاص" وظيفة، يمكن إزالة طائرات Z لا لزوم لها أعلى أو أسفل المنطقة من المهتمين. كما هو ممثل في الشكل (3)، فمن الأهمية بمكان لتحليل مداخن Z تم جمعها من جميع الطائرات من أجل ضمان توزيع موحد 3D من الخلايا. في هذه الحالة، CT26 الخلايا المزروعة كما يبدو لغزو الأجسام الشبه الكروية مصفوفة الكولاجين 3D على نطاق واسع عندما تصور كنوع من الإسقاط XY القصوى. ومع ذلك، وجهة نظر XZ يكشف عن أن كل الخلايا تغزو فاصل زمني Z المقيدة بالمقارنة مع حجم كروي، مما يشير إلى المنطقة تفضيلية من الغزو. هذا كروي هو في الواقع قريبة جدا من أسفل الزجاج من صحن وخلايا انتقل بسرعة نحو وعلى الركيزة 2D جامدة.

الشكل 1
الشكل 1. الهيكل الخلوي من CT26 خلايا سرطان الخلايا المضمنة في TAMRA المسمى الكولاجين I. العقيدعلى غدية كانت جزءا لا يتجزأ CT26 الخلايا كخلايا وحيدة في 2 ملغ / مل TAMRA المسمى الكولاجين الأول (الأحمر). الصور المناعي من الثقافات ملطخة الضد تويولين إلى الأنابيب الدقيقة تسمية (الأزرق)، اليكسا-488 phalloidin لتصور F-الأكتين (الخضراء) ودابي لتلطيخ النووية (السماوي). صورة 3D يتوافق مع XY الإسقاط القصوى من Z-رزمة من 38 ميكرون. XZ متعامد (أسفل الدمج) وYZ (حق الدمج) دمج وجهات النظر. شريط النطاق، 20 ميكرومتر. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

الشكل 2
الشكل 2. كانت جزءا لا يتجزأ من الهيكل الخلوي CT26 الخلايا السرطانية الخلايا الغازية TAMRA المسمى الكولاجين I. الخلايا CT26 كما نمت الأجسام الشبه الكروية الخلوية في 2 ملغ / مل TAMRA المسمى الكولاجين الأول (الأحمر). بعد 2 أيام في الثقافة، التي الخلايا فيvading مصفوفة 3D الكولاجين، والابتعاد عن كروي الخلية. الصور المناعي من الثقافات ملطخة الضد تويولين إلى الأنابيب الدقيقة تسمية (الأزرق)، اليكسا-488 phalloidin لتصور F-الأكتين (الخضراء) ودابي لتلطيخ النووية (السماوي). صورة 3D يتوافق مع XY الإسقاط القصوى من Z-رزمة من 66 ميكرون. XZ متعامد (أسفل الدمج) وYZ (حق الدمج) دمج وجهات النظر. شريط النطاق، 50 ميكرومتر. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

الشكل (3)
الشكل (3). وقد نمت غزو CT26 الخلايا في الكولاجين أنا تعتمد على المسافة الزجاج. CT26 الخلايا كما الأجسام الشبه الكروية الخلوية وجزءا لا يتجزأ في 2 ملغ / مل الكولاجين I. بعد 2 أيام في الثقافة، وخلايا انتقل بشكل ملحوظ بعيدا عن خلية كروي، وليس عن طريق غزو رانه 3D الكولاجين مصفوفة ولكن عن طريق الزحف على الزجاج جامدة 2D. الصور مضان من الثقافات ملطخة اليكسا-488 phalloidin لتصور F-الأكتين. أ) صورة 3D يتوافق مع XY الإسقاط القصوى من Z-أكوام من 200 ميكرون. ب) عرض XZ متعامد. شريط الحجم، 150 ميكرون. انقر هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

بروتوكول الموصوفة هنا لتسمية fluorescently الكولاجين أنا باستخدام TAMRA يوفر وسيلة ممتازة للسماح التصور السهل للمنظمة شبكة الكولاجين، وذلك باستخدام المجهر متحد البؤر القياسية مجهزة ليزر نانومتر 561. ميزة هذه التقنية مقارنة مع الانعكاس متحد البؤر المجهري هو القدرة على صورة ألياف الكولاجين أعمق في مصفوفة 3D. كثافة وعلى النقيض من انعكاس الألياف يقلل إلى حد كبير مع العمق بسبب ضوء الليزر الاستيعاب ونثر. أيضا، يمكن التوجه من ألياف الكولاجين يشكل عائقا رئيسيا عند استخدام الانعكاس المجهري متحد البؤر، منذ ألياف الانحياز نحو 50 º من الطائرة التصوير والتي لم يتم كشفها تماما. تم الكشف عن الألياف fluorescently المسمى مع سطوع مماثلة، بغض النظر عن ميولهم 20. طريقة أخرى التي استخدمت على نحو متزايد لتصور حزم الكولاجين، سواء في التجارب المختبرية والحية، هو عن طريق الجنرال التوافقي الثانيeration (SHG). ويستند هذا العملية على الانبعاثات من مجموعة المساعدة الذاتية إشارة من قبل هياكل noncentrosymmetric، مثل الكولاجين 21. ومع ذلك، يتطلب SHG المجهر multiphoton، وهي ليست جزءا من معدات التصوير المختبر القياسية.

استخدام TAMRA باعتبارها fluorophore ليست حكرا. fluorophores الأخرى، مثل CY2، Cy5 أو الأسرة فلور اليكسا، وهي متاحة تجاريا في مجموعات العلامات البروتين، ويمكن استخدامها لالكولاجين التسمية في اللون الأكثر ملاءمة للمستخدم. ميزة أخرى لاستخدام الكولاجين الفلورسنت هو احتمال أن تكون جنبا إلى جنب مع خلايا transfected مع البروتينات fluorescently الموسومة عن الوقت الفاصل بين التصوير، وتتابع عن كثب التفاعلات الخلية مصفوفة أو تشوهات مصفوفة الخلايا التي يسببها. ويمكن أيضا أن تستخدم لطلاء رقيقة coverslips على الكولاجين في التجارب 2D.

دمج الخلايا في المصفوفات 3D هو إجراء حساسة، ولا سيما عند استخدام الأجسام الشبه الكروية الكبيرة، لأن لديهم ميل لتغرق بسبب الجاذبية. أيضا، عادة تنجذب الخلايا لبيئات أشد وعندما جزءا لا يتجزأ في مناطق مصفوفة 3D قريبة بما فيه الكفاية إلى ساترة الزجاج ليشعر زيادة في التوتر الناجم عن الزجاج، وأنها تتحرك نحو الركيزة 2D جامدة. خدعة التقنية للمساعدة في منع غرق الأجسام الشبه الكروية الكبيرة هو السماح للالكولاجين لبلمرة لفترة وجيزة (2-5 دقيقة) قبل وضع كروي على أعلى من قطرة المصفوفة. سيؤدي هذا إلى زيادة طفيفة في اللزوجة من هلام، وزيادة وقت الغرق. ومع ذلك، فمن الممارسة السليمة لإعداد عدة نسخ متماثلة لزيادة احتمالات النجاح. من ناحية أخرى، فمن المهم للحفاظ على الخلايا تحت العمل عن بعد الهدف. أهداف التكبير أقل وعادة ما يكون العمل مسافات أكبر، ويمكن استخدامها للصور المجال العام، على سبيل المثال، لمقارنة غزو من أنواع مختلفة من الخلايا من كروي. ينصح إلى حد كبير عندما يتطلب الأمر دقة أعلى الصور، والمياه الأهداف الغمر، مع مسافات العمل أكبر،.

معشوقة = "jove_content"> وقد تم ذلك معظم الأعمال المنشورة تبحث في البروتينات داخل الخلايا من الخلايا في المصفوفات 3D بسبب الإفراط في التعبير عن البروتينات الموسومة fluorescently، وربما يعود ذلك إلى عدم وجود موثوق بها بروتوكول تلطيخ المناعي متوافقة مع طبيعة 3D من قوام . مشاكل مثل سهولة الوصول إلى الأجسام المضادة الخلايا متأصلة أو تلوين الخلفية عالية من المصفوفة (منذ العديد من الأجسام المضادة يمكن تزيين unspecifically ألياف الكولاجين) يمكن أن يكون سببا. يصف هذا البروتوكول أيضا المناعية في مصفوفات الكولاجين 3D. على الرغم من أن هذا البروتوكول تم الأمثل لالهيكل الخلوي أو البروتينات المرتبطة الهيكل الخلوي، كما تم استخدامه بنجاح لتسمية علامات التصاق التنسيق، مثل paxilin، vinculin وzyxin، في خطوط مختلفة من الخلايا 10. نحن لا محاولة إنشاء بروتوكول عام المناعية 3D. كما هو الحال في 2D، يجوز لكل الأجسام المضادة تتطلب إجراء التثبيت مختلفة وتصميم بروتوكول معين لقد تتطلب كل الأضدادد. ويرد هذا البروتوكول كنقطة انطلاق، ويقترح أن مستخدمي تشمل phalloidin الفلورسنت تلطيخ لتقديم فكرة عن شكل الخلية والتوطين داخل المصفوفة.

المصفوفات الكولاجين سميكة هي مبسطة جيدة في نظام المختبر لدراسة الهجرة خلية في ECM الفسيولوجية. على الرغم من أنها تفتقر إلى المواد الكيميائية والتعقيد المادي من الأنسجة الحية، وهذا النظام يسمح التلاعب في خصائص ECM محددة، مثل حجم المسام، ومرونة ويشابك. نأمل أن تساهم هذه البروتوكولات إلى وصف أفضل من التركيبة الجزيئية، وتوطين الوظائف من الهياكل الخلوية لسنوات عديدة تم تحليلها في 2D و لتحسين معرفتنا سلوك الخلية في 3D.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgments

الكتاب الامتنان الدكتور فاسيلي Gurchenkov (معهد كوري) لصورة اكتساب ومعالجة في الشكل 3 و مرفق التصوير PICT-IBISA (معهد كوري). وأيد هذا العمل من قبل ANR-09-JCJC0023-01، ARC SFI20111203863 والموافقة المسبقة عن علم 3D - مجمع في المختبر نماذج الخلوية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
TAMRA, SE Invitrogen C-1171  
Rat tail Collagen High Concentration BD Biosciences 354249  
Rat tail Collagen BD Biosciences 354236  
Phalloidin Sigma P2141  
Taxol (Paxitel) Sigma T7402  
Mouse anti-alpha Tubulin antibody Sigma T9026  
Alexa 488 Phalloidin Invitrogen A12379  
Alexa 633 Goat anti-Mouse antibody Invitrogen A21052  
DAPI Invitrogen D1306  
Mounting media Fisher Scientific 106 226 89  
Dialysis Cassette Pierce 66380  
Glass bottom dishes World Precision Instruments FD35-100  
MetaMorph Microscopy Automation & Image Analysis Software Molecular Devices  
Imaris 7.2.3 Bitplane  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schiro, J. A., Chan, B. M., et al. Integrin alpha 2 beta 1 (VLA-2) mediates reorganization and contraction of collagen matrices by human cells. Cell. 67 (2), 403-410 (1991).
  2. Klein, C. E., Dressel, D., et al. Integrin alpha 2 beta 1 is upregulated in fibroblasts and highly aggressive melanoma cells in three-dimensional collagen lattices and mediates the reorganization of collagen I fibrils. J. Cell Biol. 115 (5), 1427-1436 (1991).
  3. Friedl, P., Maaser, K., Klein, C. E., Niggemann, B., Krohne, G., Zänker, K. S. Migration of highly aggressive MV3 melanoma cells in 3-dimensional collagen lattices results in local matrix reorganization and shedding of alpha2 and beta1 integrins and CD44. Cancer Res. 57 (10), 2061-2070 (1997).
  4. Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nat. Rev. Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).
  5. Zaman, M. H., Trapani, L. M., et al. Migration of tumor cells in 3D matrices is governed by matrix stiffness along with cell-matrix adhesion and proteolysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (29), 10889-10894 (2006).
  6. Doyle, A. D., Wang, F. W., Matsumoto, K., Yamada, K. M. One-dimensional topography underlies three-dimensional fibrillar cell migration. J. Cell Biol. 184 (4), 481-490 (2009).
  7. Fraley, S. I., Feng, Y., et al. A distinctive role for focal adhesion proteins in three-dimensional cell motility. Nat. Cell Biol. 12 (6), 598-604 (2010).
  8. Harunaga, J. S., Yamada, K. M. Cell-matrix adhesions in 3D. Matrix Biol. 30 (7-8), 363-368 (2011).
  9. Raub, C. B., Suresh, V., et al. Noninvasive assessment of collagen gel microstructure and mechanics using multiphoton microscopy. Biophys. J. 92 (6), 2212-2222 (2007).
  10. Geraldo, S., Simon, A., Elkhatib, N., Louvard, D., Fetler, L., Vignjevic, D. M. Do cancer cells have distinct adhesions in 3D collagen matrices and in vivo? Eur. J. Cell Biol. 91 (11-12), 930-937 (2012).
  11. Geraldo, S., Gordon-Weeks, P. R. Cytoskeletal dynamics in growth-cone steering. J. Cell Sci. 122 (Pt 20), 3595-3604 (2009).
  12. Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnol. Bioeng. 83 (2), 173-180 (2003).
  13. Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. J. Vis. Exp. (51), (2011).
  14. Haji-Karim, M., Carlsson, J. Proliferation and viability in cellular spheroids of human origin. Cancer Res. 38 (5), 1457-1464 (1978).
  15. Eyre, D. R., Paz, M. A., Gallop, P. M. Cross-linking in collagen and elastin. Ann. Rev. Biochem. 53, 717-748 (1984).
  16. Baici, A., Cohen, G., Fehr, K., Böni, A. A handy assay for collagenase using reconstituted fluorescein-labeled collagen fibrils. Anal. Biochem. 108 (2), 230-232 (1980).
  17. Stein, A. M., Vader, D. A., Jawerth, L. M., Weitz, D. A., Sander, L. M. An algorithm for extracting the network geometry of three-dimensional collagen gels. J. Microsc. 232 (3), 463-475 (2008).
  18. Sabeh, F., Ota, I., et al. Tumor cell traffic through the extracellular matrix is controlled by the membrane-anchored collagenase MT1-MMP. J. Cell Biol. 167 (4), 769-781 (2004).
  19. Artym, V. V., Matsumoto, K. Imaging cells in three-dimensional collagen matrix. Curr. Prot. Cell Biol. Chapter 10, Unit 10.18.1-Unit 10.18.20 (2010).
  20. Jawerth, L. M., Münster, S., Vader, D. A., Fabry, B., Weitz, D. A. A blind spot in confocal reflection microscopy: the dependence of fiber brightness on fiber orientation in imaging biopolymer networks. Biophys. J. 98 (3), L1-L3 (2010).
  21. Cicchi, R., Vogler, N., Kapsokalyvas, D., Dietzek, B., Popp, J., Pavone, F. S. From molecular structure to tissue architecture: collagen organization probed by SHG microscopy. J. Biophotonics. 6 (2), 129-142 (2013).

Tags

الطب، العدد 80، TAMRA، والكولاجين، 3D مصفوفة، الأجسام الشبه الكروية، F-الأكتين، ميكروتثبول
وكشف عن المنظمة هيكل الخلية من خلايا سرطان الغازية في 3D
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Geraldo, S., Simon, A., Vignjevic,… More

Geraldo, S., Simon, A., Vignjevic, D. M. Revealing the Cytoskeletal Organization of Invasive Cancer Cells in 3D. J. Vis. Exp. (80), e50763, doi:10.3791/50763 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter