Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Het openbaren van de organisatie van het cytoskelet van invasieve kankercellen in 3D

Published: October 26, 2013 doi: 10.3791/50763
Automatic Translation
1, 1, 1
1UMR 144 CNRS, Institut Curie

Summary

Dit artikel behandelt een methode om fluorescerend label collageen dat verder kan worden gebruikt voor zowel vaste en levende beeldvorming van 3D celculturen. Wij bieden ook een geoptimaliseerd protocol om endogene cytoskeleteiwitten van cellen gekweekt in 3D-omgevingen te visualiseren.

Abstract

Cel migratie is van oudsher bestudeerd in 2D substraten. Echter steeds duidelijker dat er een behoefte om celmigratie dieper op geschikte 3D omgevingen die beter lijken de dimensionaliteit van de fysiologische processen betrokken zijn. Migrerende cellen kunnen aanzienlijk verschillen in hun morfologie en de wijze van migratie gelang zij bewegen 2D of 3D substraten. Wegens technische problemen en onverenigbaarheden met de meeste standaard protocollen, structurele en functionele analyse van cellen ingebed in 3D matrices nog steeds ongebruikelijk. Dit artikel beschrijft werkwijzen voor bereiding en 3D beeldvorming van kanker celculturen, hetzij als enkele cellen of sferoïden. Als een passende ECM substraat voor kankercelmigratie, gebruiken we nonpepsinized rattenstaart collageen I gepolymeriseerd bij kamer-temperatuur en fluorescent gelabelde te visualiseren met behulp van standaard confocale microscopen vergemakkelijken. Dit werk bevat ook een protocolol voor 3D immunofluorescent labeling van endogene cel cytoskelet. Met behulp van deze protocollen hopen we bij te dragen aan een betere beschrijving van de moleculaire samenstelling, lokalisatie, en de functies van de cellulaire structuren in 3D.

Introduction

Het gebied van de cel migratie werd trotseren in de gloednieuwe derde dimensionale wereld. Het is intuïtief celmigratie studeren in een omgeving die het meest lijkt op de fysiologische een en dus driedimensionale (3D). Echter, door technische beperkingen, celmigratie meeste studies zijn gedaan analyseren celbeweging in stijve tweedimensionale (2D) substraten, hetzij onbehandeld of bekleed met geschikte extracellulaire matrix (ECM) eiwitten.

De eerste studies gewijd aan de cel migratie in driedimensionale collageenroosters gaan terug over 20 jaar 1-3. Slechts de laatste 5 jaren is duidelijk geworden dat migrerende cellen aanzienlijk kunnen verschillen in hun morfologie en de wijze van migratie naargelang de dimensionaliteit van het substraat. In 2D, alleen cellen contact van het substraat met hun buikzijde met focale adhesies, resulterend in de vorming van brede platte uitsteeksels (lamellipodia) metingebedde vinger-achtige uitsteeksels (filopodia) op hun voorrand. Deze structuren, samen met stress vezels die de cel voor aansluiten op de achterrand, worden verondersteld cruciaal voor cel beweging in 2D. In 3D matrices, cellen algemeen langwerpig, met het gehele celoppervlak gesprek met de ECM, die aanzienlijke veranderingen in de vorming en functionele relevantie van veel van deze structuren. Omgekeerd andere cellulaire functies krijgen relevantie in 3D migratie, zoals nucleaire vervorming en structuren die betrokken zijn bij ECM remodeling 4.

Ondanks deze bekende morfologische veranderingen, evenals verschillen in migratie modi 5-7, die kunnen variëren naargelang de ECM en celtypes, structurele en functionele analyse van cellen ingebed in 3D matrices blijft ongebruikelijk. Werken met dikke en dichte 3D matrices voert technische problemen, zoals hoge-resolutie microscopie beeldvorming, en onverenigbaarheden met de meeste standard protocollen geoptimaliseerd voor 2D culturen, zoals immunofluorescentie labeling van endogene eiwitten. Ook, omdat het gebruik van 3D-matrices is een relatief nieuwe benadering tracht nog onderzocht optimale staat lijken specifieke in vivo omstandigheden, zoals de normale stromale architectuur van verschillende organen of weefsels de ECM organisatie rond een tumor. Verschillen in resultaten door verschillende groepen met betrekking tot, bijvoorbeeld, kankercel vormen van migratie of het bestaan ​​van focale adhesies, hebben enige controverse 8 gegenereerd. Er is veel aandacht is onlangs gewijd aan een consensus in termen van ECM chemische aard, poriegrootte, vezeldikte en matrix stijfheid te bereiken. Veel verschillende soorten 3D ECM's worden tegenwoordig gebruikt, variërend van cel afgeleide matrices commercieel verkrijgbaar Matrigel, pepsinized runder collageen I of nonpepsinized rattenstaart collageen I. Elk van deze matrices heeft specifieke fysische en chemische eigenschappen en men moet echtete van de matrix keuze om het fysiologische proces onderzocht. Bovendien kan poriegrootte en vezeldikte afhankelijk polymerisatieomstandigheden, zoals pH en temperatuur 9,10. Binding aan en de afstand tot stijve substraten zoals glas, kan ook veranderen de elastische eigenschappen van de matrix 10,11.

Dit artikel beschrijft werkwijzen voor bereiding en 3D beeldvorming van kanker celculturen, hetzij als enkele cellen of sferoïden. Werkwijzen voor het maken kankercel sferoïden zijn eerder beschreven, de meest populaire zijn de opknoping neerzetten 12,13 en agarose-beklede plaat methode 14. Als een geschikt substraat voor ECM kankercelmigratie wordt nonpepsinized rattenstaart collageen I gepolymeriseerd bij kamertemperatuur gebruikt 2 mg / ml. Nonpepsinized zuur geëxtraheerde I collageen van rattenstaart worden zowel N-en C-eindstandige telopeptiden, nonhelical delen van het collageenmolecuul belast natieve collageen intermolecular verknoping en fibrilar stabiliteit 15. Samen vormen deze omstandigheden kan de vorming van collageen netwerken die het meest lijken op de waargenomen in vivo 10 Ones. Om visualisatie van de collageenvezels, zowel in vaste en levende culturen mogelijk te maken, wordt een gedetailleerd protocol voorzien om fluorescent label collageen in vitro 10 met 5 - (en-6)-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA), succinimidylester. Dit protocol werd aangepast van Baici et al.. 16,17, waarbij fluoresceïne isothiocyanaat wordt gebruikt om oplosbare collageen moleculen te labelen. Zoals fluoresceïne, TAMRA een amino-reactieve fluorescerende kleurstof die reageert met nonprotonated alifatische aminogroepen van eiwitten, zoals het vrije aminogroep aan de N-terminus en, nog belangrijker, de kant aminogroep van lysines. Deze reactie alleen optreedt bij basische pH, bij de lysine aminogroep in de nonprotonated vorm. Naast TAMRA zijn stabieler dan fluoresceïne viatijd, de emissie-spectra valt op de oranje / rode bereik (ex / em = 555/518 nm), die nuttig kan worden gecombineerd voor live cell imaging van GFP-gelabelde eiwitten. Gebruik oplosbare collageen gelabelde moleculen met amino-reactieve kleurstoffen laat de polymerisatiewerkwijze of de dichtheid, poriegrootte en verknoping status van de collageen matrix 10,16,18,19.

Dit protocol omvat ook een werkwijze voor 3D immunofluorescente labeling van endogene eiwitten, dat verder geoptimaliseerd om het etiket of het cytoskelet cytoskelet geassocieerde eiwitten. Het uiteindelijke doel van dit protocol is aan methoden om hoge-resolutie beelden van 3D-culturen met confocale microscopie met verminderde bijdrage uit stijve dekglaasjes op de collageenmatrix spanning te verwerven.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. TAMRA-collageen I Labeling

  1. Bereid een 10 mg / ml TAMRA door toevoeging van 2,5 ml DMSO de bijgeleverde 25 mg TAMRA poeder. Los het op door vortexen tot volledige oplossing. Bij -20 º C en beschermen tegen licht.
  2. Bereid 2 L van Labeling Buffer (0,25 M NaHCO3, 0,4 M NaCl). Breng de pH op 9,5 met 10 M NaOH-oplossing. Bewaren bij 4 º C. Vanaf dit punt, worden alle bewerkingen bij 4 º C uitgevoerd, tenzij anders aangegeven en fluorescerend materiaal wordt beschermd tegen licht met behulp van aluminiumfolie.
  3. Vul een 1 ml wegwerpspuit met 1 ml sterk geconcentreerde rattenstaart collageen I oplossing. Hoge concentratie collageen oplossingen worden typisch verschaft in concentraties ongeveer 10 mg / ml en zeer viskeus. Zorg ervoor dat het langzaam te manipuleren om de vorming van luchtbellen te voorkomen.
  4. Met behulp van een 21 G injectienaald, injecteer het collageen in een geweekt 3 ml dialyse cassette van 10.000 MWCO afgesneden. Wees voorzichtig om dama te vermijdenGing het membraan met de naald. Verwijder alle lucht uit de dialyse cassette door te trekken tot de spuit zuiger. Dialyze het 's nachts tegen 1 L van Labeling Buffer.
  5. Meng 100 ui 10 mg / ml oplossing TAMRA 900 ui Labeling Buffer. Opmerking: Dit moet gebeuren met zowel TAMRA oplossing en Labeling Buffer bij kamertemperatuur sinds DMSO bevriest bij 4 º C. Na het mengen, breng het verdunde TAMRA oplossing terug tot 4 º C.
  6. Verwijder het collageen voorzichtig uit de dialyse cassette met behulp van een 2 ml wegwerpspuit met een 21 G injectienaald. Voeg 1 ml van het gedialyseerde collageenoplossing met 1 ml verdunde TAMRA oplossing door pipetteren.
  7. Breng de collageen / TAMRA mengsel in een 2 ml microcentrifugebuis en incubeer overnacht met rotatie.
  8. Breng de 2 ml TAMRA-gelabeld collageen in een geweekt 3 ml dialyse cassette en dialyseren nachts tegen 1 L van Labeling Buffer om de overmaat aan vrije kleurstof te verwijderen.
  9. Om de TAMRA-lab te herstelleneLED collageen de oorspronkelijke collageen oplossing, plaats de dialyse cassette in 1 L van 0,2% (v / v) azijnzuur-oplossing, pH 4, en dialyseer gedurende de nacht.
  10. Meet het eindvolume van de TAMRA-gelabeld collageen en bereken de uiteindelijke concentratie, gezien het aanvankelijke volume en de concentratie van het collageen gebruikte oplossing. Bewaren bij 4 º C.

2. 3D TAMRA-collageen Matrices met Embedded Single Cellen

  1. Bereken het volume van 2 mg / ml collageen TAMRA-Mix voor de proef. Bereiden altijd 20% meer om rekening te houden pipetteren verliezen als gevolg van het collageen hoge viscositeit.
  2. Bereid een voorraad oplossing van 10x PBS en 1 N NaOH. Filter-steriliseren en te handhaven op 4 º C. Vanaf dit punt worden alle transacties uitgevoerd op ijs, tenzij anders vermeld en onder steriele omstandigheden.
  3. Meng 10x PBS en 1 N NaOH in voldoende hoeveelheden om de gewenste collageen concentratie en pH 7,4 te bereiken. Bijvoorbeeld, voor een eindvolume van 1 mlvan TAMRA-collageen Mix bij pH 7,4, combineer 100 pi 10x PBS met 5 pi 1N NaOH. Meng goed.
  4. Voeg de juiste hoeveelheid van beide TAMRA-gemerkte en ongemerkte collageen collageen in een 01:06 verhouding om een uiteindelijke totale collageen concentratie van 2 mg / ml te bereiken. Bijvoorbeeld, voor een eindvolume van 1 ml van 2 mg / ml collageen TAMRA-Mix, voeg 90,48 gl 3,68 mg / ml TAMRA-gemerkt collageen en 415,71 pl 4,01 mg / ml ongelabeld collageen. Meng goed en langzaam door pipetteren, het vermijden van de vorming van luchtbellen.
  5. Cellen gesuspendeerd in de juiste hoeveelheid gekoelde cel zonder FBS toevoegen TAMRA-collageen Mix tot een uiteindelijke celdichtheid van 10 5 cellen / ml en een uiteindelijke collageen concentratie van 2 mg / ml te verkrijgen. Bijvoorbeeld voor 1 ml 2 mg / ml collageen TAMRA-Mix, commentaar 388,81 pl medium dat 10 5 cellen. Meng goed en langzaam door pipetteren, het vermijden van de vorming van luchtbellen. Bevestig pH door het testen van 10 ul van het mengsel op een pH-test strip.
  6. Pipetteer 100 ul druppels TAMRA-collageen Mix op glazen bodem gerechten en laat het polymeriseren bij kamertemperatuur gedurende 30-45 minuten. 100 ul collageen druppels hebben een typische diameter van 7 mm en 2 mm hoog zijn. Toen gepolymeriseerd, het collageen verandert in een wit-ish gel. Opmerking: Het toestaan ​​van het collageen te polymeriseren zonder het sluiten van het gerecht zal voorkomen dat de vorming van een waterfilm rond de collageen neerzetten, het verminderen van onthechting van het glas. Om hechting te verhogen kunnen glazen schalen worden bekleed met poly-L-lysine bij 100 ug / ml.
  7. Voeg voorzichtig voldoende kweekmedium aan het collageen / cel druppels dekken. Vermijd hoge stromen van media of abrupte bewegingen sinds collageen druppels kunnen gemakkelijk los. Houd bij 37 º C in 10% CO 2 bevochtigde lucht voor voldoende tijd voor de cellen om te migreren in de matrix (meestal 1-3 dagen).

3. 3D TAMRA-collageen Matrices met Embedded Cell Sferoïden

  1. Bereken het volume van 2 mg / ml collageen TAMRA-Mix voor de proef. Bereiden altijd 20% meer om rekening te houden pipetteren verliezen als gevolg van het collageen hoge viscositeit.
  2. Bereid een voorraad oplossing van 10x PBS en 1 N NaOH. Filter-steriliseren en te handhaven op 4 º C. Vanaf dit punt worden alle transacties uitgevoerd op ijs, tenzij anders vermeld en onder steriele omstandigheden.
  3. Meng 10x PBS, 1 N NaOH en mobiele media zonder FBS in voldoende hoeveelheden om de gewenste collageen concentratie en pH 7,4 te bereiken. Bijvoorbeeld, voor een eindvolume van 1 ml TAMRA-collageen Mix bij pH 7,4, combineer 100 pi 10x PBS, 5 ui 1 N NaOH en 388,81 pl media. Meng goed.
  4. Voeg de juiste hoeveelheid van beide TAMRA-gemerkte en ongemerkte collageen collageen in een 01:06 verhouding om een uiteindelijke totale collageen concentratie van 2 mg / ml te bereiken. Bijvoorbeeld, voor een eindvolume van 1 ml van 2 mg / ml collageen TAMRA-Mix, voeg 90,48 gl 3,68 mg / ml TAMRA-gemerkt collageen en 415,71 pl 4,01 mg / ml unlaBeled collageen. Meng goed en langzaam door pipetteren, het vermijden van de vorming van luchtbellen. Bevestig pH door het testen van 10 ul van het mengsel op een pH teststrip.
  5. Pipetteer 100 ul druppels TAMRA-Collageen Mix op glazen bodem gerechten en laat het polymerisatie te initiëren voor 2-5 minuten. Dit zal helpen om zinken van de bolletjes te voorkomen door lichte verhoging van de gel viscositeit. 100 ul collageen druppels hebben een typische diameter van 7 mm en 2 mm hoog zijn.
  6. Verzamel een cel spheroïde en plaats deze op een schone petrischaal. Overtollige vloeistof en resuspendeer in 10 pl TAMRA-collageen Mix. Dit is belangrijk om verdunning van het collageen met celmedium voorkomen.
  7. Met behulp van een P20 pipet, het verzamelen van de collageen zwevende bolvormige en plaats het op het midden boven op de 100 pi TAMRA-Collagen Mix neerzetten. Opmerking: Plaats niet meer dan een afgeplatte bol per collageen neerzetten, omdat ze elkaar capaciteit om binnen te dringen en / of te migreren kunnen beïnvloeden.
  8. Laat de TAMRA-Collageen Mix aan polyMerize bij kamertemperatuur gedurende 30-45 minuten. Toen gepolymeriseerd, het collageen verandert in een wit-ish gel. Opmerking: Het toestaan ​​van het collageen te polymeriseren zonder het sluiten van het gerecht zal voorkomen dat de vorming van een waterfilm rond de collageen neerzetten, het verminderen van onthechting van het glas. Om hechting te verhogen kunnen glazen schalen worden bekleed met poly-L-lysine bij 100 ug / ml.
  9. Voeg voorzichtig voldoende kweekmedium aan het collageen / bolvormige druppels dekken. Vermijd hoge stromen van media of abrupte bewegingen sinds collageen druppels kunnen gemakkelijk los.
  10. Houd bij 37 º C in 10% CO 2 bevochtigde lucht voor voldoende tijd voor de cellen binnen te vallen / migreren in de matrix (meestal 1-3 dagen).

4. 3D immunofluorescentiekleuring

  1. Verwijder voorzichtig de cel media en spoel het collageen matrices bevattende cellen / spheroids met PBS.
  2. Gelijktijdig oplossen en extraheren cellen door incubatie met afzuiging / fixatie buffer (4% PFA, 0,3% Triton X-100, 5% sucrose in PBS) gedurende 5 minuten. Vul het buffer met 2 uM Phalloidin en 2 uM Taxol voor visualisatie van cytoskelet of cytoskelet geassocieerde eiwitten.
  3. Verder fix cellen met 4% PFA, 5% sucrose in PBS gedurende 30 minuten. Spoelen met 0,05% Tween-20 in PBS.
  4. Bereid primaire antilichamen oplossingen in PBS. Incubeer cellen met primaire antilichamen gedurende ten minste 1 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C. Zorg ervoor dat u voldoende oplossing voor de gehele collageen daling dekken voegen. Voor een 35 mm glazen onderste schaal wordt 1,5-2 ml oplossing nodig. Opmerking: Als u het volume antilichaam oplossing te verminderen, kan een in water oplosbare barrière, zoals een cirkel lijn van siliconenvet of een PDMS ring, rond de collageen daling worden geplaatst.
  5. Was 3x 30 min met 0,05% Tween-20 in PBS.
  6. Bereid Alexa-geconjugeerde secundaire antilichamen, Alexa-geconjugeerde phalloidin en DAPI oplossingen in PBS. Incubeer de cellen met geschikte secundaire antilichamen gedurende 2 uur bij kamertemperatuur geroerd.
  7. Wassen 3x 30 min met 0,05% Tween-20 in PBS.
  8. Verwijder de overmaat vloeistof, voeg genoeg montage media om de glazen bodem schaal bodem (ongeveer 500 pl) invullen en een 24 mm dekglaasje op de top te dichten. Druk niet het dekglaasje om te voorkomen dat het comprimeren van de collageen drop en beschadiging van de 3D-organisatie.

5. Monster Imaging

Klassiek of draaiende schijf confocale microscopen kunnen worden gebruikt. Een omgekeerde systeem moet bij voorkeur worden gebruikt om de afstand van het afgebeelde cellen van de glazen bodem bepalen. Het wordt gebruikt voor dit werk is een omgekeerde confocale draaiende schijf met een 40X/1.3NA en 60X/1.4NA olie-immersie doelstellingen (werkafstanden 200 urn en 130 urn, respectievelijk), een Photometrics CoolSNAP HQ2 camera, 1392 x 1040 imaging array, 6.45 x 6.45 micrometer pixels en gecontroleerd door Metamorph imaging software. 405 nm, 491 nm, 561 nm en 633 nm lasers worden doorgaans gebruikt bij 30-50% vermogen, krijgen 1 en binning van 2x 2 tot belichtingstijden verminderen. De microscoop is ook uitgerust met een Hg-lamp en filter blokjes voor DAPI (exc 400-418 nm; em 450-465), FITC (exc 478-495; em 510-555) en Texas Red (exc 560-580; em 600 -650) te gebruiken met het oog stuk.

  1. Met de fluorescentielamp, plaats de 40X objectief in het midden van de collageen vallen. Een overzicht van het monster, zowel in het xy-as en de z-as. Zorg ervoor dat niet meer dan 100 micrometer afwijken van de gel rand aan de xy-as bij de verwerving van de afbeeldingen om randeffecten te vermijden. Bij beeldvorming sferoïden, zorg ervoor dat ze onder de doelstelling werkafstand. Wijzig doelstelling indien nodig.
  2. Schakel over naar de confocale live-imaging-modus. Met de 561 nm laser de TAMRA-gemerkt collageen zichtbaar vanaf de glazen bodem bepalen de z-waarde waarbij collageenvezels beginnen te verschijnen. Dit is het substraat bodem en z = 0.
  3. Met behulp van de focus knop, omhoog gaan 100 micrometer van z = 0. Slechts cellen bij z = 100 urnof hoger moet worden afgebeeld om spanning effecten van de stijve glazen bodem voorkomen.
  4. Selecteer de cellen om imago. Optimaliseren camera belichtingstijden en laservermogen voor elke golflengte. Typische belichtingstijden voor DAPI en Alexa-488 Phalloidin zijn tussen 100-200 msec. Belichtingstijden voor antilichaamkleuring kan variëren.
  5. Op confocale live-modus met behulp van de juiste laser om de phalloidin vlekken en het gebruik van de focusknop visualiseren, definiëren de z-interval door boven-en onderkant z-waarden voor stroom.
  6. Definieer de z-stapgrootte. Voor 40X doelstellingen, gebruik dan 1 micrometer. Voor 60X, gebruik 0.5 micrometer. Start acquisitie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Labeling rat-tail collageen I met TAMRA maakt een eenvoudige opstelling en visualisatie van 3D collageen netwerken. Slow polymerisatie bij kamertemperatuur resulteert in de vorming van collageen netwerken met vergelijkbare organisatie die voorkomen in vivo 10.

Hier presenteren we een protocol voor immunofluorescentie kleuring van het cytoskelet van CT26 kankercellen, zowel sferoïden en als enkele cellen. Om het cytoskelet beter te bewaren, worden buffers aangevuld met ongelabelde phalloidin en taxol, geneesmiddelen waarvan bekend is dat F-actine en microtubuli stabiliseren, respectievelijk. Daarnaast worden cellen gelijktijdig gefixeerd en uitgepakt nonpolymerized cytosolische tubuline pools die kunnen interfereren met de weergave van individuele microtubules verwijderen. Deze techniek kan ook worden gebruikt om cytoskelet-geassocieerde eiwitten te visualiseren. Wanneer in 3D, CT26 cellen presenteren typische mesenchymale morfologie gekenmerkt door een langwerpigcellichaam, gestort met F-actine rijke cellulaire uitsteeksels die filopodia en lamellipodia (figuren 1 en 2) lijken. Dit langwerpige morfologie is nog duidelijker in cellen proberen cellulaire sferoïden ontsnappen door invasie van de extracellulaire matrix (figuur 2). Kleuring van microtubuli met een anti-tubuline antilichaam vertoont een goed bewaard gebleven en georganiseerd netwerk van microtubuli (figuren 1 en 2). Deze cel vorm sterk verschilt van de ene van CT26 cellen in 2D substraten, waar ze hebben meestal meerdere toonaangevende randen met grote brede platte lamellipodia en goed gedefinieerde filopodia 10.

Om de verkregen beelden in dit werk te verwerken, werd Imaris gebruikt. Deze software converteert automatisch de verworven grote z-stacks in een 3D-projectie van eenvoudige navigatie en visualisatie in alle vlakken (xy, xz en yz) en verschillende hoeken (figuren 1, 2 en 3, orthogonal bekeken). Met de functie "Crop 3D", kan onnodige z gebieden boven of onder het gebied van interesse worden verwijderd. Zoals weergegeven in figuur 3, is het cruciaal om verzameld z stacks analyseren van alle vlakken van om een gelijkmatige verdeling van de 3D-cellen te waarborgen. In dit geval, CT26 cellen gekweekt als sferoïden lijken een 3D collageenmatrix uitgebreid binnendringen wanneer gevisualiseerd als een maximale xy projectie. Echter, een xz mening blijkt dat alle cellen zijn invasie een beperkt z-interval vergeleken met de bolvormige volume, hetgeen wijst op een preferentiële regio invasie. Dit sferoïde eigenlijk te dicht bij de glazen bodem van de schaal en cellen bewogen snel naar en van het stijve substraat 2D.

Figuur 1
Figuur 1. Cytoskelet van CT26 cellen kankercellen ingebed in TAMRA gelabeld collageen I. Colop adenocarcinoom CT26 cellen werden ingebed als enkele cellen in 2 mg / ml TAMRA-gemerkt collageen I (rood). Immunofluorescentie beelden van culturen gekleurd met een tubuline antilichaam tegen label microtubuli (blauw), Alexa-488 phalloidin aan F-actine (groen) en DAPI voor nucleaire kleuring (cyaan) te visualiseren. 3D-beeld komt overeen met xy maximale projectie van z-stacks van 38 micrometer. Orthogonale xz (onderkant van Merge) en yz (rechts van Merge) fuseren uitzicht. Schaal bar, 20 micrometer. Klik hier voor grotere afbeelding .

Figuur 2
Figuur 2. Cytoskelet van CT26 cellen kankercellen invasie TAMRA gelabeld collageen I. CT26 cellen gekweekt als cellulaire sferoïden werden ingebed in 2 mg / ml TAMRA-gemerkt collageen I (rood). Na 2 dagen in kweek, cellen begonnenvading het collageen 3D-matrix, af te stappen van de cel spheroïde. Immunofluorescentie beelden van culturen gekleurd met een tubuline antilichaam tegen label microtubuli (blauw), Alexa-488 phalloidin aan F-actine (groen) en DAPI voor nucleaire kleuring (cyaan) te visualiseren. 3D-beeld komt overeen met xy maximale projectie van z-stacks van 66 micrometer. Orthogonale xz (onderkant van Merge) en yz (rechts van Merge) fuseren uitzicht. Schaal bar, 50 micrometer. Klik hier voor grotere afbeelding .

Figuur 3
Figuur 3. CT26 cellen invasie in collageen I is afhankelijk van de glazen afstand. CT26 cellen werden gekweekt zoals cellulaire sferoïden en ingebed in 2 mg / ml collageen I. Na 2 dagen in kweek, cellen significant afgestapt van de cel sferoïde niet door invasie tHij 3D collageenmatrix maar door kruipen op de 2D stijve glas. Fluorescentiebeelden van culturen gekleurd met Alexa-488 falloïdine aan F-actine te visualiseren. A) 3D beeld overeen met xy maximale projectie van z-stapels 200 urn. B) Orthogonal xz view. Schaal bar, 150 micrometer. Klik hier voor grotere afbeelding .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Het protocol hier beschreven fluorescent labelen collageen I met TAMRA een uitstekende methode om eenvoudige visualisatie van het collageennetwerk organisatie mogelijk, met een standaard confocale microscoop met een 561 nm laser. Een voordeel van deze techniek in vergelijking met reflectie confocale microscopie is de mogelijkheid om beeld collageenvezels dieper in de 3D-matrix. De intensiteit en het contrast van de vezels reflectie aanzienlijk verminderen, met diepte te wijten aan laserlicht absorptie en verstrooiing. Ook kan de oriëntatie van de collageenvezels een grote handicap bij het gebruik reflectiecoëfficiënt confocale microscopie, aangezien vezels uitgelijnd ongeveer 50 graden vanaf het beeldvlak zijn volledig onopgemerkt. Fluorescent gelabelde vezels worden gedetecteerd met gelijke lichtsterkte, onafhankelijk van hun oriëntatie 20. Een andere methode die in toenemende mate gebruikt om collageenbundels, zowel in vitro als in vivo zichtbaar is door de tweede harmonische generatieking (SHG). Dit proces is gebaseerd op de emissie van SHG signaal noncentrosymmetric structuren, zoals collageen 21. Echter, SHG vereist een multiphoton microscoop, die geen deel uitmaakt van de standaard lab beeldapparatuur.

Het gebruik van TAMRA een fluorofoor is niet exclusief. Andere fluoroforen, zoals Cy2, Cy5 of Alexa Fluor familie, commercieel verkrijgbaar in eiwitmarkerend kits kunnen worden gebruikt om het etiket collageen in de meest geschikte kleur voor de gebruiker. Een ander voordeel van het gebruik van fluorescente collageen is de mogelijkheid om te combineren met cellen getransfecteerd met fluorescent-gemerkte eiwitten voor time-lapse imaging, tot cel-matrix interacties en cel-matrix geïnduceerde vervormingen voet volgen. Het kan ook worden gebruikt voor dunne collageenbekleding dekglaasjes in 2D experimenten.

Inbedding in 3D te matrices is een delicate procedure, met name bij gebruik van grote sferoïden, omdat ze de neiging te dalen als gevolg van zwaartekracht. Ook,cellen meestal aangetrokken stijver omgevingen en bij ingebed in gebieden van de 3D-matrix dicht genoeg bij de glazen dekglaasje de verhoging van spanning geïnduceerd door de glazen voelen bewegen ze naar het stijve substraat 2D. Een technische truc om zinken van grote bolvormige deeltjes te voorkomen is om de collageen kort voordat de bolvormige bovenop de matrix druppel polymeriseren (2-5 min). Dit lichte stijging van de viscositeit van de gel, waardoor de zinktijd. Toch is het een goede gewoonte om voor te bereiden meerdere herhalingen om de kans op succes te vergroten. Anderzijds, is het belangrijk om de cellen onder de doelstelling werkafstand houden. Lagere vergrotingsobjectieven meestal grotere afstanden werken en kan worden gebruikt voor algemene veldbeelden bijvoorbeeld vergelijken invasie van verschillende celtypen een sferoïde. Bij een hogere resolutie beelden zijn nodig, onderdompeling in water doelstellingen, met grotere werkafstanden, zijn sterk aanbevolen.

10 label. We doen geen poging om een ​​algemene 3D immuunkleuring protocol te creëren. Zoals in 2D, kan elk antilichaam verschillende fixatieprocedure en ontwerp van een specifiek protocol voor elk antilichaam kan worden vereist vereisend. Dit protocol wordt gepresenteerd als uitgangspunt, en gesuggereerd wordt dat gebruikers onder een fluorescerende kleuring phalloidin om een ​​idee van de celvorm en lokalisatie in de matrix verschaffen.

Dikke collageen matrices zijn een goede vereenvoudigd in vitro systeem om celmigratie studeren in een fysiologische ECM. Hoewel het niet de chemische en fysische complexiteit van een levend weefsel, dit systeem manipulatie van specifieke ECM eigenschappen, zoals poriegrootte, elasticiteit en verknoping. We hopen deze protocollen zal bijdragen tot een betere beschrijving van de moleculaire samenstelling, lokalisatie en functies van cellulaire structuren jarenlang geanalyseerd 2D en onze kennis van celgedrag in 3D te verbeteren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.

Acknowledgments

De auteurs zijn zeer erkentelijk voor Dr Vasily Gurchenkov (Institut Curie) voor het verwerven en verwerken in figuur 3 en PICT-IBISA Imaging Facility (Instituut Curie). Dit werk werd ondersteund door de ANR-09-JCJC0023-01, ARC SFI20111203863 en PIC 3D - Complex in vitro cellulaire modellen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
TAMRA, SE Invitrogen C-1171  
Rat tail Collagen High Concentration BD Biosciences 354249  
Rat tail Collagen BD Biosciences 354236  
Phalloidin Sigma P2141  
Taxol (Paxitel) Sigma T7402  
Mouse anti-alpha Tubulin antibody Sigma T9026  
Alexa 488 Phalloidin Invitrogen A12379  
Alexa 633 Goat anti-Mouse antibody Invitrogen A21052  
DAPI Invitrogen D1306  
Mounting media Fisher Scientific 106 226 89  
Dialysis Cassette Pierce 66380  
Glass bottom dishes World Precision Instruments FD35-100  
MetaMorph Microscopy Automation & Image Analysis Software Molecular Devices  
Imaris 7.2.3 Bitplane  

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schiro, J. A., Chan, B. M., et al. Integrin alpha 2 beta 1 (VLA-2) mediates reorganization and contraction of collagen matrices by human cells. Cell. 67 (2), 403-410 (1991).
  2. Klein, C. E., Dressel, D., et al. Integrin alpha 2 beta 1 is upregulated in fibroblasts and highly aggressive melanoma cells in three-dimensional collagen lattices and mediates the reorganization of collagen I fibrils. J. Cell Biol. 115 (5), 1427-1436 (1991).
  3. Friedl, P., Maaser, K., Klein, C. E., Niggemann, B., Krohne, G., Zänker, K. S. Migration of highly aggressive MV3 melanoma cells in 3-dimensional collagen lattices results in local matrix reorganization and shedding of alpha2 and beta1 integrins and CD44. Cancer Res. 57 (10), 2061-2070 (1997).
  4. Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: the role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nat. Rev. Cancer. 11 (7), 512-522 (2011).
  5. Zaman, M. H., Trapani, L. M., et al. Migration of tumor cells in 3D matrices is governed by matrix stiffness along with cell-matrix adhesion and proteolysis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (29), 10889-10894 (2006).
  6. Doyle, A. D., Wang, F. W., Matsumoto, K., Yamada, K. M. One-dimensional topography underlies three-dimensional fibrillar cell migration. J. Cell Biol. 184 (4), 481-490 (2009).
  7. Fraley, S. I., Feng, Y., et al. A distinctive role for focal adhesion proteins in three-dimensional cell motility. Nat. Cell Biol. 12 (6), 598-604 (2010).
  8. Harunaga, J. S., Yamada, K. M. Cell-matrix adhesions in 3D. Matrix Biol. 30 (7-8), 363-368 (2011).
  9. Raub, C. B., Suresh, V., et al. Noninvasive assessment of collagen gel microstructure and mechanics using multiphoton microscopy. Biophys. J. 92 (6), 2212-2222 (2007).
  10. Geraldo, S., Simon, A., Elkhatib, N., Louvard, D., Fetler, L., Vignjevic, D. M. Do cancer cells have distinct adhesions in 3D collagen matrices and in vivo? Eur. J. Cell Biol. 91 (11-12), 930-937 (2012).
  11. Geraldo, S., Gordon-Weeks, P. R. Cytoskeletal dynamics in growth-cone steering. J. Cell Sci. 122 (Pt 20), 3595-3604 (2009).
  12. Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types. Biotechnol. Bioeng. 83 (2), 173-180 (2003).
  13. Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. J. Vis. Exp. (51), (2011).
  14. Haji-Karim, M., Carlsson, J. Proliferation and viability in cellular spheroids of human origin. Cancer Res. 38 (5), 1457-1464 (1978).
  15. Eyre, D. R., Paz, M. A., Gallop, P. M. Cross-linking in collagen and elastin. Ann. Rev. Biochem. 53, 717-748 (1984).
  16. Baici, A., Cohen, G., Fehr, K., Böni, A. A handy assay for collagenase using reconstituted fluorescein-labeled collagen fibrils. Anal. Biochem. 108 (2), 230-232 (1980).
  17. Stein, A. M., Vader, D. A., Jawerth, L. M., Weitz, D. A., Sander, L. M. An algorithm for extracting the network geometry of three-dimensional collagen gels. J. Microsc. 232 (3), 463-475 (2008).
  18. Sabeh, F., Ota, I., et al. Tumor cell traffic through the extracellular matrix is controlled by the membrane-anchored collagenase MT1-MMP. J. Cell Biol. 167 (4), 769-781 (2004).
  19. Artym, V. V., Matsumoto, K. Imaging cells in three-dimensional collagen matrix. Curr. Prot. Cell Biol. Chapter 10, Unit 10.18.1-Unit 10.18.20 (2010).
  20. Jawerth, L. M., Münster, S., Vader, D. A., Fabry, B., Weitz, D. A. A blind spot in confocal reflection microscopy: the dependence of fiber brightness on fiber orientation in imaging biopolymer networks. Biophys. J. 98 (3), L1-L3 (2010).
  21. Cicchi, R., Vogler, N., Kapsokalyvas, D., Dietzek, B., Popp, J., Pavone, F. S. From molecular structure to tissue architecture: collagen organization probed by SHG microscopy. J. Biophotonics. 6 (2), 129-142 (2013).

Tags

Geneeskunde TAMRA collageen 3D-matrix bolletjes F-actine microtubuli
Het openbaren van de organisatie van het cytoskelet van invasieve kankercellen in 3D
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Geraldo, S., Simon, A., Vignjevic,… More

Geraldo, S., Simon, A., Vignjevic, D. M. Revealing the Cytoskeletal Organization of Invasive Cancer Cells in 3D. J. Vis. Exp. (80), e50763, doi:10.3791/50763 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter