Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Afsløring af cytoskeletal Organisationen af ​​invasive kræftceller i 3D

Published: October 26, 2013 doi: 10.3791/50763
Automatic Translation
1, 1, 1
1UMR 144 CNRS, Institut Curie

Summary

Denne artikel præsenterer en metode til fluorescens mærke kollagen, der kan yderligere bruges til både fix og live imaging af 3D cellekulturer. Vi tilbyder også en optimeret protokol til at visualisere endogene cytoskeletproteiner af celler dyrket i 3D-miljøer.

Abstract

Cell migration er traditionelt blevet undersøgt i 2D substrater. Imidlertid er det blevet stadig mere klart, at der er behov for at studere cellemigrering i mere hensigtsmæssige 3D-miljøer, som bedre ligner dimensionalitet de fysiologiske processer i pågældende. Migrerende celler kan være meget forskellige i deres morfologi og funktion af migration, alt efter om de bevæger sig på 2D-eller 3D-substrater. På grund af tekniske vanskeligheder og uoverensstemmelser med de fleste standardprotokoller, strukturelle og funktionelle analyse af celler indlejret i 3D matricer stadig ualmindelige. Denne artikel beskriver metoder til forberedelse og billeddannelse af 3D kræft cellekulturer, enten som enkelte celler eller sfæroider. Som en passende ECM substrat for kræft cellemigration, bruger vi nonpepsinized rotte hale kollagen I polymeriseret ved stuetemperatur og fluorescensmærket at lette visualisering hjælp af standard konfokale mikroskoper. Dette arbejde omfatter også en protokolol til 3D immunofluorescent mærkning af endogene celle cytoskelet. Ved hjælp af disse protokoller vi håber at bidrage til en bedre beskrivelse af den molekylære sammensætning, lokalisering og funktioner cellulære strukturer i 3D.

Introduction

Feltet af cellevandring har trodset ind i helt nye tredje dimensionelle verden. Det er intuitivt at studere celle migration i et miljø, der mest ligner den fysiologiske én, og derfor, tre-dimensionelle (3D). Men på grund af tekniske begrænsninger, har de fleste cellevandring undersøgelser blevet udført analysere cellebevægelse tværs stive to-dimension (2D) substrater, enten ubehandlet eller belagt med passende ekstracellulære matrix (ECM) proteiner.

De første undersøgelser dedikeret til celle migration i tredimensionelle collagen gitre går tilbage over 20 år 1-3. Det er dog kun de seneste 5 år er det blevet klart, at migrerende celler væsentligt kunne variere i deres morfologi og funktion af migration afhængig dimensionalitet af underlaget. I 2D, kun celler kontakte underlaget med deres ventrale overflade ved hjælp fokale adhæsioner, resulterer i dannelsen af ​​brede flade fremspring (lamellipodia) medindlejrede finger-lignende fremspring (filopodia) ved deres forkant. Disse strukturer, sammen med stress fibre, der forbinder cellen front til bagkanten, menes der at være afgørende for celle bevægelse i 2D. I 3D matricer, er celler generelt mere langstrakt, med hele celleoverfladen kontakt ECM, der forårsager betydelige ændringer i formationen og funktionelle relevans af mange af disse strukturer. Omvendt, andre cellulære funktioner vinde relevans i 3D migration, såsom nukleare deformation og strukturer involveret i ECM remodeling 4..

På trods af disse kendte morfologiske forandringer, samt forskelle i migration modes 5-7, som kan variere afhængigt af ECM og celletyper, strukturelle og funktionelle analyse af celler indlejret i 3D matricer stadig usædvanligt. Arbejde med tykke og tætte 3D matricer bærer tekniske vanskeligheder, såsom høj opløsning mikroskopi imaging, og uoverensstemmelser med de fleste standard protokoller optimeret til 2D kulturer, ligesom immunofluorescent mærkning af endogene proteiner. Også, fordi brugen af 3D matricer er en forholdsvis ny tilgang, er forskerne stadig undersøger de bedste betingelser for nøje ligner specifik in vivo situationer, såsom den normale stromalt arkitektur forskellige væv organer eller ECM organisationen omkring en tumor. Uoverensstemmelser i resultater ved de forskellige grupper om, for eksempel, har kræftcelle former for migration eller eksistensen af fokale sammenvoksninger, der genereres nogle kontroverser 8.. En stor indsats er for nylig blevet dedikeret til at nå til enighed i form af ECM kemisk art, porestørrelse, fiber tykkelse og matrix stivhed. Mange forskellige typer af 3D ECM'er er i øjeblikket anvendes, varierende fra celle afledte matricer til kommercielt tilgængelige Matrigel, pepsinized bovint kollagen I, eller nonpepsinized rotte hale kollagen I. Hver af disse matricer har specifikke fysiske og kemiske egenskaber, og et behov for at relate matrix af valg til den fysiologiske proces, der undersøges. Desuden kan porestørrelse og fiber tykkelse afhænger polymerisationsbetingelser betingelser, såsom pH og temperatur 9,10. Binding til og afstand fra stive substrater, såsom glas, kan også ændre de elastiske egenskaber af matricen 10,11.

Denne artikel beskriver metoder til forberedelse og billeddannelse af 3D kræft cellekulturer, enten som enkelte celler eller sfæroider. Fremgangsmåder til fremstilling kræftcelleproteiner sfæroider er tidligere blevet beskrevet, de mest populære er den hængende dråbe metode 12,13 og agarose-overtrukne plade metode 14.. Som en passende ECM substrat for kræft cellemigration er nonpepsinized rotte hale kollagen I polymeriseret ved stuetemperatur anvendes ved 2 mg / ml. Nonpepsinized syreekstraherede kollagen I fra rotte hale bevarer både N-og C-terminale telopeptider, nonhelical dele af kollagenmolekylet ansvarlige for nativt kollagen intermolecular tværbinding og fibrilar stabilitet 15.. Tilsammen udgør disse forhold tillader dannelsen af kollagen netværk, at de fleste ligner dem observeret in vivo 10.. At tillade visualisering af collagenfibre, både i faste og levende kulturer, er en detaljeret protokol billede til fluorescens mærke kollagen in vitro 10 under anvendelse af 5 - (og-6)-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA), succinimidylester. Denne protokol er blevet tilpasset fra Baici et al. 16,17, hvor fluoresceinisothiocyanat bruges til at mærke opløselige kollagen molekyler. Som fluorescein, er TAMRA en amino-reaktivt fluorescerende farvestof, der reagerer med protoneret alifatiske aminogrupper i proteiner, såsom den frie aminogruppe ved N-terminalen og, endnu vigtigere, den side aminogruppe af lysiner. Denne reaktion forekommer kun ved basisk pH, når lysin aminogruppe er i protoneret form,. Ud over at TAMRA være mere stabil end fluorescein løbettid, dens emissionsspektre falder på den orange / røde område (ex / em = 555/518 nm), der med fordel kan kombineres til levende celler af GFP-mærkede proteiner. Brug opløselige collagen mærkede molekyler med amino-reaktive farvestoffer påvirker ikke polymerisationsprocessen eller tæthed, porestørrelse og tværbinding status kollagenmatrixen 10,16,18,19.

Denne protokol omfatter også en fremgangsmåde til 3D immunofluorescent mærkning af endogene proteiner, som er blevet yderligere optimeret til at mærke cytoskelettet eller cytoskelet associerede proteiner. Den endelige fokus i denne protokol på metoder til at erhverve høj opløsning billeder af 3D-kulturer ved hjælp af konfokal mikroskopi med reduceret tilskud fra stive dækglas på collagen matrix spænding.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. TAMRA-collagen I-mærkning

  1. Forbered en 10 mg / ml TAMRA opløsning ved tilsætning af 2,5 ml DMSO til det medfølgende 25 mg TAMRA pulver. Opløs det ved vortex indtil fuldstændig opløsning. Opbevar ved -20 º C og beskyttet mod lys.
  2. Forbered 2 liter Mærkning Buffer (0,25 M NaHCO3, 0,4 M NaCl). Justér pH til 9,5 med 10 M NaOH-opløsning. Opbevares ved 4 º C. Fra dette punkt, er alle operationer udføres ved 4 º C, medmindre andet er angivet og fluorescerende materiale er beskyttet mod lys ved hjælp aluminiumsfolie.
  3. Fyld en 1 ml engangssprøjte med 1 ml stærkt koncentreret rotte hale kollagen I opløsning. Høj koncentration kollagen løsninger er typisk tilvejebragt ved koncentrationer omkring 10 mg / ml og er meget tyktflydende. Vær sikker på at manipulere det langsomt for at undgå dannelse af luftbobler.
  4. Ved hjælp af en 21 G kanyle, kollagen injicere en forgennemvædet 3 ml dialyse kassette af 10.000 MWCO afskåret. Udvis forsigtighed for at undgå damaging membranen med nålen. Fjern al luft fra dialysen kassetten ved at trække op i sprøjten stemplet. Dialysér det natten mod 1 L Mærkning Buffer.
  5. Bland 100 ul 10 mg / ml TAMRA opløsning med 900 ul Mærkning Buffer. Bemærk: Dette skal gøres med både TAMRA løsning og mærkning Buffer ved stuetemperatur, da DMSO fryser ved 4 º C. Efter blanding, bringe den fortyndede TAMRA opløsningen tilbage til 4 º C.
  6. Fjern forsigtigt kollagen fra dialyse kassette med en 2 ml engangssprøjte med en 21 G kanyle. Bland 1 ml af den dialyserede kollagen opløsning med 1 ml fortyndet TAMRA opløsning ved pipettering.
  7. Overfør kollagen / TAMRA blandes i en 2 ml mikrocentrifugerør og inkuberes natten over med rotation.
  8. Overfør 2 ml TAMRA-mærket collagen i en gennemvædet 3 ml dialyse kassette og dialyseres natten over mod 1 liter mærkning buffer for at fjerne overskud af fri farvestof.
  9. Hvis du vil gendanne TAMRA-labeled kollagen til kollagen original løsning, placere dialyse kassette i 1 liter 0,2% (v / v) eddikesyre, pH 4, og dialyseres natten over.
  10. Måle endelige volumen af ​​TAMRA-mærket collagen og beregne dets endelige koncentration, overvejer den oprindelige mængde og koncentration af kollagen anvendte opløsning. Opbevares ved 4 º C.

2.. 3D TAMRA-collagenmatricer med indlejrede enkeltceller

  1. Beregn volumen på 2 mg / ml TAMRA-Collagen Mix nødvendig for eksperimentet. Altid forberede 20% mere at tage højde for pipettering tab som følge af kollagen høj viskositet.
  2. Forbered en stamopløsning af 10x PBS og 1 N NaOH. Filter-steriliseres og holdes ved 4 º C. Fra dette punkt, er alle operationer udføres på is, medmindre andet er angivet, og under sterile forhold.
  3. Bland 10x PBS og 1 N NaOH i passende mængder for at opnå den ønskede kollagen koncentration og pH 7,4. For eksempel til et endeligt volumen på 1 mlaf TAMRA-Collagen Mix ved pH 7,4, kombinere 100 pi 10x PBS med 5 pi 1 N NaOH. Bland godt.
  4. Tilsæt de passende mængder af både TAMRA-mærket collagen og umærket collagen i en 01:06-forhold for at opnå en endelig samlet kollagen koncentration på 2 mg / ml. For eksempel, for et endeligt volumen på 1 ml 2 mg / ml TAMRA-Collagen Mix tilsættes 90,48 pi 3.68 mg / ml TAMRA-mærket collagen og 415,71 pi 4,01 mg / ml umærket kollagen. Bland godt og langsomt ved pipettering, undgå dannelse af luftbobler.
  5. Tilføj celler suspenderet i passende volumen af kølet celle medium uden FBS til TAMRA-Collagen Mix at opnå en endelig celletæthed på 10 5 celler / ml og en endelig kollagen koncentration på 2 mg / ml. For eksempel, for 1 ml 2 mg / ml TAMRA-Collagen Mix tilsættes 388,81 pi medium indeholdende 10 5-celler. Bland godt og langsomt ved pipettering, undgå dannelse af luftbobler. Bekræft pH ved at teste 10 pi af blandingen på en pH-test stur.
  6. Tilsæt 100 pi dråber TAMRA-Collagen Mix på glasbund retter og tillade det at polymerisere ved stuetemperatur i 30-45 min. 100 pi kollagen dråber har en typisk diameter på 7 mm og er 2 mm høje. Når polymeriseret, kollagen bliver til en hvidlig gel. Bemærk: At tillade collagen at polymerisere uden at lukke fadet vil undgå dannelse af en vand film omkring collagen drop, reducere løsrivelse fra glasset. At øge vedhæftning kan glas retter overtrækkes med poly-L-lysin ved 100 ug / ml.
  7. Tilsættes forsigtigt tilstrækkeligt dyrkningsmedium at dække kollagen / celle dråber. Undgå høje fluxe medier eller pludselige bevægelser, da kollagen dråber nemt kan løsne. Opbevares ved 37 º C i 10% CO 2 befugtet luft for tilstrækkelig tid til celler til at migrere i matrixen (typisk 1-3 dage).

3.. 3D TAMRA-collagenmatricer med Embedded Cell Spheroids

  1. Beregn volumen på 2 mg / ml TAMRA-Collagen MIX nødvendige for eksperimentet. Altid forberede 20% mere at tage højde for pipettering tab som følge af kollagen høj viskositet.
  2. Forbered en stamopløsning af 10x PBS og 1 N NaOH. Filter-steriliseres og holdes ved 4 º C. Fra dette punkt, er alle operationer udføres på is, medmindre andet er angivet, og under sterile forhold.
  3. Bland 10x PBS til 1 N NaOH og cellemedier uden FBS i passende mængder opnå den ønskede kollagen koncentration og pH 7,4. For eksempel, for et endeligt volumen på 1 ml TAMRA-Collagen Mix ved pH 7,4 kombinere 100 pi 10x PBS, 5 pi af 1 N NaOH og 388,81 pi medier. Bland godt.
  4. Tilsæt de passende mængder af både TAMRA-mærket collagen og umærket collagen i en 01:06-forhold for at opnå en endelig samlet kollagen koncentration på 2 mg / ml. For eksempel, for et endeligt volumen på 1 ml 2 mg / ml TAMRA-Collagen Mix tilsættes 90,48 pi 3.68 mg / ml TAMRA-mærket collagen og 415,71 pi 4,01 mg / ml unlaBeled kollagen. Bland godt og langsomt ved pipettering, undgå dannelse af luftbobler. Bekræft pH ved at teste 10 pi af blandingen på en pH-teststrimmel.
  5. Tilsæt 100 ul dråber TAMRA-Collagen Mix på glasbund retter og lad det initiere polymerisation for 2-5 min. Dette vil bidrage til at forhindre forlis spheroids ved svagt stigende gel viskositet. 100 pi kollagen dråber har en typisk diameter på 7 mm og er 2 mm høje.
  6. Saml en celle klumpformet og placere den på en ren petriskål. Fjern eventuel overskydende væske og resuspender den i 10 pi TAMRA-Collagen Mix. Dette er vigtigt for at forhindre fortynding af kollagen med cellemedier.
  7. Ved hjælp af en P20 pipette, indsamle kollagen suspenderede klumpformet og placere den på midten oven på 100 ul TAMRA-Collagen Mix dråbe. Bemærk: Du må ikke lægge mere end én klumpformet pr collagen drop, da de kan påvirke hinanden kapacitet til at invadere og / eller migrere.
  8. Lad TAMRA-Collagen Mix til polymerize ved stuetemperatur i 30-45 min. Når polymeriseret, kollagen bliver til en hvidlig gel. Bemærk: At tillade collagen at polymerisere uden at lukke fadet vil undgå dannelse af en vand film omkring collagen drop, reducere løsrivelse fra glasset. At øge vedhæftning kan glas retter overtrækkes med poly-L-lysin ved 100 ug / ml.
  9. Tilsættes forsigtigt tilstrækkeligt dyrkningsmedium at dække kollagen / sfæroider dråber. Undgå høje fluxe medier eller pludselige bevægelser, da kollagen dråber nemt kan løsne.
  10. Opbevares ved 37 º C i 10% CO 2 befugtet luft for tilstrækkelig tid til celler til at invadere / migrere i matricen (typisk 1-3 dage).

4.. 3D immunfluorescensfarvning

  1. Fjern forsigtigt cellemedierne og skyl collagenmatricer indeholder celler / sfæroider med PBS.
  2. Samtidig fastsætte og udtrække celler ved inkubering med ekstraktion / fiksering buffer (4% PFA, 0,3% Triton X-100, 5% sucrose i PBS) i 5 minutter. Supplér buffer med 2 pM phalloidin og 2 uM Taxol til visualisering af cytoskeleton eller cytoskelet associerede proteiner.
  3. Yderligere fix celler med 4% PFA, 5% sucrose i PBS i 30 min. Skyl med 0,05% Tween-20 i PBS.
  4. Forbered primære antistoffer løsninger i PBS. Cellerne inkuberes med primære antistoffer i mindst 1 time ved stuetemperatur eller natten over ved 4 ° C. Sørg for at tilføje nok løsning til at dække hele collagen dråbe. For en 35 mm glas bund parabol, vil 1,5-2 ml opløsning være nødvendig. Bemærk: For at reducere mængden af ​​antistof løsning, kan en vand uopløselig barriere, såsom en ringbane af silikone fedt eller en PDMS ring, der placeres rundt om kollagen dråbe.
  5. Vask 3x 30 min med 0,05% Tween-20 i PBS.
  6. Forbered Alexa-konjugerede sekundære antistoffer, Alexa-konjugeret phalloidin og DAPI-løsninger i PBS. Cellerne inkuberes med de passende sekundære antistoffer i 2 timer ved stuetemperatur.
  7. Vask 3x 30 min med 0,05% Tween-20 i PBS.
  8. Fjern overskydende væske, tilsættes nok montering medier til at fylde glasbund fadet bund (ca. 500 ul) og placere en 24 mm dækglas på toppen at forsegle. Tryk ikke dækglasset for at undgå at komprimere collagen drop og beskadige 3D-organisation.

5.. Sample Imaging

Klassiske eller spinning disk konfokal mikroskoper kan anvendes. En inverteret ordning bør fortrinsvis anvendes til at bestemme afstanden af ​​de afbildede celler fra glas bunden. Det system, der anvendes til dette arbejde er en Inverted Confocal Spinning Disk udstyret med en 40X/1.3NA og et 60X/1.4NA olieimmersionsobjektiv mål (arbejder afstande 200 um og 130 um, henholdsvis), et Photometrics CoolSNAP HQ2 kamera, 1392 x 1040 imaging array, 6,45 x 6,45 um pixels og kontrolleres af Metamorph imaging software. 405 nm, 491 nm, 561 nm og 633 nm lasere anvendes typisk på 30-50% effekt, får 1 og udsmidningen af ​​2x 2 for at reducere eksponering tider. Mikroskopet er også udstyret med en Hg-lampe og filter kuber til DAPI (exc 400-418 nm em 450-465), FITC (exc 478-495, em 510-555) og Texas Red (exc 560-580; em 600 -650) til at bruge med øjet brik.

  1. Brug af lysstofrør, 40X mål placere på midten af ​​kollagen dråbe. Få et overblik over prøven, både i xy aksen og i z-aksen. Sørg for ikke at afvige mere end 100 um fra gelen kant på xy aksen, når de erhverver de billeder for at undgå kantvirkninger. Når billeddannelse spheroids, sørg for at de er under målet arbejdsafstand. Skift objektiv, hvis det er relevant.
  2. Skift til konfokal levende imaging mode. Ved hjælp af 561 nm laser til at visualisere TAMRA-mærket collagen, startende fra glas bunden bestemme z-værdi, ved hvilken collagenfibre begynder at dukke op. Dette er substratet bund og z = 0.
  3. Ved hjælp af fokus knop, op gå 100 um fra z = 0. Kun celler ved z = 100 umeller derover bør afbildes for at undgå spændinger effekter fra den stive glas bunden.
  4. Vælg cellerne til billede. Optimer kameraets eksponering gange, og laser magt for hver bølgelængde. Typiske eksponeringstider for DAPI og Alexa-488 phalloidin ligger mellem 100-200 msek. Eksponeringstider antistoffarvning kan variere.
  5. På konfokal levende tilstand ved hjælp af passende laser til at visualisere phalloidin farvning og bruge fokus knop, definere z serien interval ved at sætte top og bund z-værdier for strøm.
  6. Definer z-trins størrelse. For 40X mål bruge 1 um. For 60X, bruge 0,5 um. Start erhvervelsen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mærkning rotte-hale kollagen I med TAMRA tillader en nem tilberedning og visualisering af 3D kollagen netværk. Langsom polymerisation ved stuetemperatur resulterer i dannelsen af kollagen netværk med lignende organisation til dem, der findes in vivo 10..

Her præsenterer vi en protokol for immunfluorescensfarvning af cytoskelettet af CT26 cancerceller, både som spheroids og som enkeltceller. For bedre at bevare cytoskeleton er buffere suppleret med umærket phalloidin og Taxol, lægemidler, der vides at stabilisere F-actin og mikrotubuli, hhv. Desuden er cellerne samtidigt fast og udvindes til at fjerne nonpolymerized cytosol tubulin puljer, der kan interferere med visualisering af de enkelte mikrotubuli. Denne teknik kan ligeledes anvendes til at visualisere cytoskelet-associerede proteiner. Når i 3D, præsentere CT26 celler en typisk mesenchymal morfologi karakteriseret ved en langstraktcelle organ, tippes med F-actin rige cellulære fremspring, der ligner filopodia og lamellipodia (figur 1 og 2). Denne aflange morfologi er endnu mere indlysende i celler forsøger at undslippe cellulære sfæroider ved at invadere kollagenmatrixen (figur 2). Farvning af mikrotubuli ved hjælp af et anti-tubulin-antistof viser et velbevaret og organiseret mikrotubulære netværk (fig. 1 og 2). Denne celle form i høj grad adskiller sig fra den ene af CT26 celler i 2D substrater, hvor de normalt har flere forkanter med store brede flad lamellipodia og veldefinerede filopodia 10..

At behandle de indsamlede billeder i dette arbejde blev Imaris brugt. Denne software konverterer automatisk erhvervede big z-stakke i en 3D-projektion af nem navigation og visualisering i alle planer (xy, xz og yz) samt forskellige vinkler (figur 1, 2 og 3, orthogonal visninger). Brug af "Crop 3D" funktion, kan unødvendige z fly over eller under regionen interesserede fjernes. Som vist i figur 3, er det afgørende at analysere indsamlede z stakke fra alle planer for at sikre en ensartet 3D fordeling af cellerne. I dette tilfælde synes CT26 celler dyrket som sphæroider at invadere en 3D kollagen matrix udstrakt når visualiseres som en maksimal xy projektion. Men en xz opfattelse afslører, at alle celler invaderer en begrænset z interval i forhold til den klumpformet volumen, hvilket tyder på en privilegeret område af invasion. Denne sfæroide er i virkeligheden for tæt på glas bunden af ​​skålen og celler bevæget hurtigt mod og den stive 2D substrat.

Figur 1
Figur 1. Cytoskelettet af CT26 celler cancerceller indlejret i TAMRA-mærket collagen I. Colpå adenocarcinom CT26 celler blev indlejret som enkeltceller i 2 mg / ml TAMRA-mærket collagen I (rød). Immunofluorescens billeder af kulturer farvet med en tubulin antistof til at mærke mikrotubuli (blå), Alexa-488 phalloidin at visualisere F-actin (grøn) og DAPI for nuklear farvning (cyan). 3D-billede svarer til xy maksimal projektion af z-stakke af 38 um. Ortogonale xz (i bunden af ​​Merge), og yz (til højre for Merge) flette synspunkter. Scale bar, 20 um. Klik her for at se større billede .

Figur 2
Figur 2. Cytoskelettet af CT26 celler cancerceller invaderer TAMRA-mærkede kollagen I. CT26 celler dyrket som cellulære sfæroider blev indlejret i 2 mg / ml TAMRA-mærket collagen I (rød). Efter 2 dage i kultur, begyndte cellerne ivading collagen 3D matrix, bevæger sig væk fra cellen klumpformet. Immunofluorescens billeder af kulturer farvet med en tubulin antistof til at mærke mikrotubuli (blå), Alexa-488 phalloidin at visualisere F-actin (grøn) og DAPI for nuklear farvning (cyan). 3D-billede svarer til xy maksimal projektion af z-stakke af 66 um. Ortogonale xz (i bunden af ​​Merge), og yz (til højre for Merge) flette synspunkter. Scale bar, 50 um. Klik her for at se større billede .

Figur 3
Figur 3. CT26-celler invasion i kollagen I er afhængig af glasset afstand. CT26-celler blev dyrket som cellulære sfæroider og indlejret i 2 mg / ml kollagen I. Efter 2 dage i kultur, celler væsentligt bevæget sig væk fra cellen sfæroide ikke af invaderende tHan 3D collagenmatrix men ved at kravle på 2D stive glas. Fluorescens billeder af kulturer farvet med Alexa-488 phalloidin at visualisere F-actin. A) 3D-billede svarer til xy maksimal projektion af z-stakke på 200 um. B) Ortogonale xz view. Scale bar, 150 um. Klik her for at se større billede .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen beskrevet her til fluorescens mærke kollagen I bruger TAMRA giver en fremragende metode til at give nem visualisering af kollagen nettet organisation, ved hjælp af en standard konfokal mikroskop udstyret med en 561 nm laser. En fordel ved denne teknik sammenligne reflektans konfokal mikroskopi er evnen til billede collagenfibre dybere ind på 3D matrix. Intensiteten og kontrast fibre refleksion reduceres væsentligt med dybden på grund af laserlys absorption og spredning. Desuden kan orienteringen af ​​kollagen fibre være et stort handicap, når du bruger reflektans konfokal mikroskopi, er da fibre linie omkring 50 º fra afbildningsplanet helt uopdaget. Fluorescens-mærkede fibre opdages med lignende lysstyrke, uafhængig af deres orientering 20.. En anden metode, der i stigende grad blevet anvendt til at visualisere kollagenbundter, både in vitro og in vivo, er ved anden harmoniske generationbejde (SHG). Denne proces er baseret på udledningen af SHG signal ved noncentrosymmetric strukturer, såsom kollagen 21.. Men SHG kræver en multiphoton mikroskop, hvilket ikke er en del af standarden lab imaging-udstyr.

Anvendelsen af ​​TAMRA som en fluorofor er ikke eksklusiv. Andre fluorophorer, såsom Cy2, Cy5 eller Alexa Fluor familien, kommercielt tilgængelig i protein labeling kits, kan anvendes til mærkning af kollagen i den mest bekvemme farve for brugeren. En anden fordel ved at bruge fluorescerende kollagen er potentialet til at blive kombineret med celler transficeret med fluorescens-mærkede proteiner til time-lapse billeddannelse, til nøje at følge celle-matrix interaktioner eller celle-inducerede matrix deformationer. Det kan også bruges til tynde kollagen belægning dækglas i 2D eksperimenter.

Embedding celler i 3D matricer er en delikat procedure, især når der anvendes store kugler, da de har en tendens til at synke på grund af tyngdekraften. Ogsåceller er normalt tiltrukket stivere miljøer, og når indlejret i regioner af 3D matrix tæt nok på dækglas at føle stigningen i spænding induceret af glas, de bevæger sig i retning af stive 2D substrat. En teknisk trick til at forhindre sænkningen af ​​store kugler er at give collagen til kortvarigt at polymerisere (2-5 min), før du placerer klumpformet på toppen af ​​matrix dråbe. Dette vil let forøge viskositeten af ​​gelen, hvilket øger synkende tid. Ikke desto mindre er det god praksis at forberede flere gentagelser for at øge sandsynligheden for succes. På den anden side er det vigtigt at holde cellerne under målet arbejdsafstand. Lavere forstørrelsesobjektiver normalt har større arbejds-afstande og kan anvendes til generelle field billeder, for eksempel at sammenligne invasion af forskellige celletyper fra en sfæroide. Når billeder i højere opløsning er påkrævet, nedsænkning i vand mål med større arbejds-afstande, er stærkt anbefales.

10. Vi forsøger ikke at skabe en generel 3D immunfarvning protokol. Som i 2D, kan hvert antistof kræver en anden fiksering procedure og design af en specifik protokol for hvert antistof kan kræved.. Denne protokol præsenteres som udgangspunkt, og det foreslås, at brugerne omfatter et fluorescerende phalloidin farvning for at give en idé om cellens form og lokalisering i matrixen.

Tykke collagenmatricer er en god forenklet in vitro-system til at studere cellemigrering i en fysiologisk ECM. Selvom det mangler de kemiske og fysiske kompleksitet et levende væv, dette system tillader manipulation af specifikke ECM egenskaber, såsom porestørrelse, elasticitet og tværbinding. Vi håber, at disse protokoller vil bidrage til en bedre beskrivelse af den molekylære sammensætning, lokalisering og funktioner cellulære strukturer i mange år analyseret i 2D og forbedre vores viden om celle adfærd i 3D.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Forfatterne takker Dr. Vasily Gurchenkov (Institut Curie) for billedet erhverve og forarbejdning i figur 3, og PICT-IBISA Imaging Facility (Institut Curie). Dette arbejde blev støttet af ANR-09-JCJC0023-01, ARC SFI20111203863 og PIC 3D - Complex in vitro cellulære modeller.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
TAMRA, SE Invitrogen C-1171  
Rat tail Collagen High Concentration BD Biosciences 354249  
Rat tail Collagen BD Biosciences 354236  
Phalloidin Sigma P2141  
Taxol (Paxitel) Sigma T7402  
Mouse anti-alpha Tubulin antibody Sigma T9026  
Alexa 488 Phalloidin Invitrogen A12379  
Alexa 633 Goat anti-Mouse antibody Invitrogen A21052  
DAPI Invitrogen D1306  
Mounting media Fisher Scientific 106 226 89  
Dialysis Cassette Pierce 66380  
Glass bottom dishes World Precision Instruments FD35-100  
MetaMorph Microscopy Automation & Image Analysis Software Molecular Devices  
Imaris 7.2.3 Bitplane  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schiro, J. A., Chan, B. M., et al. Integrin alpha 2 beta 1 (VLA-2) mediates reorganization and contraction of collagen matrices by human cells. Cell. 67 (2), 403-410 (1991).
  2. Klein, C. E., Dressel, D., et al. Integrin alpha 2 beta 1 is upregulated in fibroblasts and highly aggressive melanoma cells in three-dimensional collagen lattices and mediates the reorganization of collagen I fibrils. J. Cell Biol. 115 (5), 1427-1436 (1991).
  3. Friedl, P., Maaser, K., Klein, C. E., Niggemann, B., Krohne, G., Zänker, K. S. Migration of highly aggressive MV3 melanoma cells in 3-dimensional collagen lattices results in local matrix reorganization and shedding of alpha2 and beta1 integrins and CD44. Cancer Res. 57 (10), 2061-2070 (1997).
  4. Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nat. Rev. Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).
  5. Zaman, M. H., Trapani, L. M., et al. Migration of tumor cells in 3D matrices is governed by matrix stiffness along with cell-matrix adhesion and proteolysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (29), 10889-10894 (2006).
  6. Doyle, A. D., Wang, F. W., Matsumoto, K., Yamada, K. M. One-dimensional topography underlies three-dimensional fibrillar cell migration. J. Cell Biol. 184 (4), 481-490 (2009).
  7. Fraley, S. I., Feng, Y., et al. A distinctive role for focal adhesion proteins in three-dimensional cell motility. Nat. Cell Biol. 12 (6), 598-604 (2010).
  8. Harunaga, J. S., Yamada, K. M. Cell-matrix adhesions in 3D. Matrix Biol. 30 (7-8), 363-368 (2011).
  9. Raub, C. B., Suresh, V., et al. Noninvasive assessment of collagen gel microstructure and mechanics using multiphoton microscopy. Biophys. J. 92 (6), 2212-2222 (2007).
  10. Geraldo, S., Simon, A., Elkhatib, N., Louvard, D., Fetler, L., Vignjevic, D. M. Do cancer cells have distinct adhesions in 3D collagen matrices and in vivo? Eur. J. Cell Biol. 91 (11-12), 930-937 (2012).
  11. Geraldo, S., Gordon-Weeks, P. R. Cytoskeletal dynamics in growth-cone steering. J. Cell Sci. 122 (Pt 20), 3595-3604 (2009).
  12. Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnol. Bioeng. 83 (2), 173-180 (2003).
  13. Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. J. Vis. Exp. (51), (2011).
  14. Haji-Karim, M., Carlsson, J. Proliferation and viability in cellular spheroids of human origin. Cancer Res. 38 (5), 1457-1464 (1978).
  15. Eyre, D. R., Paz, M. A., Gallop, P. M. Cross-linking in collagen and elastin. Ann. Rev. Biochem. 53, 717-748 (1984).
  16. Baici, A., Cohen, G., Fehr, K., Böni, A. A handy assay for collagenase using reconstituted fluorescein-labeled collagen fibrils. Anal. Biochem. 108 (2), 230-232 (1980).
  17. Stein, A. M., Vader, D. A., Jawerth, L. M., Weitz, D. A., Sander, L. M. An algorithm for extracting the network geometry of three-dimensional collagen gels. J. Microsc. 232 (3), 463-475 (2008).
  18. Sabeh, F., Ota, I., et al. Tumor cell traffic through the extracellular matrix is controlled by the membrane-anchored collagenase MT1-MMP. J. Cell Biol. 167 (4), 769-781 (2004).
  19. Artym, V. V., Matsumoto, K. Imaging cells in three-dimensional collagen matrix. Curr. Prot. Cell Biol. Chapter 10, Unit 10.18.1-Unit 10.18.20 (2010).
  20. Jawerth, L. M., Münster, S., Vader, D. A., Fabry, B., Weitz, D. A. A blind spot in confocal reflection microscopy: the dependence of fiber brightness on fiber orientation in imaging biopolymer networks. Biophys. J. 98 (3), L1-L3 (2010).
  21. Cicchi, R., Vogler, N., Kapsokalyvas, D., Dietzek, B., Popp, J., Pavone, F. S. From molecular structure to tissue architecture: collagen organization probed by SHG microscopy. J. Biophotonics. 6 (2), 129-142 (2013).

Tags

Medicin TAMRA kollagen 3D matrix sfæroider F-actin mikrotubuli
Afsløring af cytoskeletal Organisationen af ​​invasive kræftceller i 3D
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Geraldo, S., Simon, A., Vignjevic,… More

Geraldo, S., Simon, A., Vignjevic, D. M. Revealing the Cytoskeletal Organization of Invasive Cancer Cells in 3D. J. Vis. Exp. (80), e50763, doi:10.3791/50763 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter